Công nghệ sinh học ứng dụng trong Thú Y và Y học PGS.TS. Dương thanh Liêm Bộ môn Dinh dưỡng Khoa Chăn nuôi – Thú y Trường Đại học Nông Lâm CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG MIỄN DỊCH HỌC: 1. SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG PHỤC VỤ CHO XÉT NGHIỆM VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH 2. SẢN XUẤT VACCINE TÁI TỔ HỢP PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC PHÒNG CHỐNG BỆNH TẬT Khái niệm miễn dịch 1. Miễn dịch chủ động Miễn dịch chủ động là phản ứng bảo vệ của cơ thể khi có sự xâm nhập của protein kháng nguyên lạ: - Một cách tự nhiên do sự xâm nhập của vi khuẩn hoặc virus vào cơ thể. - Một cách không tự nhiên thông qua chủng ngừa vaccin từ vi khuẩn hay virus đã nhược độc. Khi kháng nguyên xâm nhập, lập thức sản sinh tín hiệu báo động, kích thích hệ thống tế bào sinh kháng thể sản xuất một protein đặc hiệu, kết dính, trung hoà kháng nguyên. Protein thực hiện việc này gọi là kháng thể. Bảo vệ cơ thể bằng cách đưa trực tiếp kháng thể hay tế bào miễn dịch (tế bào kháng thể) vào cơ thể. Có hai phương cách đưa kháng thể vào cơ thể: 2. Miễn dịch bị động Thai nhi nhận kháng thể từ mẹ qua sữa đầu.  Thông qua việc tiêm huyết thanh có chứa kháng thể để điều trị bệnh. Thời gia tồn tại kháng thể ngắn Các giai đoạn phát triển chính của miễn dịch ứng dụng trong phòng chống bệnh. Thời kỳ sơ khai:  Sau trận dịch, những người sống sót là những người bất tử bởi dịch đó.  Nổ lực đầu tiên trong chủng ngừa bệnh đậu mùa. Pasteur là người có công lớn khai phá. Những bước đi đầu tiên trong thực nghiệm:  Vi khuẩn là nguyên nhân gây bệnh.  Miễn dịch dịch thể và miễn dịch trung gian qua tế bào là bước tiến lớn trong quan sát.  Lý thuyết về sự chọn lọc miễn dịch mục tiêu.  Những bước tiến trong miễn dịch phân tử. Một thế kỷ trước, Paul Ehrlich (1854 – 1915), Một nhà hóa học người Phần Lan đã tạo một bước đột phá trong nghiên cứu kháng thể. Ông cho rằng phân tử kháng thể được xem như là một “viên đạn phù thủy - magic bullet”, có thể định hướng và tiêu diệt các mầm bệnh ở người. Với phát minh quan trọng này, ông đã được tặng giãi Nobel Y học vào năm 1908. Vào năm 1975, Kohler và Milstein là những người đầu tiên dung hợp tế bào lympho để sản sinh một dòng tế bào có khả năng “bất tử” và sản sinh kháng thể đặc hiệu. Hai nhà khoa học nói trên được tặng giải Nobel Y học vào năm 1984 cho phát minh “Hybridoma” của họ. Gía trị của Hybridoma chỉ được khẵn định vào năm 1987 khi kháng thể đơn dòng được sản xuất thành công dùng trong chẩn đoán lâm sàng rất chính xác. César Milstein Nobel Y học (1984): Niels Jerne & Georges Kohler 1. Sản xuất kháng thể đa dòng Phân tử kháng nguyên tinh chế có thể có nhiều protein kháng nguyên Gây miễn dịch 1 1 2 3 [...]...HI chứa kháng thể Đa dòng Lượng Ig trong serum (Hiệu giá HI) 0 G y nhiểm Tuần lễ -> Một kháng ngun thường chứa nhiều y u tố quyết định kháng ngun (epitope) A B epitope lymphocytes KN C Để đáp ứng với kháng ngun, các lymphocyte cũng sản sinh và tiết nhiều phân tử kháng thể tương ứng có thể kết dính kháng ngun Mặt lợi của kháng thể đa dòng là sẽ có nhiều kháng... mềm Một vài dạng có khả năng ly giải SRBC Milestone: Kưhler, G and Milstein, Nature 256: 495-497 (1975) - Các khuẩn lạc được thu nhận và c y chuyền Cuối cùng thu nhận được dòng tế bào lai Một số chúng có khả năng tạo kháng thể đơn dòng kháng SRBC 3 Các ứng dụng của kháng thể đơn dòng: Đo hàm lượng protein và dư lượng thuốc trong huyết tương Phân loại mơ và định nhóm máu Xác định CD để phát hiện và chữa... Kháng thể và các tế bào bám vào sẽ được giữ lại dưới tác dụng của từ trường T T 4.Sau khi loại bỏ tác dụng của từ trường, các tế bào sẽ được giải phóng Tế bào lai Hybridoma đầu tiên G y miễn dịch chuột nhắt trắng với hồng cầu cừu (SRBC) Thu nhân tế bào lách và dung hợp với tế bào ung thư Tế bào lai sau đó được chọn lọc trong mơi trường HAT - Một trong số những tế bào được ni c y có khả năng ly giải SRBC... khả năng sinh sản một loại kháng thể khác nhau Lách Chọn lọc Dung hợp + Ni các tế bào lai “Hybridoma” Các tế bào “bất tử” Lựa chọn một trong số những tế bào n y để ni c y thứ cấp nhân lên, tạo sự đồng nhất TB … và tạo quần thể tế bào đơn dòng cùng nguồn gốc Tất cả các tế bào đều tạo một loại kháng thể duy nhất để chống lại một epitope duy nhất Tính đặc hiệu cao …nhưng độ nh y trong nhận biết và tiêu... đặc hiệu cho một serotyp Giải pháp ng y nay: 1 Làm “bất tử”các tế bào sản xuất kháng thể bằng phương pháp dung hợp tế bào lympho 2 Chọn lọc dòng tế bào chun sản xuất kháng thể đơn dòng mong muốn Kết quả: Kết quả là giải Nobel Y học dành cho hai nhà khoa học: George Kohler và Cesar Milstein 2 Sản xuất kháng thể đơn dòng để chẩn đốn các serotyp của vi trùng Kháng ngun tinh chế G y miễn dịch Cơ lập lách... acid và sẽ bị chết khi ni c y trong mơi trường HAT  Chỉ có các tế bào B đã được dung hợp với dòng tế bào Myeloma mới có khả năng sống sót trong mơi trường HAT Ứng dụng của kháng thể đơn dòng 1 Sản xuất các bộ kit để chẩn đốn bệnh, có thể phát hiện được ở hàm lượng rất thấp, nhanh chóng, có thể áp dụng để kiểm tra sàn lọc rất tốt Tuy nhiên để cho chính xác hơn cần kết hợp với phương pháp hóa học khác,... một lượng nhỏ kháng ngun KN Hybridoma TẾ BÀO HYBRIDOMA Sơ đồ qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng “Monoclonal Antibodies” http://tigger.uic.edu/depts/mcmi/courses/mim326/ppt/11-3-06MIM326.ppt Figure 18.2 Chọn lọc các dòng tế bào lai Phương pháp dùng mơi trường HAT  Dòng tế bào ung thư Myeloma thương mại hóa khơng có khả năng sử dụng chất: Hypoxanthine, Aminopterin và Thymidine (mơi trường HAT) làm... hiện 8 Rửa 9 Thêm cơ chất Đo mật độ quang và kết luận EIA – ELISA-kit Kết quả kiểm tra EIA Những giếng có màu vàng dương tính (màu lợt hàm lượng tồn dư thấp, màu đậm hàm lượng tồn dư cao) Những giếng khơng màu, âm tính (khơng có tồn dư -agonist) Xác định Clenbuterol bằng kháng thể miễn dịch enzyme EIA - enzyme immunoassay) Gắn kháng thể lên hạt nam châm siêu nhỏ, ly trích bởi từ trường B T B T 1 2 T B... kháng thể đa dòng là sẽ có nhiều kháng thể tấn cơng kháng ngun cùng một lúc Ag Mặt bất lợi của kháng thể đa dòng là sự kém đặc hiệu, một vài kháng ngun khác nhau có thể có cùng epitope, từ đó có thể g y sai lệch khi kết luận các serotyp trong chẩn đốn huyết thanh học Vấn đề đặt ra từ trước năm 1970: 1 Việc phân biệt giữa các dòng tế bào B, T khác nhau hầu như khơng thể thực hiện vì chúng có hơn 95%... pháp ELISA1 (Phủ phiến) ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay 1 Phủ phiến với kháng thể đơn dòng cần chọn lọc 2 Rửa 3 Khóa phiến, lấp những chổ trống trên phiến 4 Rửa 5 Thêm kháng ngun tương ứng Kháng ngun n y sẽ liên kết với Mab 6 Rửa để loại các liên kết kháng ngun – kháng thể khơng đặc hiệu Phương pháp ELISA2 (Phủ phiến) ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay 2 7 Thêm cộng hợp kháng Mab gắn . Công nghệ sinh học ứng dụng trong Thú Y và Y học PGS.TS. Dương thanh Liêm Bộ môn Dinh dưỡng Khoa Chăn nuôi – Thú y Trường Đại học Nông Lâm CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG MIỄN DỊCH HỌC: 1 nhiều y u tố quyết định kháng nguyên (epitope) Để đáp ứng với kháng nguyên, các lymphocyte cũng sản sinh và tiết nhiều phân tử kháng thể tương ứng có thể kết dính kháng nguyên KN A B C lymphocytes epitope Mặt. hợp tế bào lympho để sản sinh một dòng tế bào có khả năng “bất tử” và sản sinh kháng thể đặc hiệu. Hai nhà khoa học nói trên được tặng giải Nobel Y học vào năm 1984 cho phát minh “Hybridoma” của