ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Đồ án: “Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia” MỤC LỤC SVTH: Lưu Thị Liên Trang Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Mở đầu Trang Chương 1: Tổng quan enzyme protease Trang Tổng quan enzyme protease Trang 1.1 Giới thiệu chung Trang 1.2 Đặc điểm tính chất protease vi sinh vật Trang 1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động protease .Trang Nguồn thu nhận protease Trang Phương pháp thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật Trang 3.1 Tuyển chọn giống vi sinh vật cho enzyme protease có hoạt lực cao .Trang 3.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme protease Trang 3.2.1 Nguồn cacbon Trang 3.2.2 Nguồn Nitơ Trang 3.2.3 Nguồn nguyên tố khống yếu tố kích thích sinh trưởng Trang 3.3 Nuôi cấy thu nhận phế phẩm enzyme protease phương pháp bề mặtTrang 3.4 Thu nhận enzyme Trang 11 3.4.1 Tách làm chế phẩm enzyme Trang 11 Quy trình thu nhận enzyme protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae .Trang 14 4.1 Quy trình thu nhận Trang 14 4.2 Thuyết Minh Quy Trình đề xuất thiết bị Trang 15 4.2.1 Lý chọn chủng nấm mốc Asp.oryzae .Trang 15 4.2.2 Kỹ thuật nuôi cấy Trang 15 4.2.3 Thu nhận sản phẩm Trang 16 4.2.4 Đề xuất thiết bị Trang 18 SVTH: Lưu Thị Liên Trang Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Tình hình nghiên cứu enzyme protease Trang 20 5.1 Tình hình nghiên cứu enzyme protease nước Trang 20 5.2 Vấn đề sản xuất enzyme protease giới Trang 22 Chương 2: Đối tượng nghiên cứu thiết bị Trang LỜI MỞ ĐẦU SVTH: Lưu Thị Liên Trang Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Sử dụng enzyme sản xuất đời sống vấn đề nhà khoa học kỹ thuật ý từ lâu Ngày nay, việc sử dụng trở thành phổ biến nhiều nước mang lại lợi ích kinh tế lớn Enzyme chất xúc tác sinh học khơng có ý nghĩa cho q trình sinh trưởng, sinh sản thực vật mà cịn đóng vai trò quan trọng chế biến thực phẩm, y học, kỹ thuật phân tích, cơng nghệ gen bảo vệ mơi trường Enzyme protease nhóm enzyme thủy phân protein ứng dụng rộng rãi q trình sản xuất nước mắm ngắn ngày, cơng nghiệp thuộc da, công nghiệp sữa phomat Đặc biệt q trình sản xuất bia, protease đóng vai trị quan trọng việc tăng nhanh q trình sản xuất, tăng hiệu suất trích ly, thủy phân hồn toàn chất protein, làm giảm độ nhớt làm triệt tiêu nguyên nhân làm đục bia Ngày nay, bia loại đồ uống thiếu sống người Bia loại nước giải khát, có độ cồn thấp, giàu dinh dưỡng Ngồi việc cung cấp lượng calori lớn, bia chứa hệ enzyme phong phú, kích thích tiêu hố cho thể người Hiện nay, nhà máy bia nước ta chưa ý tới việc sử dụng enzyme trình sản xuất Xuất phát từ lý em chọn đề tài “Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia” với mong muốn ứng dụng enzyme sử dụng rộng rãi việc sản xuất bia nói riêng Chương I TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE SVTH: Lưu Thị Liên Trang Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Tổng quan enzyme Protease [2] 1.1 Giới thiệu chung Protease enzyme xúc tác thủy phân liên kết peptit (CO-NH) phân tử protein chất tương tự Hình 1.1 Phản ứng thủy phân liên kết peptide Nhiều Protease có khả liên kết este vận chuyển acid amin Theo phân loại quốc tế enzyme thuộc nhóm chia thành phân nhóm phụ: - Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptit đầu nitơ mạch polypeptit - Cacboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptit đầu cacbon mạch polypeptit Cả hai phân nhóm enzyme exo – peptidase - Dipeptidhydrolase: Xúc tác thủy phân liên kết dipepit - Proteinase: Xúc tác thủy phân liên kết peptid nội mạch Protease cần thiết cho sinh vật sống, đa dạng chức từ mức độ tế bào, quan đến thể nên phân bố rộng rãi nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) động vật (gan, dày bê ) [10] Trong thể, Protease đảm nhiệm nhiều chức nǎng sinh lý như: hoạt hóa zymogen, đơng máu phân hủy sợi fibrin cục máu đơng, giải phóng hormon peptid có hoạt tính sinh học từ tiền chất, vận chuyển protein qua màng [3] Ngồi ra, Protease hoạt động yếu tố phát triển tế bào ác tính tế bào bình thường tǎng phân chia tế bào, sinh tổng hợp ADN [2] So với Protease động vật thực vật, Protease vi sinh vật có đặc điểm khác biệt Trước hết hệ Protease vi sinh vật hệ thống phức tạp bao gồm nhiều enzyme giống cấu trúc, khối lượng hình dạng phân tử nên khó tách dạng tinh thể đồng Cũng phức hệ gồm nhiều enzyme khác nên Protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để đa dạng SVTH: Lưu Thị Liên Trang Hình 1.2 Cấu trúc khơng gian enzyme Protease Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai 1.2 Đặc điểm tính chất Protease vi sinh vật [5] Các cơng trình nghiên cứu Protease vi sinh vật ngày nhiều Các kết nghiên cứu cho thấy Protease lồi vi sinh vật khác nhiều tính chất Căn vào chất phản ứng, pH hoạt động thích hợp,… nhà khoa học phân loại Protease vi sinh vật thành bốn nhóm sau: P-xerin, P-thiol, P-kim loại, P-acid Một số tác giả khác chia Protease ba nhóm, dựa vào hoạt động ph chúng bao gồm: Protease-acid, Protease trung tính, Protease kiềm Trong bốn Protease kể trên, Protease-xerin Protease-thiol có khả phân giải liên kết este liên kết amide dẫn xuất acid aa Ngược lại Protease kim loại, Protease acid thường Hình 1.3 Cấu trúc tinh thể Tripsin khơng có hoạt tính esterase (1 Protease xerin tiêu biểu) dẫn suất aa Nhiều Protease ngoại bào vi sinh vật nghiên cứu tương đối kỹ cấu tạo phân tử, số tính chất hóa lý chế tác dụng Kết nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử enzyme tương đối bé, P-xerin Có thể tóm tắt đặc tính nhóm Proteinase bảng 1.1 Bảng 1.1 Một số tính chất Protease (P) vi sinh vật Nhóm SVTH: Lưu Thị Liên Nguồn E Chất kìm Trang Đặc điểm pH tối Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia hãm DFP+ P-Xerin Bac.subtilis Bac.pumilus Str.griseus Str.fradiae Art hrobacter B22 Asp.oryzae Asp.flavus Asp.sojae E.coli GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai TTHĐ Xerin thích Kiềm P-tiol Streplococcus Clostridium histoly-ticum Indoaxeta-mit -SH Ps.cloromercurbenzoat 7,5 7,0 P-kim loại Bac.subtilus Bac.subtilus NRRL B3411 Bac Subtilisamy Losaccarilicis Bac Megaterium Psuedomonasaeruginoa Atreptomeces naraensis Asp Oryzae Acremonium kiliense Clostridiumhisttolytium EDTA++ 1,10octafenantrolin Kim loại Trung hóa trị hai tính P-Acid Asp.niger Asp.Awamori Sailoi,penicillium Janthinellum Rhizopus chinensis Mucor pucillus Endothia parasilica Dizoaxetil Dlnorloxinmetil este COOH Acid 1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) Protease [5] SVTH: Lưu Thị Liên Trang Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Trong TTHĐ Protease vi sinh vật gốc acid amin đặc trưng cho nhóm cịn có số gốc acid amin khác Các kết nghiên cứu chung TTHĐ số Protease vi sinh vật cho phép rút số nhận xét chung sau: - TTHĐ Protease đủ lớn bao gồm số gốc aa số trường hợp có cofactơ kim loại + Các Protease kim loại có TTHĐ lớn vào khoảng 21 0A, phân biệt thành sáu phần TTHĐ (subsite), phần TTHĐ tương ứng với gốc aa phân tử chất + Đối với Protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ tinh thể Protease acid Phizopus chinenis Endothia parasilica cho thấy phân tử Protease gồm có hai hạt, chúng có khe hở vào khoảng 200A Khe hở phần xúc tác E, gốc Asp-35 Asp-215 xếp đối diện khe - Đối với Protease không chứa cysteine, TTHĐ chúng có tính mềm dẻo cấu trúc khơng gian chúng không giữ vững cầu disulphide Mặc dù TTHĐ Protease vi sinh vật có khác enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo chế chung sau: E+S enzyme – S enzyme – S + P1 enzyme + P2 Hình 1.4 Cơ chế xúc tác TTHĐ Enzyme Trong đó: E: enzyme, S: chất, enzyme - S: Phức chất enzym- chất, P1: Là sản phẩm phản ứng, P2: Là sản phẩm thứ hai phản ứng Nguồn thu nhận Protease [3] Enzyme protein sinh vật tổng hợp tế bào chất tham gia xúc tác cho phản ứng sinh học Chính thế, sinh vật xem nguồn thu nhận để sản xuất enzyme Nhưng chủ yếu ba nguồn chính: Động vật, thực vật vi sinh vật Protease phân bố thực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên nguồn enzyme vi sinh vật phong phú nhất, có hầu hết vi sinh vật vi khuẩn, nấm mốc xạ khuẩn… nói vi sinh vật nguồn nguyên liệu thích hợp để sản xuất enzyme quy mơ lớn dùng công nghệ đời sống [3] Enzyme Protease từ nguồn động vật thực vật loài người khai thác ứng dụng hàng ngàn năm để sản xuất phục vụ sống Nhưng lượng enzyme thu nhận từ thực vật động vật thay dần enzyme vi sinh vật enzyme thu nhận từ nguồn thường khó hiệu kinh tế không cao Nguồn enzyme từ vi sinh vật thay enzyme từ SVTH: Lưu Thị Liên Trang Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai động vật thực vật hàng loạt ưu điểm sinh lý vi sinh vật kỹ thuật sản xuất liệt kê sau:  Vi sinh vật có khả chuyển hóa khối lượng chất lớn khối lượng thể chúng hàng ngàn lần sau ngày đêm  Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao  Tốc độ sinh sản vi sinh vật mạnh, thời gian ngắn thu lượng sinh khối vi sinh vật lớn, giúp thời gian ngắn thu lượng enzyme nhiều lượng sản phẩm trao đổi chất cao  Một đặc điểm riêng có vi sinh vật thể nhỏ bé nên việc vận hành, kiểm soát thiết bị lên men trình sản xuất đơn giản nhiều  Vi sinh vật giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mơ cơng nghiệp: Trong sản xuất, trình sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật hoàn toàn khơng phụ thuộc vào khí hậu bên ngồi Trong đó, sản xuất enzyme từ nguồn thực vật động vật đưa vào quy mô công nghiệp  Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẽ tiền dễ kiếm, ý nghĩa mặt kinh tế mà cịn có ý nghĩa lớn mặt môi trường sống vi sinh vật khơng địi hỏi q khắt khe yếu tố dinh dưỡng môi trường, vi sinh vật tổng hợp enzyne Chính enzyme sản xuất từ vi sinh vật thường rẻ tiền enzyme từ nguồn khác  Vi sinh vật sinh tổng hợp lúc nhiều loại enzyme khác [5]  Nhiều vi sinh vật có khả tổng hợp mạnh Protease, enzyme tế bào tiết vào môi trường nuôi cấy Một số Protease ngoại bào sản xuất quy mô công nghiệp sử dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp y học  Nguồn vi sinh vật thu nhận enzyme Protease chủ yếu gồm: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn Phương pháp thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật 3.1 Tuyển chọn giống vi sinh vật cho enzyme Protease có hoạt lực cao Để chọn giống vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzyme cao, người ta phân lập từ mơi trường tự nhiên dùng tác nhân gây đột biến tác động lên máy di truyền làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành biến chủng có khẳ tổng hợp đặc biệt hữu hiệu loại enzyme đó, cao hẳn chủng gốc ban đầu Có thể thơng qua phương pháp sau: - Phương pháp gây đột biến - Phương pháp biến nạp - Phương pháp tiếp hợp gene - Phương pháp tải SVTH: Lưu Thị Liên Trang Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai 3.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease Để tổng hợp enzyme Protease cần phải chọn mơi trường thành phần mơi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng tổng hợp enzyme vi sinh vật Trong thành phần mơi trường phải có đủ chất đảm bảo sinh trưởng bình thường vi sinh vật tổng hợp enzyme Đặc biệt lưu ý để tăng tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào tượng cảm ứng Vì thành phần mơi trường có chất cảm ứng chất hay sản phẩm phân giải kìm hãm làm yếu tác dụng kìm toả chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả sinh tổng hợp enzyme cho không bị cản trở Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường chất tương ứng enzyme cần tổng hợp Thành phần mơi trường: C, N, H, O Ngồi chất vơ cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K chất vi lượng khác 3.2.1 Nguồn cacbon [1],[9] Thường hợp chất hữu chủ yếu gluxit, tùy thuộc vào đặc tính enzyme nòi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp Có nhiều hợp chất hydratcacbon hợp chất khác nguồn cacbon thích hợp nấm mốc sinh enzyme Protease có hoạt lực cao Các nguồn cacbon có tác dụng đến sinh tổng hợp Protease Asp oryzae theo thứ tự: fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→ manit→ arabinoza→ galactoza Tinh bột nguồn cacbon nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme Protease 3.2.2 Nguồn nitơ [1] Nguồn nitơ sử dụng phong phú, bao gồm nhóm: vơ hữu Đối với số loài nấm mốc thuộc họ (A oryzae, A awamori, A niger, A flavus) mơi trường có nguồn nitơ hữu sinh tổng hợp Protease axit cao Nhiều kết nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme nâng cao mơi trường có đồng thời nguồn nitơ hữu nitơ vơ Cho thêm vào mơi trường có cám mì, bột đậu tương tách chất béo, nguồn nitơ hữu hoạt lực enzyme Protease tăng 22 - 74% Còn trường hợp dùng nguồn nitơ vô môi trường dẫn đến ngừng sinh tổng hợp Protease nói chung Ngồi ra, bazơ purin A (adenin), G (guanin) dẫn xuất chúng, ARN sản phẩm thuỷ phân làm tăng đáng kể sinh tổng hợp protease VSV 3.2.3 Nguồn nguyên tố khoáng yếu tố kích thích sinh trưởng [1] - Muối khống cần thiết cho hoạt động vi sinh vật Ion Mg 2+ có tác dụng sinh tổng hợp ổn định enzyme có hoạt tính nhiệt độ cao - Có nhiều yếu tố ảnh hưởng môi trường nuôi cấy SVTH: Lưu Thị Liên Trang 10 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Khi đường hoá tác dụng enzyme protease protein bị thuỷ phân thành axitamin, peptide, polypeptide… phần chất thức ăn cho nấm men, phần khác phần khơng thể thiếu bia thành phẩm Có khoảng 30 – 40% tổng số lượng đạm nguyên liệu chuyển vào nước dạng hòa tan làm cho nước nha trở nên giàu chất dinh dưỡng cho nấm men sinh trưởng phát triển Khi đường hoá enzyme protease thuỷ phân proteinase thể hoạt tính lớn Nó thuỷ phân protein thành polypeptide khơng đơng tụ Tiếp theo tác dụng enzyme polypeptidase polypeptide chuyển thành axitamin, lúc chế biến malt sấy malt cao nhiệt độ quy định, enzyme bị hoạt lực nên khâu chuyển hố quan trọng khơng thể tiến hành nhanh chòng được, trường hợp thân protease phải phân cắt không mối liên kết peptide protein, mà polypeptide khác chí dipeptide Mặc dù lượng protein có dịch lên men ảnh hưởng lớn đến tạo bọt độ bền bia Các sản phẩm thuỷ phân protein không tách khỏi dung dịch đun sơi, có tính keo Albumoza, pepton polypeptide tham gia vào việc tạo bọt tăng vị cho bia, peptide axitamin cần thiết cho sinh trưởng nấm men sau Quá trình thuỷ phân protein tác dụng enzyme protease phụ thuộc vào nhiệt độ PH môi trường Ở nhiệt độ 50 0C PH = 5,6 – 5,9 điều kiện thuận lợi để tích luỹ sản phẩm thuỷ phân có phân tử lượng nhỏ axitamin Ngược lại nhiệt độ 60 0C tích luỹ sản phẩm thuỷ phân có phân tử lượng cao polypeptide Cùng với thuỷ phân, q trình đường hố phần protein bị đông tụ tác dụng nhiệt độ cao Sự đông tụ bắt đầu nhiệt độ trước 600C nhiệt độ leucozin bắt đầu đông tụ Khi tăng nhiệt độ đến 90 0C globulin bắt đầu đông tụ Khi đun sôi số protein khác bắt đầu biến tính SVTH: Lưu Thị Liên Trang 56 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai đông tụ Mặt khác phần protein kết tủa liên kêt với tannin có vỏ malt, q trình đơng tụ kết tủa quan trọng giai đoạn công nghệ sau Lọc tách bã malt  Mục đích: Tách chất hồ tan khỏi chất khơng hồ tan  Tiến hành: Q trình lọc dịch đường gồm hai giai đoạn: lọc dịch rửa bã Chọn thiết bị lọc thùng cho dịch đường có chất lượng cao dễ vệ sinh Trước hết lọc khối cháo thu dịch đường đầu, sau dùng nước nóng 780C để rửa bã Khơng dùng nước có nhiệt độ lớn 78 0C để rửa bã nước q nóng làm vơ hoạt hệ enzyme amylaza tinh bột sót hồ hố khơng đường hố, kết làm cho dịch lên men bị đục bia đục theo Khi tiến hành lọc, phải cho nước nóng vào đáy lưới Nước vào đáy lưới chiếm đầy ống dẫn, khố, khoảng khơng gian đáy đáy lưới nên đẩy khơng khí ngồi Sau lọc xong tiến hành rửa bã nước nóng 78 0C nồng độ chất hồ tan cịn lại bã khoảng 1% Nếu rửa kỹ chất đắng, chất cay bã tan vào dịch đường làm cho bia có mùi, vị lạ, dịch đường bị lỗng Q trình lọc rửa bã kéo dài khoảng 4h Sau rửa xong, bã tháo đưa ngoài, thiết bị phải vệ sinh, sát trùng để chuẩn bị cho mẻ sau  Yêu cầu: Dịch đường nước rửa bã sau lọc phải hồn tồn Houblon hố:  Mục đích: Trích ly chất có giá trị hoa chất đắng, tinh dầu dịch đường có mùi thơm va đắng đặc trưng SVTH: Lưu Thị Liên Trang 57 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Polyphenol + protein làm dịch đường (tạo kết tủa, kết tủa kếo theo chất lơ lửng làm dịch đường.) Sát trùng dịch đường Xảy phản ứng tạo màu tạo mùi Loại bỏ, làm bay chât gây mùi không tốt Điều chỉnh nồng độ dịch đường trước lên men  Tiến hành: Thiết bị houblon hoá cấu tạo giống với thiết bị nấu bề mặt truyền nhiệt lớn cần bốc lượng lớn nước trình đun sôi Liều lượng hoa houblon sử dụng 3g/1 lít dịch đường Hoa dử dụng hai dạng: hoa nguyên cánh chiếm 35% hoa viên chiếm 65% Chọn phương án cho hoa lần: - 1/2 hoa viên cho vào lúc dịch đường vừa lấp đáy nồi - 1/2 hoa viên lại cho vào sau sôi 30 phút - Hoa nguyên cánh cho vào 30 phút trước nấu kết thúc Tiến hành: dịch đường nước rửa bã từ thiết bị lọc chuyển vào nồi houblon hoá Khi dịch đường vừa lấp đáy nồi bắt đầu cung cấp nhiệt để nhiệt độ dịch đường giữ 750C, đồng thời cho 1/2 lượng hoa viên vào để lấy chất đắng Sau dịch đường nước rửa bã chuyển hết vào nồi houblon tiến hành nâng nhiệt đến nhiệt độ sơi Giữ sôi 30 phút cho 1/2 lượng hoa viên lại vào nhằm lấy chất đắng, tạo hương kết lắng protein Trước kết thúc trình houblon hố 30 phút cho hoa ngun cánh vào để tạo hương vị đặc trưng bia Tổng thời gian đun sôi 120 phút Sau đun sôi xong, dịch đường bơm sang thiết bị lắng  Tách bã hoa: SVTH: Lưu Thị Liên Trang 58 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Sau đun sôi xong, dịch đường chuyển sang thùng lọc bã hoa để tách dịch đường ngồi, cịn bã giữ lại bên Sau giải phóng hết dịch đường, thiết bị houblon hố tráng qua nước nóng, nước nóng dùng để rửa bã hoa, nước rửa bã dùng vào việc đường hoá mẻ sau bổ sung vào dịch đường phân đoạn nấu bia Bã thu gom chuyển loại phế thải Dịch đường nóng nhờ bơm ly tâm chuyển đến thiết bị lắng làm lạnh Lắng làm lạnh  Mục đích: Hạ nhiệt độ dịch đường đến nhiệt độ lên men, kết tủa huyền phù bão hoà oxi cho dịch đường  Tiến hành: Đảm bảo thiết bị kín, vơ trùng, tiến hành nhanh Tiến hành lắng trong thiết bị whirlpool làm lạnh thiết bị làm lạnh mỏng với chất tải lạnh glycol Thiết bị whirlpool có ưu điểm đảm bảo vơ trùng dịch đường đưa vào thiết bị khỏi thiết bị nhiệt độ cao (khoảng 90 0C) thời gian lắng khoảng 20 phút Dịch đường vào thiết bị nửa phần theo phương tuyếp tuyến với vận tốc khoảng 10 ÷ 14 m/s, dịch đường chuyển động tròn thiết bị, kết tủa lắng xuống tâm thiết bị Sau để lắng 20 phút, dịch đưa làm lạnh đến nhiệt độ lên men, cặn loại bỏ Tại thiết bị làm lạnh, dịch lên men nóng tiến hành trao đổi nhiệt gián tiếp với glycol, nhiệt độ dịch đường hạ dần xuống khoảng 90C, thời gian làm lạnh không vượt Bổ sung oxy nhằm mục đích bổ sung lượng oxi thích hợp để tạo điều kiện hiếu khí cho nấm men tăng sinh khối giai đoạn đầu trình lên men Cần phải khống chế hàm lượng oxi – g/lít nước nha Lên men  Mục đích: SVTH: Lưu Thị Liên Trang 59 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Chuyển hoá chất đường dextrin thấp phân tử nước nha thành C2H5OH, CO2 Đồng thời, tạo sản phẩm phụ este, axit hữu cơ, rượu bậc cao, aldehyt, glyxerin … hoà tan vào dịch lên men tạo thành bia non  Tiến hành: Dịch lên men sau làm lạnh bổ sung khơng khí vơ trùng (khoảng 8mg O2/lít dịch đường) đưa vào thùng lên men Dịch men giống chuyển vào thùng lên men theo luồng dịch đường với tỷ lệ lít men giống đặc/100 lít dịch lên men nhằm tạo điều kiện cho nấm men tiếp xúc tốt với môi trường Nhiệt độ lên men 90C, áp suất dư thiết bị lên men 0,2 ÷ 0,4at, CO2 sinh q trình lên men hồ tan vào bia non phần Độ hoà tan CO2 vào bia non tăng nhiệt độ giảm, để đảm bảo lượng CO2 hồ tan bia nhiều nhiệt độ thời kỳ cuối trình lên men khoảng 50C, hàm lượng CO2 bia non phải đạt 0,2% Thời gian lên men phụ thuộc vào nồng độ dịch lên men nhiệt độ lên men Lên men xem kết thúc chất chiết dịch lên men giảm từ 0,15÷0,2% ngày đêm Đối với dịch lên men có nồng độ 16% thời gian lên men chọn ngày  Nấm men bia: Có chủng: + Saccharomyces cerevisiae: thuộc loại lên men + Saccharomyces carlsbergensis: thuộc loại lên men chìm Nhà máy sử dụng chủng nấm men chìm, q trình lên men xảy lịng mơi trường, lên men xong tế bào kết thành chùm lắng xuống đáy Do đó, bia chóng tự so với lên men Dịch lên men có nồng độ cao nên yêu cầu chủng nấm men có khả chịu áp suất thẩm thấu lớn  Các trình xảy lên men chính:  Q trình sinh lý: Xảy giai đoạn đầu trình lên men Trong giai đoạn dịch đường có khí oxi, nấm men hơ hấp hiếu khí tăng sinh khối, tổng hợp enzyme SVTH: Lưu Thị Liên Trang 60 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai  Q trình sinh hóa: Xảy cuối q trình sinh lý dịch đường khơng cịn khí oxi, nấm men trở sang hơ hấp kị khí Trong q trình sinh hóa có q trình chuyển hóa chất hữu khác để tạo sản phẩm thứ cấp glycerin, andehyt, rượu bậc cao, diacetyl Quá trình lên men đường thành rượu etylic va dioxide cacbon C6H12O6 → C2H5OH + CO2 + Q Các lọai đường khác tốc độ lên men khác nhau: - Hecxose: Glucose, fructose đường lên men khởi động - Disaccharide: maltose, saccharose lên men - Maltotniose: Đường có gốc glucose lên men chậm hơn, lên men phụ ủ chín bia • Q trình hình thành chuyển hóa hợp chất thứ cấp: Mùi bơ bia 80% diacetyl 20% Vicinal Diketon gây Diacetyl nguyên chất chất lỏng không màu có màu vàng nhạt có mùi mạnh tác động nhiều đến hệ thần kinh Với hàm lương > 0,1ppm gây mùi vị khó chịu cho bia Do bia có hàm lượng diacetyl < 0,1ppm đạt u cầu Đường bậc cao: Khơng tan nước, có dạng dầu có mùi cịn có tên dầu fusel Nhìn chung đường bậc cao có ảnh hưởng không tốt đặc biệt hàm lượng lớn 100mg/lít Andehyl: Là sản phẩm q trình trao đổi chất Gây mùi bia non không thơm dịu, q trình ủ chín bào tử bia hàm lượng andehyt giảm dần • Các biến đổi lý hóa khác: Giảm pH: pH trình lên men giảm dần, trước lên men pH = 5,2 – 5,6, sau lên men pH = 4,2 – 4,6 Giảm độ màu: (EBC) Trong trình lên men độ màu giảm khoảng 3EBC pH giảm so tế bào nấm men phát triển hấp thụ màu Sự tạo bọt: Là hệ khí lỏng, q trình lên men tạo CO tạo thành bọt Protein kết hợp với acid đắng làm bền bọt SVTH: Lưu Thị Liên Trang 61 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Lên men phụ tàng trữ bia non:  Mục đích: Tiếp tục lên men phần đường lại sau lên men chính, bão hồ CO tăng cường mùi vị cho bia Thực q trình chín bia (ổn định chất lượng bia)  Tiến hành: Quá trình lên men phụ tiến hành thùng kín đặt phịng lạnh từ ÷ 20C Nhiệt độ lên men phụ khoảng 10C, áp suất dư 0,3 ÷ 0,7 at Trong trình lên men phụ cần theo dõi áp suất thiết bị lên men, mức độ bia, nhiệt độ phân xưởng Bia non chuyển vào từ đáy thiết bị nhằm giảm tạo bọt giảm mát CO2 Đầu tiên cho bia chảy nhanh sau có tạo bọt nên cho bia chảy gián đoạn Khi bia non đầy thùng bắt đầu thải khơng khí bề mặt bia non Để đảm bảo bia thành phẩm có chất lượng màu sắc, mùi vị thành phần hố học bia non từ thùng lên men chuyển vào nhiều thùng lên men phụ Quá trình chuyển bia non vào thiết bị lên men phụ tiến hành từ từ kéo dài ÷ ngày đêm Tuy nhiên, sau ngày đêm thùng lên men phụ cần phải chứa đầy bia non khơng dễ bị nhiễm vi sinh vật bão hoà CO khó bốc Khi bia chứa đầy thùng đóng van điều chỉnh áp suất, tiến hành thải khơng khí bề mặt bia nâng áp suất đạt theo yêu cầu Quá trình nâng cao áp suất kéo dài ÷ ngày kể từ lúc chuyển xong bia non vào Nếu nâng áp suất q nhanh khơng khí bề mặt bia hồ tan vào bia oxy khơng khí gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng bia thành phẩm Thời gian lên men phụ 40 ngày Sau lên men phụ bia chuyển vào thùng chứa đem lọc Trong giai đoạn ủ chín bia q trình oxi hóa khử có ý nghĩa quan trọng nhờ trình mà lượng diacetyl giảm 50% Cũng giai đoạn ủ chín bia này, số tế bào nấm men chết tự phân enzyme SVTH: Lưu Thị Liên Trang 62 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai protease Sản phẩm tự phân peptid, axitamin, vitamin vài thành phần axit nucleic, enzyme chủ yếu nhom peptidase protease Chính sản phẩm tự phân nấm men có ảnh hưởng nhiều đến hương vị bia Nếu trình cơng nghệ diễn bình thường, lượng nấm men tự phân vừa phải sản phẩm có lợi ngược lại có nhiều tế bào tự phân mùi vị bia khơng bình thường chí khó chịu Một phương pháp phổ biến thường dùng để nâng cao độ bền bia xử lý bia enzyme chất ổn định khác Phương pháp đơn giản có hiệu cao dùng chế phẩm enzyme để phân huỷ chất protein có bia Chế phẩm protease đưa vào bia giai đoạn lên men phụ, ủ chin bia khâu lọc làm giảm hàm lượng chất protein cao phân tử xuống mức tối thiểu Nhiều nghiên cứu cho thấy pepsin, ficip, chế phẩm protease nấm sợi papain có tác dụng tốt trình ổn định chất lượng bia Do papain thường ứng dụng nhiều Khi tiến hành lên men phụ, người ta thường cho papain vào, kết tác động papain, dịch bia trở nên trình bảo quản bia, chất lượng bia khơng thay đổi Sau tàng trữ, vị bia trở nên mềm dịu Sự tự phân nấm men tác dụng enzyme protease sinh sản phẩm peptide, aminoaxit, vitamin có ảnh hưởng tốt đến chất lượng bia kết tủa nấm men làm dư vị chúng, cịn keo tụ lão hố nhựa houblon làm nên dư vị đắng bia Lọc bia: 9.1 Mục đích: Để loại bỏ hạt nhỏ bé như: tế bào nấm men, protein, huyền phù … làm cho bia đạt độ yêu cầu chất lượng, ổn định tăng độ bền sinh học, hoá học cho bia 9.2 Tiến hành: Bia lọc thiết bị lọc khung với chất trợ lọc bột diatomit SVTH: Lưu Thị Liên Trang 63 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Đầu tiên, bột diatomit trộn với nước vô trùng theo tỷ lệ định tạo thành dung dịch huyền phù, sau dung dịch huyền phù bơm vào máy lọc ép để tạo lớp diatomit vải lọc Tiếp theo, bia lọc qua lớp diatomit này, bia lúc đầu đục nên phải trở lại thùng tiếp liệu Áp suất lọc thiết bị 1,2 ÷ 1,3 at Nếu vượt khỏi at lớp vải lọc bị rách 10 Ổn định bia sau lọc: Sau lọc hàm lượng CO2 bia bị giảm Do đó, để khơi phục lại bão hồ CO2 bia sau lọc, bia giữ thùng chứa nhiệt độ 0,5 ÷ 10C áp suất CO2 0,5 at thời gian tối thiểu Hàm lượng CO2 bia thành phẩm phải đạt 0,3% khối lượng Nếu chưa đạt yêu cầu phải bổ sung CO2 cho bia 11 Chiết chai 11.1 Mục đích: Để thuận tiện cho việc tiêu thụ, vận chuyển, bảo quản rót bia vào chai thuỷ tinh màu sẫm lon 11.2 Tiến hành Yêu cầu chai lon: đảm bảo độ bền học, loại chai thường phải có màu Trước rót, chai rửa sát trùng kỹ nước nóng 75 0C dung dịch NaOH 2% có bổ sung stabilon để làm bóng chai Sau đó, chai làm nguội rót bia vào Bia rót điều kiện đẳng áp để tránh tổn thất CO tránh trào bọt gây tổn thất sản phẩm Dây chuyền chiết bia giới hố hồn tồn bao gồm cơng đoạn sau: rửa chai, kiểm tra chai, chiết bia vào chai, đóng nắp chai, kiểm tra độ kín chai bia thành phẩm, trùng bia, hoàn thiện sản phẩm 12 Thanh trùng 12.1 Mục đích: SVTH: Lưu Thị Liên Trang 64 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Thanh trùng bia để tăng độ bền cho bia Trong điều kiện trùng, phần lớn vi sinh vật, nấm men bia sót lại bị tiêu diệt, vi sinh vật chịu nhiệt bị yếu khả sinh sản 12.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình trùng  Loại vi sinh vật: Các loại vi sinh vật khác chịu nhiệt độ khác  Số lượng vi sinh vật: Vi sinh vật nhiều thời gian trùng lâu pH thấp khả chịu nhiệt vi sinh vật 12.3 Những biến đổi xảy trùng Khi trùng bia, áp suất bia tăng dễ làm chai nứt vỡ, xảy phản ứng melanoid làm cho bia bi sẩm màu Thanh trùng gây đục bia Thay đổi mùi vị bia, đặc biệt bia bị oxi xâm nhập 12.4 Tiến hành Nhà máy sử dụng trùng kiểu tunel phun tuyến tính với thời gian trùng 45 phút 630C Các vùng nhiệt độ mà bia phải qua là: 290C, 350C, 450C, 630C, 450C, 350C 290C 13 Giới thiệu số sản phẩm bia SVTH: Lưu Thị Liên Trang 65 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Hình 1.40 Một số sản phẩm bia KẾT LUẬN Với việc nghiên cứu “ứng dụng enzyme protease sản xuất bia” mong muốn đưa đến cho bạn đọc thông tin bổ ích từ việc chiết tách ứng dụng enzyme đời sống sản xuất bia Qua q trình tìm hiểu cịn tồn vấn đề, em mong muốn thầy cô bạn tìm hiểu đóng góp thêm ý kiến để quy trình hồn thiện Việt nam bước đầu ứng dụng cơng nghệ enzyme q trình sản xuất nên việc nghiên cứu ứng dụng enzyme việc cần ý đầu tư Những khó khăn gặp phải q trình làm đề tài Trong trình làm đề tài em gặp nhiều khó khăn, chủ yếu vấn đề tìn tài liệu Các loại tài liệu liệu liên quan ứng dụng enzyme protease sách báo nói tài liệu khơng cịn mới… tài liệu tham khảo internet nói ít, nói ngồi rìa khơng sâu vào vấn đề Ngồi trình lưu giữ tài liệu găp nhiều khó khăn như: USB, bị virus ăn hay cố cúp điên làm Cuối em xin chân thành cảm ơn cô Hồ Thị Tuyết Mai hướng dẫn tận tình cho em suốt trình làm đồ án SVTH: Lưu Thị Liên Trang 66 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Trần Xuân Ngạch (2007), Công nghệ enzym, Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng [2] Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzyme, Nhà xuất Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh [3] Lương Đức Phẩm (2004), Cơng nghệ vi sinh vật, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội [4] Lưu Thị Nguyệt Minh (2007), “Phân tách Protease Bacillus Subtilis hệ hai pha Polyethylene glycol/ Potassium phosphate”, Đồ án tốt nghiệp [5] Nguyễn Đức Lượng ( chủ biên),(2004), Công Nghệ EnZyme, Nhà Xuất Bản Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh [6] Cơng nghệ lên men Bùi (chủ biên) [7] Vũ Ngọc Bội (2004), luận án tiến sĩ sinh học: “Nghiên cứu trình thủy phân protein cá enzyme Protease từ B.subtilis S5”, Đại Học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên [8] Hồ Thị Tuyết Mai(2006), giảng Công nghệ E, Trường Cao Đẳng Lương Thực Thực Phẩm [9] enzyme Vi Sinh Vật, tập 1, Lê Ngọc Tú, La Văn Chử, Phạm Trân Châu, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội 1982 [10] Tạp chí sinh học, tập2(2)-2006: “Ảnh hưởng yếu tố môi trường lên trình sinh trưởng sinh tổng hợp Protease chủng Serratia sp DT3”, Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi viện CNSH [11] Tạp chí sinh học, tập4(2)-2006: “ Xác định số tính chất hóa lý Protease chủng Serratia sp DT3”, Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi, Lê SVTH: Lưu Thị Liên Trang 67 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Thị Thu Hương viện CNSH, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc Gia Hà Nội [12] Tạp chí Phát Triển KH&CN, tập9, số11- 2006 [13] Tạp chí Cơng nghệ sinh học, tập5, số2- 2007 [14] Tạp chí Cơng nghệ sinh học, tập5, số3- 2007 Tài liệu tham khảo internet http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/khai-quat-ve-bia.337962.html http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/do-an-tot-nghiep-thiet-ke-nha-may-bia-lenmen-bang-phuong-phap-co-dien-voi-nang-suat-20-trieu-lit-n.329735.html [1] http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Subtilisin [2] http://www.cimsi.org.vn/tapchi/sotty ai5-9-1999.htm [3] http://phobachkhoa.com/@pbk/showthread.php?t=17432 [4] http://gralib.hcmuns.edu.vn/greenstoneli SVTH: Lưu Thị Liên Trang 68 Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia SVTH: Lưu Thị Liên Trang 69 GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Lớp: 08s2 ... chưa ý tới việc sử dụng enzyme trình sản xuất Xuất phát từ lý em chọn đề tài “Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia” với mong muốn ứng dụng enzyme sử dụng rộng rãi việc sản xuất bia nói riêng... Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Tình hình nghiên cứu enzyme protease Trang 20 5.1 Tình hình nghiên cứu enzyme protease nước Trang 20 5.2 Vấn đề sản xuất enzyme. .. QUAN VỀ ENZYME PROTEASE SVTH: Lưu Thị Liên Trang Lớp: 08s2 ĐACM: Ứng dụng enzyme protease sản xuất bia GVHD: Hồ Thị Tuyết Mai Tổng quan enzyme Protease [2] 1.1 Giới thiệu chung Protease enzyme