ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HUỲNH NGỌC NGHIÊM THỤY NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α- GLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC Ở AN GIANG VÀ THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT CỦA THÂN CÂY NÚC NÁC Oroxylum indicum (L.) Kurz Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 62 44 29 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS.Nguyễn Thị Thanh Mai Thành phố Hồ Chí Minh-2011 Lời cảm ơn Xin chân thành tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Mai, người cô đã định hướng, truyền thụ những kinh nghiệm quý báo cho tôi, người đã tạo những điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành luận văn này. Cán bộ Nguyễn Xuân Hải, người luôn nhiệt tình giúp đỡ tôi trong lúc thực nghiệm, giải đoán cấu trúc cũng như trình bày khóa luận. Cán bộ Đặng Hoàng Phú, người đã hỗ trợ tôi rất nhiều khi thực nghiệm. Cảm ơn gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên, chia sẻ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con thực hiện đề tài. Thành phố Hồ Chí Minh 9-2011. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ MỞ ĐẦU TỔNG QUAN 1.BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 1 1.1. Khái niệm 1 1.2. Phân loại 1 1.2.1. Bệnh đái tháo đường loại 1 1 1.2.2. Bệnh đái tháo đường loại 2 1 1.3. Tác hại 3 1.3.1. Các biến chứng cấp tính 3 1.3.2. Các biến chứng mãn tính 4 1.4. Phương pháp điều trị 4 2. ENZYM α-GLUCOSIDASE 6 2.1. Sơ lược về enzym 6 2.2. Chất ức chế enzym 6 2.3. Động học phản ứng xúc tác của enzym 8 2.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzym 8 2.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất nền [S] 9 2.3.3. Ảnh hưởng của chất ức chế 12 2.3.3.1. Ức chế cạnh tranh 12 2.3.3.2. Ức chế kháng cạnh tranh 14 2.3.3.3. Ức chế không cạnh tranh 16 - 6 - 2.3.3.4. Uc chS h6n tp 18 2.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ 20 2.3.5. Ảnh hưởng của pH 20 2.4. Giới thiệu về enzym α-glucosidase 21 2.5.Tác nhân ức chế enzym α-glucosidase 22 2.5.1. Các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase từ tổng hợp 22 2.5.2. Các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase cô lập tự nhiên 25 3. TỔNG QUAN VỀ CÂY NÚC NÁC 30 3.1. Tên gọi 30 3.2. Mô tả thực vật 31 3.3. Phân bố 32 3.4. Dược tính 33 3.5. Thành phần hóa học 33 3.5.1. Các hợp chất cô lập từ lá 33 3.5.2. Các hợp chất cô lập từ quả 34 3.5.3. Các hợp chất cô lập từ hạt 35 3.5.4. Các hợp chất cô lập từ vỏ thân 36 3.5.5. Các hợp chất cô lập từ vỏ rễ 37 3.6. Hoạt tính sinh học 40 3.6.1. Kháng khuẩn 40 3.6.2. Chống lại tác nhân gây đột biến 40 3.6.3. Chống ung thư 40 3.6.4. Ức chế tăng sinh tế bào 40 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI THỰC NGHIỆM 1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 43 1.1. Hóa chất 43 1.2. Thiết bị 43 1.3. Dụng cụ 44 2. SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE 44 2.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ 20 2.3.5. Ảnh hưởng của pH 20 2.4. Giới thiệu về enzym α-glucosidase 21 2.5.Tác nhân ức chế enzym α-glucosidase 22 2.5.1. Các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase từ tổng hợp 22 2.5.2. Các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase cô lập tự nhiên 25 3. TỔNG QUAN VỀ CÂY NÚC NÁC 30 2.1. Điều chế cao thô 44 2.1.1. Nguyên liệu 44 2.1.2.Ly trích 49 2.2. Thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase 49 2.2.1. Nguyên tắc 49 2.2.2.Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase 51 2.2.3.Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzym α-glucosidase 53 2.3. Khảo sát động học xác định kiểu ức chế và hằng số ức chế K i 53 2.3.1.Khảo sát thời gian phản ứng 54 2.3.2.Khảo sát nồng độ chất nền 55 2.3.3.Xác định kiểu ức chế 55 2.3.4.Xác định hằng số ức chế K i 57 3. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ THÂN CÂY NÚC NÁC 59 3.1. Ly trích cao thô 59 3.2. Cô lập hợp chất 60 3.2.1.Cô lập chất từ phân đoạn A 60 3.2.2.Cô lập chất từ phân đoạn B 61 3.2.3.Cô lập chất từ phân đoạn C và D 61 KẾT QUẢ 1. NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA 40 CÂY THUỐC AN GIANG 65 1.1. Kết quả điều chế cao thô 65 1.2. Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của 40 mẫu cây . 66 2. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT ỨC CHẾ ENZYM α- GLUCOSIDASE CỦA THÂN CÂY NÚC NÁC 69 2.1. Cô lập và xác định cấu trúc các hợp chất 69 2.2. Biện luận cấu trúc các hợp chất 72 2.2.1. Hợp chất (1) 72 2.2.2. Hợp chất (2) 74 2.2.10. Hợp chất (10) 92 2.2.11. Hợp chất (11) 94 2.2.12. Hợp chất (12) 96 2.3. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất cô lập được 98 2.4. Nghiên cứu động học ức chế enzym α-glucosidase của oroxylosid 99 2.4.1. Khảo sát thời gian phản ứng 99 2.4.2. Khảo sát nồng độ chất nền 100 2.4.3. Xác định kiểu ức chế 101 2.4.4. Xác định K i 103 KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 2.2.3. Hợp chất (3) 77 2.2.4. Hợp chất (4) 80 2.2.5. Hợp chất (5) 81 2.2.6. Hợp chất (6) 84 2.2.7. Hợp chất (7) 87 2.2.8. Hợp chất (8) 90 2.2.9. Hợp chất (9) 91 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Tóm tắt ảnh hưởng của kiểu ức chế lên V max và K m 20 Bảng 1.2: Sự phân loại khoa học của cây núc nác 30 Bảng 2.1: Danh mục các cây thuốc nghiên cứu trong đề tài 45 Bảng 2.2: Thể tích các hóa chất trong quy trình thử hoạt tính 52 Bảng 2.3: Thể tích các dung dịch khảo sát nồng độ chất nền 55 Bảng 2.4: Tóm tắt dạng đồ thị các kiểu ức chế 55 Bảng 2.5: Thể tích các dung dịch nghiên cứu động học 57 Bảng 2.6: Tóm tắt cách xác định K i các kiểu ức chế 57 Bảng 3.1: Bảng hiệu suất cao trích được của các mẫu cây thuốc nghiên cứu 65 Bảng 3.2: Kết quả thử hoạt tính của chất đối chứng dương 66 Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính của 40 mẫu cây thuốc An Giang 66 Bảng 3.4: Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các cao phân đoạn thô 69 Bảng 3.5: Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các cao phân đoạn thu được từ cao EtOAc 70 Bảng 3.6: Bảng số liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz), 13 C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (1) trong dung môi cloroform-d 1 73 Bảng 3.7: Bảng so sánh phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR của hợp chất (1) trong dung môi cloroform-d 1 và hợp chất oroxylin A trong dung môi dimetyl sulfoxid-d 6 74 Bảng 3.8: Bảng số liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz), 13 C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (2) trong dung môi dimetyl sulfoxid-d 6 76 Bảng 3.9: Bảng so sánh phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR của hợp chất (2) trong dung môi dimetyl sulfoxid-d 6 và hợp chất oroxylosid trong dung môi dimetyl sulfoxid-d 6 76 Bảng 3.10: Bảng số liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz), 13 C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (3) trong dung môi aceton-d 6 78 Bảng 3.11: Bảng so sánh phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR của hợp chất (3) trong dung môi aceton-d 6 và hợp chất hispidulin trong dung môi metanol-d 4 79 Bảng 3.15: Bảng số liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz), 13 C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (6) trong dung môi aceton-d 6 86 Bảng 3.16: Bảng so sánh phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR của hợp chất (6) trong dung môi aceton-d 6 và hợp chất balanophonin trong dung môi cloroform-d 1 86 Bảng 3.17: Bảng số liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz), 13 C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (7) trong dung môi aceton-d 6 89 Bảng 3.18: Bảng so sánh phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR của hợp chất (7) trong dung môi aceton-d 6 và hợp chất 2-(1-hydroxymetyletyl)-4H,9H-naphto[2,3-b]furan-4,9-dion trong dung môi cloroform-d 1 89 Bảng 3.19: Bảng so sánh phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR của hợp chất (8) trong dung môi dimetyl sulfoxid-d 6 và hợp chất acid salicylic trong dung môi dimetyl sulfoxid-d 6 91 Bảng 3.20: Bảng so sánh phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR của hợp chất (9) trong dung môi aceton-d 6 và hợp chất acid p-hydroxybenzoic trong dung môi aceton-d 6 92 Bảng 3.21: Bảng so sánh phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR của hợp chất (10) trong dung môi metanol-d 4 và hợp chất acid protocatechuic trong dung môi dimetyl sulfoxid-d 6 93 Bảng 3.22: Bảng so sánh phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR của hợp chất (11) trong dung môi cloroform-d 1 và hợp chất isovanillin trong dung môi cloroform-d 1 95 Bảng 3.23: Bảng số liệu phổ 1 H-NMR (500 MHz), 13 C-NMR (125 MHz) và tương quan HMBC của hợp chất (12) trong dung môi aceton-d 6 97 Bảng 3.24: Bảng so sánh phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR của hợp chất (12) trong dung môi aceton-d 6 và hợp chất β-hydroxypropiovanillon trong dung môi cloroform-d 1 98 Bảng 3.25: Bảng kết quả hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của 10 hợp chất cô lập từ ruột thân cây núc nác 98 [...]... trúc của chất nền thật Ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition): chất ức chế chỉ chỉ kết hợp với phức enzym- chất nền mà không kết hợp với enzym tự do Đây là một dạng ức chế mà các liên kết của chất ức chế với enzym làm giảm -8- hoạt tính của nó nhưng không ảnh hưởng đến liên kết của enzym- chất nền Kết quả là mức độ của sự ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ của chất ức chế Ức chế không cạnh tranh... chất ức chế: Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition): chất nền và chất ức chế không liên kết với enzym cùng một lúc Điều này có thể là do chất ức chế có ái lực với tâm hoạt động của một loại enzym nên xảy ra sự cạnh tranh giữa chất nền và chất ức chế cạnh tranh vào tâm hoạt động của enzym Đây là loại ức chế có thể được khắc phục bằng nồng độ đủ cao của chất nền bởi vì những chất ức chế cạnh tranh... chất disaccarit ức chế enzym α- glucosidase 22 Hình 1.17: Các hợp chất iminosugar ức chế enzym α- glucosidase 23 Hình 1.18: Các hợp chất carbasugar và pseudoaminosugar ức chế enzym glucosidase 24 Hình 1.19: Các hợp chất thiosugar ức chế enzym α- glucosidase 24 Hình 1.20: Các hợp chất không có liên kết glycosidic ức chế enzym α- glucosidase 25 Hình 1.21: Cây núc nác. .. inhibition): chất ức chế kết hợp với enzym ở vị trí khác với vị trí kết hợp của chất nền tạo thành phức enzym- chất nền -chất ức chế không bị chuyển hóa tiếp Như vậy, enzym có thể đồng thời kết hợp cả chất ức chế và chất nền Chất nền và chất ức chế không cạnh tranh với nhau để kết hợp với enzym và cũng không thể loại trừ tác dụng kìm hãm bằng cách tăng nồng độ chất nền Ức chế hỗn tạp (mixed inhibition): là chất. .. kết với các enzym và làm tăng hoạt tính enzym mà chúng liên kết -7- Sự liên kết của một chất ức chế có thể ngăn chặn một chất nền đi vào tâm hoạt động của enzym và gây trở ngại cho các phản ứng xúc tác của enzym đó Chất ức chế có thể liên kết với enzym thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Chất ức chế không thuận nghịch thường phản ứng với enzym và thay đổi nó về mặt hóa học Những chất ức chế đó làm... Cây núc nác và hoa 31 Hình 1.22: Quả và hạt cây núc nác 32 Hình 1.23: Các hợp chất cô lập từ lá cây núc nác 34 Hình 1.24: Các hợp chất cô lập từ quả núc nác 35 Hình 1.25: Các hợp chất cô lập từ hạt cây núc nác 36 Hình 1.26: Các hợp chất cô lập từ vỏ thân cây núc nác 37 Hình 1.27: Các hợp chất cô lập từ vỏ rễ cây núc nác 39 Hình 2.1: Cấu trúc của acarbose... enzym 2.2 Chất ức chế enzym [2] Chất ức chế enzym là những chất làm giảm tốc độ phản ứng do enzym xúc tác Hoạt động của một enzym có thể giết chết một mầm bệnh hoặc điều chỉnh lại sự không cân bằng trong chuyển hóa Có nhiều loại thuốc ức chế enzym, chúng cũng được sử dụng như là chất diệt cỏ và thuốc trừ sâu Không phải tất cả các phân tử liên kết với enzym đều là chất ức chế enzym, những chất hoạt hóa... chất ức chế không những liên kết với enzym tự do mà còn liên kết với cả phức hợp enzym- chất nền tạo thành phức hợp enzym- chất ức chế- chất nền nên không tạo được sản phẩm Hiện tượng ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất ức chế Tốc độ ức chế cực đại đo được khi không có chất ức chế là cao hơn khi có mặt chất ức chế 2.3 Động học phản ứng xúc tác của enzym [2] Phản ứng do enzym xúc tác phụ thuộc vào nhiều... đường, cần phải nghiên cứu thêm các chất ức chế enzym α- glucosidase mới từ nhiều nguồn khác nhau Các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase, cũng như cô lập được nhiều hợp chất thiên nhiên có hoạt tính ức chế mạnh Trong khi đó, Việt Nam có nguồn cây thuốc dồi dào, phong phú, và trong dân gian ta từ lâu đã lưu truyền nhiều bài thuốc chữa bệnh... các chất ức chế và tâm hoạt tính mạnh mẽ và đặc biệt Ngược lại, đối với các chất nền và chất ức chế không thuận nghịch, các chất ức chế thuận nghịch thường không trải qua phản ứng hóa học khi liên kết với enzym và có thể dễ dàng loại bỏ bằng cách pha loãng hoặc thẩm tách Có 4 kiểu của ức chế enzym thuận nghịch, chúng được phân chia dựa theo tác động của sự thay đổi nồng độ chất nền của enzym trên chất . CÂY THUỐC AN GIANG 65 1.1. Kết quả điều chế cao thô 65 1.2. Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase của 40 mẫu cây . 66 2. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT ỨC CHẾ. thiệu về enzym α- glucosidase 21 2.5.Tác nhân ức chế enzym α- glucosidase 22 2.5.1. Các hợp chất ức chế enzym α- glucosidase từ tổng hợp 22 2.5.2. Các hợp chất ức chế enzym α- glucosidase. quả thử hoạt tính của chất đối chứng dương 66 Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính của 40 mẫu cây thuốc An Giang 66 Bảng 3.4: Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase của các cao