i LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi đã được sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của quý thầy cô, các anh chị và các bạn. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới: Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang. Ban lãnh đạo Phân Viện thú y Miền Trung đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, như liên hệ nơi thực tập, hỗ trợ cơ sở vật chất, trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành công việc tốt nhất. Đặc biệt tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành tới TS. Vũ Khắc Hùng và TS. Nguyễn Văn Duy, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Xin gởi lời cảm ơn tới BS. Đỗ Văn Tấn và CN. Đào Hoài Thu, cùng tất cả các thầy cô giáo trong viện công nghệ sinh học. Các cô chú, anh chị tại Phân Viện thú y Miền Trung đã hết lòng dạy bảo, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình tìm tòi, học hỏi để hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Xin gởi lời biết ơn tới bố mẹ, anh chị em và bạn bè tôi, đã luôn ở bên động viên và giúp đỡ tôi rất nhiều trong học tập và cuộc sống. Nha Trang, Ngày 2 tháng 7 năm 2012 SV. Đoàn Thị Thu Dung ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Đại cương về vi khuẩn S. choleraesuis Smith 4 1.1.1. Phân loại khoa học của S. choleraesuis 4 1.1.2. Đặc điểm hình thái 4 1.1.3. Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa 5 1.1.4. Sức đề kháng 7 1.1.5. Cấu trúc kháng nguyên 7 1.1.6. Tính gây bệnh 10 1.2. Bệnh Phó thương hàn 10 1.2.1. Đặc điểm và nguyên nhân gây bệnh 10 1.2.2. Cơ chế sinh bệnh 11 1.2.3. Triệu chứng 11 1.2.4. Bệnh tích 11 1.2.5. Phòng bệnh 12 1.2.6. Điều trị 13 1.3. Tình hình nghiên cứu về tạo chủng S. choleraesuis đột biến gen 13 iii 1.4. Gen asd 17 1.5. Vector 18 1.5.1. Khái niệm 18 1.5.2. Các đặc điểm chính của vector 19 1.5.3. Các bước trong tạo DNA tái tổ hợp 20 1.6. Plasmid dùng trong kỹ thuật tạo dòng 20 1.6.1. Plasmid pBluescript II SK(+) (pBSIIK+) 21 1.6.2. Plasmid pRE112 23 1.7. Tế bào chủ để khuếch đại gen 24 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 25 2.2. Vật liệu dùng cho nghiên cứu 25 2.2.1. Các chủng vi sinh vật 25 2.2.2. Hóa chất và môi trường 25 2.2.3. Thiết bị chuyên dụng 28 2.3. Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng 28 2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số 28 2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA plasmid 29 2.3.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR sau điện di 30 2.3.4. Phương pháp PCR 31 2.3.5. Phương pháp biến nạp của Kang và cs 36 2.3.6. Phương pháp tạo tế bào E. coli χ7213 khả biến 37 2.3.7. Phương pháp tiếp hợp của Kang và cs 38 2.3.8. Phương pháp lên men các loại đường 39 2.3.9. Phương pháp kiểm tra tính ổn định của gen asd đột biến 39 2.3.10. Bố trí thí nghiệm 39 iv Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1. Khuếch đại đoạn gen Pa12, Pa34 41 3.2. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK(+)/Δasd 42 3.3. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pRE112/Δasd 44 3.4. Tạo chủng S. choleraesuis mang gen asd đột biến 46 3.5. Sàng lọc dòng tế bào S. choleraesuis mang gen asd đột biến 48 3.6. Kiểm tra các đặc tính của chủng S. choleraesuis/Δasd 49 3.6.1. Tốc độ sinh trưởng của S. choleraesuis/Δasd 49 3.6.2. Khả năng lên men đường của S. choleraesuis /Δasd 50 3.6.3. Kết quả kiểm tra tính ổn định của chủng đột biến 51 3.6.4. Giải trình tự gen asd của S. choleraesuis/Δasd 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Kí hiệu Tên đầy đủ 1 asd Aspartate β-semialdehyde dehydrogenase 2 bp Base pair 3 CIP Calf alkaline phosphatase 4 Cm Chloramphenicol 5 Cm r Gen kháng kháng sinh Chloramphenicol 6 CIRAD Centre de coopération Iternationale en Recherche agronomique pour le Dévelopment (French Agricultural Research Centre for International Development) 7 DAP DL-α, ε- Diaminopimelic acid 8 DNA Deoxyribonucleic acid 9 E. coli Escherichia coli 10 F Forward 11 Kb Kilobase 12 Km Kanamycin vi 13 LB Luria Bertani 14 NA Nutrient agar 15 NB Nutrient broth 16 PBS Phosphate buffer saline 17 PCR Polymeration Chain Reaction 18 R Reverse 19 S. choleraesuis Salmonella choleraesuis 20 TBE Tris- Borate- EDTA 21 Δasd Gen asd bị đột biến vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng thống kê tình hình nhiễm bệnh do Salmonella gây ra 2 Bảng 1.1. Các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn S. choleraesuis 5 Bảng 1.2. Tính trạng chủ yếu của các loài, loài phụ và đa dạng sinh học của Salmonella 6 Bảng 1.3. Sức đề kháng của S. choleraesuis 7 Bảng 1.4. Các dạng huyết thanh chủ yếu và tính gây bệnh của Salmonella 9 Bảng 1.5. Các nhóm plasmid chính và đặc điểm 21 Bảng 2.6. Các plasmid dùng trong nghiên cứu 25 Bảng 2.7. Các bộ kit được dùng trong nghiên cứu 26 Bảng 2.8. Các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR 26 Bảng 2.9. Các enzyme cắt giới hạn 27 Bảng 2.10. Thành phần các môi trường nuôi cấy 27 Bảng 2.11. Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR (nhân gen asd) 31 Bảng 2.12. Bảng chu trình nhiệt (nhân gen asd) 31 Bảng 2.13. Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR (kiểm tra tạo dòng plasmid).32 Bảng 2.14. Bảng chu trình nhiệt (kiểm tra tạo dòng plasmid) 32 Bảng 2.15. Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR (kiểm tra gây đột biến) 33 Bảng 2.16. Bảng chu trình nhiệt (kiểm tra gây đột biến) 33 Bảng 2.17. Thành phần cho một mẫu phản ứng colony PCR 34 Bảng 2.18. Bảng chu trình nhiệt cho phản ứng Colony 34 viii Bảng 2.19. Thành phần phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn 35 Bảng 2.20. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng enzyme giới hạn 35 Bảng 2.21. Thành phần phản ứng lai 36 Bảng 2.22. Nguyên vật liệu dùng trong phương pháp biến nạp của Kang và cs 36 Bảng 2.23. Nguyên vật liệu trong phương pháp tạo tế bào E. coli χ7213 khả biến .37 Bảng 2.24. Nguyên vật liệu của phương pháp tiếp hợp 38 Bảng 3.25. Tốc độ sinh trưởng của 2 chủng S. choleraesuis và 49 S. choleraesuis/Δasd 49 Bảng 3.26. Khả năng lên men đường của S. choleraesuis  S. cholersesuis/Δasd 51 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Đặc điểm hình thái vi khuẩn S. choleraesuis chủng Smith 4 Hình 1.2. Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn S. choleraesuis chủng Smith 57 Hình 1.3. Các kháng nguyên bề mặt của Salmonella 8 Hình 1.4. Sơ đồ con đường xâm nhập gây bệnh của S. choleraesuis 11 Hình 1.5. Vector nhân lên trong tế bào nhận 18 Hình 1.6. Cấu trúc của vector 19 Hình 1.7. Các bước tạo DNA tái tổ hợp 20 Hình 1.8. Plasmid pBluescrip II SK (+) 22 Hình 1.9. Plasmid pRE112 23 Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 40 Hình 3.11. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen Pa12, Pa34 42 Hình 3.12. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt 2 dòng chọn lọc vector tái tổ hợp pBSIIK(+)/Pa12 43 Hình 3.13. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt 6 dòng chọn lọc vector tái tổ hợp pBSIIK(+)/Δasd 44 Hình 3.14. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt pBSIIK(+)/Δasd 45 Hình 3.15. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt của 3 dòng chọn lọc vector tái tổ hợp pRE112/Δasd 46 Hình 3.16. Khuẩn lạc S. choleraesuis sau khi tiếp hợp với E. coli χ7213/pRE112/Δasd 47 Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ hệ gen của chủng x S. choleraesuis với cặp mồi Pa5F-Pa6R (A) và Pa6R-Pa7F (B) 48 Hình 3.18. Khuẩn lạc vi khuuẩn S. choleraesuis Smith và S. choleraesuis/Δasd 57 Hình 3.19. Đường cong sinh trưởng của S. choleraesuis Smith và S. choleraesuis/Δasd 50 Hình 3.20. Khả năng lên men đường của S. choleraesuis /Δasd 58 Hình 3.21. Khả năng lên men đường của S. choleraesuis Smith 59 Hình 3.22. Sản phẩm PCR từ hệ gen của S. choleraesuis Smith và S.cholereasuis/Δasd các đời 1, 5, 10, 15, 20 với cặp mồi Pa5F - Pa6R (trắng) và Pa7F - Pa6R (đỏ) 52 Hình 3.23. So sánh trình tự gen Δasd của S. choleraesuis với asd của S. choleraesuis Smith 55 [...]... sớm và tìm ra hướng phòng, trị bệnh có hiệu quả luôn là những việc làm cấp thiết 3 Xuất phát từ thực tiễn nghiên cứu và yêu cầu của sản xuất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu "Tạo chủng và xác định đặc tính sinh hóa của Salmonella choleraesuis Smith đột biến gen asd đây là một nhánh nhỏ trong đề tài cấp nhà nước Mục tiêu nghiên cứu  Tạo chủng S choleraesuis đột biến gen asd bằng cách gây đột biến. .. để tạo dòng, pBSIIK(+) mang đoạn gen asd của chủng S choleraesuis Smith nhằm tạo ra và nhân gen asd đột biến 1.6.2 Plasmid pRE112 Để gen asd đã bị đột biến sau khi đưa vào S choleraesuis có thể thực hiện quá trình thay thế gen asd của hệ gen trong tế bào, thì nó cần phải được đưa vào một plasmid tự hủy (sucide plasmid) Đây là plasmid chỉ có thế được nhân lên trong các tế bào E coli mang gen pir sinh. .. hợp với chủng C500, Chủng có gen crp đã bị gây đột biến thành công thì được chọn lọc vì không có khả năng kháng sucrose Sau đó xác định lại bằng phương pháp PCR Tiếp theo gen asd (β- aspartic semialdehyde dehydrogenase) tiếp tục bị loại bỏ bằng phương pháp tương tự DAP phải được cung cấp cho sự phát triển của chủng bị đột biến gen crp và asd Tính kháng kháng nguyên, phát triển các đặc tính và tính độc... triển các đặc tính và tính độc ở chuột của gen crp đột biến là đặc trưng Chủng đột biến 2 gen crp và asd có thể được sử dụng như là vector sống và phát triển thành các loại vacxin uống tiềm năng [21] Năm 2009, Shi- Zhong Geng và cộng sự đã thành công với việc cải tiến phương pháp gây đột biến gen asd trên Salmonella enterica Serovar Pullorum (SP) Loại bỏ gen asd từ SP sử dụng phương pháp cải tiến bằng... gây đột biến gen asd 4 Kiểm tra kết quả gây đột biến gen asd bằng phản ứng PCR, giải trình tự 5 Kiểm tra đặc tính sinh hóa của chủng S choleraesuis nhược độc mang gen asd bị đột biến 4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương về vi khuẩn S choleraesuis Smith Salmonella do Daniel E Salmon (1850 - 1914) phát hiện ra vào năm 1885 Năm 1880, Grafhy mô tả hình ảnh vi khuẩn quan sát được trên tiêu bản và. .. Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của S choleraesuis mang gen asd bị đột biến  Mở rộng ứng dụng chủng vi khuẩn này làm chủng vacxin tái tổ hợp mang plasmid đã được dòng hóa các kháng nguyên ngoại lai (ví dụ kháng nguyên F18ab, Stx2e của vi khuẩn E coli) Nội dung nghiên cứu 1 Tạo dòng plasmid pRE112/ asd 2 Kiểm tra kết quả tạo dòng plasmid pRE112/ asd 3 Chuyển nạp plasmid pRE112/ asd vào chủng S choleraesuis... Branger và cộng sự (2009) đã chứng minh được sự ổn định của plasmid tái tổ hợp trong tế bào chủ sau 70 lần cấy truyền Năm 2006 Xu Yin- Di và cộng sự đã có nghiên cứu về cấu trúc và đặc tính của chủng S choleraesuis C500 mang gen crp và asd đột biến Đầu tiên thì sự tái tổ hợp vector tự giết với đoạn gen crp đã loại bỏ được 320bp (cAMP receptor protein) và gen sacB (sucrose- sensitive gen) được xây dựng và. .. tổ hợp tự giết (π- suicide) và hệ thống đỏ tự phá hủy (Red Disruption systems) Gen 17 asd được loại bỏ đặc hiệu bằng vector tái tổ hợp tự giết, gen asd được thay thế bằng gen kháng kháng sinh (Cmr) dựa trên hệ thống vector chủ được cân bằng gây chết Kháng huyết thanh (phenotype) của loài SP bị đột biến gen asd được xác định lại Việc cải tiến phương pháp này đơn giản hơn và hiệu quả hơn các phương pháp... mutans [8] Do đó, sử dụng đột biến gen asd như một điểm lựa chọn vị trí đánh dấu kháng kháng sinh [9] Vì vậy, chúng tôi nghiên cứu tạo ra chủng S choleraesuis nhược độc mang gen asd đột biến làm chủng vi khuẩn biến nạp 18 1.5 Vector 1.5.1 Khái niệm Vector là các đoạn DNA có kích thước nhỏ cho phép cài (gắn) các đoạn DNA cần thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào, tồn tại... kháng nguyên bề mặt của Salmonella (Nguồn: Diffchamb, 1997) 9 Bảng 1.4 Các dạng huyết thanh chủ yếu và tính gây bệnh của Salmonella [5] 10 1.1.6 Tính gây bệnh Trong tự nhiên vi khuẩn có thể theo thức ăn, nước uống vào đường tiêu hóa của lợn Bình thường, chúng có thể sống trong đường tiêu hóa mà không gây bệnh, khi sức đề kháng của con vật giảm sút, vi khuẩn xâm nhập vào máu, nội tạng và gây bệnh Sự giảm . thực tiễn nghiên cứu và yêu cầu của sản xuất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu " ;Tạo chủng và xác định đặc tính sinh hóa của Salmonella choleraesuis Smith đột biến gen asd đây là một nhánh.  Tạo chủng S. choleraesuis đột biến gen asd bằng cách gây đột biến mất đoạn sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp.  Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của S. choleraesuis mang gen asd bị đột biến. . pRE112/ asd. 2. Kiểm tra kết quả tạo dòng plasmid pRE112/ asd. 3. Chuyển nạp plasmid pRE112/ asd vào chủng S. choleraesuis nhược độc gây đột biến gen asd. 4. Kiểm tra kết quả gây đột biến gen asd