LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới Thạc sĩ Nguyễn Thị Anh Thư đã tận tình dìu dắt, chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người! Nha Trang, tháng 07 năm 2012 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Ngọc i MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii LỜI NÓI ĐẦU 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. TÌNH HÌNH NUÔI TÔM, DỊCH BỆNH VÀ NGHIÊN CỨU 2 1.1.1. Trên thế giới 2 1.1.2. Tại Việt Nam 4 1.2. VIRUS GÂY HỘI CHỨNG CHẬM LỚN (LSNV) 9 1.2.1. Hình thái, Cấu trúc 9 1.2.2. Cơ chế xâm nhiễm 11 1.2.3. Cách thức lan truyền 11 1.2.4. Dấu hiệu tôm nhiễm bệnh 11 1.2.5. Sự nhạy cảm của các loài tôm với LSNV 12 1.2.6. Mô mục tiêu 13 1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN LSNV TRÊN TÔM 13 1.3.1. Phương pháp mô bệnh học 13 1.3.2. Phương pháp lai tại chỗ 14 1.3.3. Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua 15 1.3.4. Phương pháp PCR 15 1.3.4.1. Chương trình PCR 16 1.3.4.2. Các thành phần và ảnh hưởng của chúng tới hiệu quả của phản ứng PCR.17 1.3.5. Phương pháp RT-PCR 20 1.4. TÍNH CẤP THIẾT VÀ MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 21 1.4.1. Tính cấp thiết 21 1.4.2. Mục tiêu của đề tài 21 ii Chương II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. VẬT LIỆU 22 2.1.1. Mẫu thí nghiệm 22 2.1.2. Cặp mồi cho phản ứng PCR 22 2.1.3. Hóa chất 23 2.2.4. Thiết bị chuyên dụng 24 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.3.1. Thu và chuẩn bị mẫu 25 2.3.2. Tách chiết RNA tổng số 25 2.3.2.1. Nguyên tắc 25 2.3.2.2. Phương pháp tiến hành 25 2.3.3. Nhân gen bằng kỹ thuật RT- PCR 26 2.3.3.1. Thiết lập điều kiện phản ứng 26 2.3.3.2. Thí nghiệm tối ưu nhiệt độ lai 28 2.3.3.3. Tính đặc hiệu của phương pháp 28 2.3.3.4. Giới hạn phát hiện của phương pháp (độ nhạy của quy trình) 29 2.2.4. Điện di trên gel agarose 29 2.2.4.1. Nguyên tắc 29 2.2.4.2. Phương pháp tiến hành 29 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. QUY TRÌNH RT-PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH LSNV 31 3.1.1. Các đặc tính của mồi trên lý thuyết 31 3.1.1.1. Các thông số của mồi 31 3.2.1.2. Tính đặc hiệu của mồi 34 3.2.2. Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế và các điều kiện của phản ứng PCR 35 3.2.2.1. Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế 35 3.2.2. Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu 36 iii 3.2.3. Xác định tính đặc hiệu 38 3.2.4. Giới hạn phát hiện của phương pháp 39 3.3. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH RT-PCR TRÊN MẪU TÔM SÚ KHU VỰC TỈNH KHÁNH HÒA 42 3.3.1. Tỷ lệ tôm sú nhiễm LSNV theo mùa thu mẫu 44 3.3.2. Tỷ lệ tôm sú nhiễm LSNV theo khu vực thu mẫu 45 3.3.3. Tỷ lệ tôm sú nhiễm LSNV theo loại mẫu 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 52 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Ước tính sản lượng tôm nuôi tại châu Á và châu Mỹ latin 3 Bảng 2.1. Các mẫu thu ở các khu vực tỉnh Khánh Hòa 22 Bảng 2.2: Các thông số của cặp mồi LSNV 20AF/20AR 22 Bảng 3.1: Một số đặc tính của cặp mồi LSNV 20AF/20AR 31 Bảng 3.2: Kết quả khảo sát mẫu tôm sú nuôi khu vực tỉnh Khánh Hòa tính theo mùa (mẫu thu từ tháng 11/2011 đến tháng 5/2012) 44 Bảng 3.3: Kết quả khảo sát mẫu tôm sú nuôi khu vực tỉnh Khánh Hòa tính theo khu vực thu mẫu 46 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sản lượng tôm nuôi trên thế giới năm 2001 5 Hình 1.2: Năng suất và sản lượng tôm nuôi Việt Nam từ năm 2001 đến năm 2011. 6 Hình 1.3: Kết quả so sánh trình tự nucleotide một phần gen RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp) từ chủng LSNV phân lập ở Sóc Trăng (LSNV-VN) và các chủng ở Thái Lan 8 Hình 1.4: Kết quả phân tích sự tương đồng của chuỗi trình tự acid amin của LSNV và một số virus có RdRp từ họ Luteovirida và từ Nấm 9 Hình 1.5: Cây phân loại chuỗi 13 acid amin virus RNA polymerase phụ thuộc RNA (Clustal W) tần số khởi động 1000 10 Hình 1.6: Hình tôm sú thả nuôi sau 100 ngày có biểu hiện chậm lớn (con có kích thước nhỏ) so với tôm bình thường (con có kích thước bình thường) trong cùng một ao nuôi tại tỉnh Sóc Trăng 12 Hình 1.7: Thể vùi mô tôm bị nhiễm bệnh và mô tôm bình thường nhuộm bằng kỹ thuật nhuộm thường quy (H & E) 14 Hình 1.8: Ảnh chụp hiển vi phản ứng lai tại chỗ (insitu) dương tính với mẫu dò 20A của mẫu tôm ở độ phóng đại thấp (a) và ở độ phóng đại cao (b) 14 Hình 1.9: Ảnh chụp hiển vi điện tử mẫu tôm nhiễm bệnh cho thấy các hạt virus 15 Hình 1.10: Chu kì của phản ứng PCR 17 Hình 1.11: Sơ đồ minh họa một quy trình RT- PCR 20 Hình 2.1: Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài 24 Hình 3.2: Cấu trúc kẹp tóc của mồi 20AF và 20AR 32 Hình 3.3: Một số cấu trúc self- dimer của mồi 33 Hình 3.4: Một số cấu trúc hetero- dimer của mồi 20AF/AR 33 Hình 3.5: Kết quả blast trình tự mồi xuôi và mồi ngược trên Genbank 34 Hình 3.6: Kết quả sắp gióng các mồi với trình tự chuẩn DQ127905.1 35 Hình 3.7: Kết quả áp dụng quy trình RT-PCR trên mẫu dương tính 36 Hình 3.8 : Kết quả điện di sản phẩm PCR sau khi tối ưu hóa nhệt độ lai 37 vi Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại trong thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu của quy trình RT-PCR 39 Hình 3.9: Giới hạn phát hiện LSNV của phương pháp RT-PCR hai bước 40 Hình 3.10: Giới hạn phát hiện LSNV của phương pháp RT-PCR một bước 41 Hình 3.11: Kết quả RT-PCR các mẫu tôm sú dương tính với LSNV thu vào mùa mưa 42 Hình 3.12: Kết quả RT-PCR các mẫu tôm sú dương tính với LSNV thu vào mùa khô.43 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 20AF : Mồi xuôi (forward primer) 20AR : Mồi ngược (reverse primer) µl : Microlitre µM : MicroMol A : Adenosine BChV : Bệnh khảm lá củ cải đường (Beet cholorosis virus) BLAST : Basic Local Alignment Search Tool bp : Base pair Btv : Bệnh lưỡi xanh (Bluetongue virus) BYDV : Bệnh vàng lùn lúa mạch (Barlay yellow drawf virus) C : Cytidine CABYV : Virus truyền bệnh qua rệp vàng trên cây bí (Cucurbit aphid-borne yellows luteovirus) cDNA : Complementary DNA dATP : Deoxyadenosine triphosphate dCTP : Deoxycytidine triphosphate dGTP : Deoxyguanosine triphosphate DEPC : Nước cất xử lý Diethylpyrocarbonate DIG : Digoxigenin DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate dTTP : Deoxythymidine triphosphate dUTP : Deoxyuridine Triphosphate EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic acid FAO : Food and Agriculture Organization G : Guanosine GAV : Virus gây bệnh trên mang (Gill associated virus) ha : Hecta viii HPV : Bệnh gan tụy (Hepatopacreatic parvovirus) H&E : Kỹ thuật nhuộm thường quy (Hematoxylin and Eosin) Ibdv : Virus gây bệnh Gumboro ở gà (Infectious bursal disease virus) IHHNV : Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ (Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus) ISH : Lai tại chỗ (in situ hybridization) JEV : Japanese encephalitis virus (Bệnh viêm não Nhật Bản) kDa : Kilodalton MBV : Bệnh tôm còi (Monodon baculovirus) mM : MilliMol MSGS : Hội chứng chậm lớn (Monodon slow growth syndrome) mRNA : RNA thông tin (Messenger RNA) NCBI : National Center for Biotechnology Information OD : Mật độ quang (Optical Density) PCR : Phản ứng khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction) PLRV : Bệnh cuốn lá khoai tây (Potato leaf roll virus) RdRp : RNA polymerase phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA polymerase) RNA : Ribonucleic Acid RT-PCR : Phản ứng khuếch đại gen sử dụng enzyme phiên mã ngược (Reverse Transcriptase Polymerase Chain reaction) RIA2 : Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2 (Research Institute for Aquaculture No.2) RNAsin : RNase inhibitor Rrv : Ross river virus Sfv : Semliki forest virus T : Thymidine TAE : Tris - Acetic acid - EDTA ix TE : Tris – EDTA TEM : Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscopy) Ta : Nhiệt độ lai (Annealing temperature) Tm : Nhiệt độ nóng chảy (Melting Temperature) UNG : Uracil-DNA glycosylase YHV : Bệnh đầu vàng (Yellow Head virus) WSSV : Bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus) Wnv : West nile virus [...]... việc phát hiện LSNV trên tôm sú giúp người nuôi phát hiện kịp thời, hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do dịch bệnh gây ra, nâng cao năng suất Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: Ứng dụng quy trình PCR để phát hiện virus gây bệnh Laem singh (LSNV) trên tôm sú ở tỉnh Khánh Hòa Đề tài này nhằm thực hiện các mục tiêu chính sau đây: - Ứng dụng quy trình PCR chuẩn phát hiện LSNV trên tôm sú. .. tiêu sau: - Chuẩn hóa quy trình PCR để phát hiện LSNV trên tôm sú nghi ngờ nhiễm bệnh - Khảo sát sự hiện diện của virus Laem singh virus trên tôm sú tỉnh Khánh Hòa 22 Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Mẫu thí nghiệm Mẫu chứng dương LSNV được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2 (Research Institute for Aquaculture No.2 - RIA2) Mẫu tôm sú (P monodon) được thu... trên tôm sú (P monodon) như GAV, YHV, MBV, HPV Laem singh virus (LSNV) là loại virus mới được phát hiện gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi tôm công nghiệp Tôm sú nhiễm bệnh này thường không thể hiện rõ biểu hiện bệnh hoặc có sự chậm lớn nên thường kéo dài vụ nuôi và kích thước tôm nuôi làm giảm năng suất và giá trị tôm sú nuôi LSNV có mặt ở tất cả các giai đoạn sản xuất từ tôm sú bố mẹ, tôm. .. tìm thấy ở tôm sú (Lightner và cộng sự, 1996) và thường bệnh do virus gây ra không có dấu hiệu đặc trưng của bệnh, đặc biệt bệnh xảy ra trong môi trường tự nhiên Tôm sú nhiễm bệnh Laem singh virus nhưng thường không thể hiện rõ biểu hiện bệnh hoặc có sự chậm lớn nên thường kéo dài vụ nuôi và kích thước tôm nuôi làm giảm năng suất và giá trị tôm sú nuôi Đây là loại virus mới được phát hiện gây thiệt hại... trở ngại lớn trong sự phát triển ngành nuôi tôm công nghiệp ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung Dịch bệnh do virus là một trong những nguyên nhân gây nguy hiểm cho môi trường biển Người ta ước tính rằng khoảng 60% thiệt hại kinh tế ở tôm nuôi trồng thủy sản đã được gây ra bởi các mầm bệnh virus và 20% bởi các mầm bệnh vi khuẩn Có nhiều loài virus được tìm thấy trên tôm nuôi đặc biệt là trên. .. một virus cùng lúc Tuy nhiên, không có mối tương quan giữa các tác nhân gây bệnh này với sự hiện diện MSGS Các kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng có thể có một tác nhân gây bệnh mới gây ra hiện tượng MSGS 4 Trong quá trình điều tra tác nhân gây bệnh MSGS tác giả Sritunyalucksana và cộng sự đã phát hiện ra sự hiện diện của một virus mới từ mẫu bệnh phẩm có đặc điểm của bệnh MSGS và đặt tên Laem singh virus. .. Dịch bệnh hiện đang là một trở ngại lớn trong sự phát triển ngành nuôi tôm công nghiệp ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung Dịch bệnh trên tôm nuôi, đặc biệt là dịch bệnh do virus gây ảnh hưởng rất lớn đến nền kinh tế quốc gia Hiện nay các loại giáp xác biển được biết rằng có thể đồng thời bị nhiễm nhiều hơn một loại virus (Flegel và cộng sự, 2004) Có khoảng 20 loại virus được tìm thấy ở tôm. .. nuôi ở khu vực huyện Vạn Ninh, Ninh Hòa và Cam Ranh – tỉnh Khánh Hòa, thu từ tháng 11 năm 2011 tới tháng 5 năm 2012 Thu 80 mẫu tôm sú gồm: 25 mẫu tôm giống, 30 mẫu tôm có dấu hiệu chậm lớn (MSGS) và 25 mẫu tôm sú bình thường Bảng 2.1 Các mẫu thu ở các khu vực tỉnh Khánh Hòa Loại mẫu Địa điểm Tôm giống (con) Tôm MSGS (con) Tôm bình thường (con) Nha Trang 0 10 10 Cam Ranh 5 4 5 Vạn Ninh 6 6 6 Ninh Hòa. .. khá lớn bởi dịch bệnh mà chủ yếu là dịch bệnh do virus gây ra Hiện tượng tôm nuôi thường bị dịch bệnh lây lan trên diện rộng đã gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người nuôi tôm Năm 2011, diện tích nuôi tôm bị nhiễm bệnh là 97.691 ha, trong đó trong đó trên 82.000 ha nuôi tôm sú bị thiệt hại (http://www.camautravel.vn/vn/newsdetail/3280/xuat-khau- tom-su-se-tiep-tuc-giam.html) Mặc dù tôm sú vẫn giữ... tại chỗ được phát triển để chẩn đoán bệnh LSNV [3, 11] bằng cách sử dụng mẫu dò 20A đánh dấu digoxigenin (DIG) chuyên biệt cho LSNV để dò tìm sự hiện diện của virus trên mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh Sự bắt cặp của mẫu dò với RNA virus trên mẫu tôm cho phép kết luận mẫu tôm bị nhiễm bệnh (hình 1.8) Hình 1.8: Ảnh chụp hiển vi phản ứng lai tại chỗ (insitu) dương tính với mẫu dò 20A của mẫu tôm ở độ phóng . dịch bệnh gây ra, nâng cao năng suất. Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: Ứng dụng quy trình PCR để phát hiện virus gây bệnh Laem singh (LSNV) trên tôm sú ở tỉnh Khánh Hòa thực hiện các mục tiêu chính sau đây: - Ứng dụng quy trình PCR chuẩn phát hiện LSNV trên tôm sú nghi ngờ nhiễm bệnh. - Khảo sát sự hiện diện của virus Laem singh virus trên tôm sú khu vực tỉnh. được gây ra bởi các mầm bệnh virus và 20% bởi các mầm bệnh vi khuẩn. Có nhiều loài virus được tìm thấy trên tôm nuôi đặc biệt là trên tôm sú (P. monodon) như GAV, YHV, MBV, HPV Laem singh virus