Đang tải... (xem toàn văn)
Cây có múi là cây ăn quả có giá trị kinh tế cao, chiếm diện tích ưu thế ở các tình thành Nam Bộ, đặc biệt một số vùng đã hình thành nên những thương hiệu nổi tiếng như cam sành Tam Bình, Trà Nông. Gần đây vùng Cầu Kè (Trà Vinh), Châu Thành (Hậu Giang) nổi lên là vùng trồng mới rất có hiệu quả. Nhìn chung cây ăn trái ở Nam Bộ phát triển rất nhanh về diện tích lẫn cơ cấu cây trồng và sản lượng, trong đó có phần đóng góp quan trọng của cây có múi. Hiện nay nhà nông đang đứng trước nhiều thách thức ảnh hưởng đến giá trị thương phẩm của cam quýt, trong đó đáng kể đến nhất là bệnh hại do virus như Greening và tristera. Đây là bệnh nguy hiểm nhất đối với cây có múi. Nó ảnh hưởng rất nghiêm trọng tới năng suất và chất lượng. Bệnh này gây ra từ nhiều dòng khác nhau, việc hiểu rõ dòng gây hại giúp cho việc quản lý bệnh dễ dàng hơn, ta có thể sử dụng dòng nhẹ để chủng lên cây trước và cây sẽ chống chịu tốt khi có dòng khác độc hơn tấn công. Trong các nghiên cứu thí nghiệm, thực nghiệm cũng như thực tế phát hiện và điều trị các bệnh lý trên người, động vật và thực vật, lĩnh vực chẩn đoán luôn đóng một vai trò thiết yếu. Trong số những kỹ thuật quan trọng trong chẩn đoán, không thể không kể đến ELISA. ELISA là kỹ thuật được sử dụng rất rộng rãi trong y dược, thú y và bệnh lý thực vật, và cho đến nay vẫn là một trong những phương pháp chẩn đoán quan trọng nhất trong miễn dịch học cũng như một số lĩnh vực khác.
I- GIỚI THIỆU BỆNH VÀNG LÁ GREENING (VLG) VÀ MỘT SỐ BỆNH VIRUS HẠI CÂY CÓ MÚI 1- Bệnh vàng lá greening (VLG) Triệu chứng bệnh: Khi bị nhiễm bệnh lá bắt đầu chuyển sang màu vàng ở gân lá và vùng lân cận rồi cả phiến lá có màu vàng hoặc khảm vàng, đôi khi gân lá bị biến hoá, lá bệnh trở nên ròn, mép lá uốn cong ra ngoài và thường bị rụng sớm. Các lá non ra sau nhỏ và biến vàng tương tự như hiện tượng thiếu kẽm. Các cành nhánh bị khô, rễ tơ và rễ nhánh bị huỷ hoại khiến cây bị suy thoái và chết. Cây bệnh thường ra hoa trái vụ và có thể vẫn cho quả. Quả sinh ra từ cây bệnh thường bị biến dạng, tâm quả bị vẹo và có nhiều hạt lép, phẩm chất kém. Bị bệnh sớm cây thường bị tàn lụi ngay trong 1 - 2 năm sau khi trồng. Nguồn gây bệnh: Là vi khuẩn Liberobacter asiaticum. Vi khuẩn hình gậy, kích thước 350 - 550 x 600 - 1.500 nm với vỏ hai lớp, dày 20 - 25 nm. Tuy nhiên vi khuẩn mang tính đa hình nên có thể gặp dưới dạng que dài hoặc tròn với đường kính 700 - 800 nm. Vi khuẩn sống trong mạch libe của cây. Bệnh VLG lây lan qua cành chiết, mắt ghép và côn trùng môi giới - rầy chổng cánh Diaphorina citri. 2- Bệnh Tristeza (tàn lụi): Triệu chứng: Thể hiện chung của bệnh là bộ lá biến vàng nhanh, cây suy thoái và tàn lụi. Ở Việt Nam hiện nay mới chỉ phát hiện các biểu hiện nhẹ như lá biến vàng và gân nhỏ bị trong từng đoạn ngắn (ở lá chanh Eureca), đôi khi gặp dạng lõm thân (cam ngọt miền Nam). Nguồn bệnh: Là vi khuẩn Closterovirus dạng sợi thẳng hoặc cong, kích thước 12 x 2000 nm. Bệnh lây lan qua mắt ghép và cành chiết và côn trùng môi giới là rệp cam, rệp bông (Toxoptera citricida, Aphis gossypii, Aphis aurantii). Ngoài hai bệnh trên, trên cây có múi ở nước ta còn gặp ở mức độ chưa phổ biến một số bệnh virus và tương tự virus Exocortis, Cristacortis Biện pháp chính phòng bệnh vàng lá greening, tristeza các bệnh virus khác: 1- Vệ sinh môi trường: trước khi trồng mới, những cây cam quýt trong vùng phải được kiểm tra và chặt bỏ hết các cây bị bệnh. 2- Chỉ sử dụng cây giống sạch bệnh để trồng. 3- Phòng trừ môi giới truyền bệnh và thâm canh tăng sức chống chịu bệnh cho cây. 4- Kiểm tra bệnh thường xuyên để loại trừ cây bệnh kịp thời. II- KỸ THUẬT TUYỂN CHỌN GIỐNG CÂY CÓ MÚI NHÂN GIỐNG CÂY CÓ MÚI SẠCH BỆNH Chương trình nhân giống cây có múi sạch bệnh tập trung vào một số giống cam quýt đặc sản. Những giống này được bình tuyển qua các Hội thi và tuyển chọn cây cho quả ngon của các địa phương và Cục Khuyến nông Khuyến lâm. Các tiêu chuẩn cơ bản tuyển chọn bao gồm: - Đặc điểm nông học: Phải là cây đại diện cho giống + Về hình thái: * Chiều cao cây, chiều rộng tán lá, kiểu phân cành * Dạng lá, màu sắc lá, chiều dài, chiều rộng của lá + Về năng suất, phẩm chất: * Dạng quả, màu sắc vỏ, màu sắc ruột, khối lượng quả, số hạt, độ chua, độ đường - Khả năng chống chịu sâu bệnh: * Kháng được những sâu bệnh gì ? * Chống chịu được những sâu bệnh gì ? * Dễ nhiễm những sâu bệnh gì ? * Chịu được úng ngập, khô hạn, mặn, chua phèn ? Những cây có đầy đủ các đặc điểm của giống và được Hội đồng tuyển chọn cho điểm cao sẽ được chọn là cây đầu dòng ưu tú. Những cây này được cấp chứng chỉ và được cơ quan chuyên môn hướng dẫn kỹ thuật chăm sóc để lưu giữ nguồn gen. Từ những cây này, các cành chiết hoặc cành ghép sẽ được đưa về Viện nghiên cứu để lấy đỉnh sinh trưởng sử dụng kỹ thuật vi ghép tạo cây đầu dòng sạch bệnh (ký hiệu S o ) phục vụ cho công tác nhân giống sạch bệnh sau này. Một số giống cây có múi đặc sản ở miền Bắc Việt Nam: 1- Cam Sành: là giống quýt (King mandarin), dân ta quen gọi là cam, tuỳ vùng trồng lâu đời mà có các tên gọi sau: - Cam Sành Bố Hạ: trồng ở Bố Hạ, huyện Yên Thế, tỉnh Bắc Giang. Cam Sành Bố Hạ ưa đất phù sa cổ, khí hậu mát ẩm. Hiện nay vùng cam này đã bị xoá sổ do bệnh vàng lá greening. - Cam Sành Hà Giang - Tuyên Quang - Yên Bái: là vùng cam chủ yếu của các tỉnh phía Bắc. Cây cao trung bình, thích nghi rộng, năng suất cao. Cam Sành thu quả vào dịp Tết, khối lượng quả trung bình 150 - 250 g, ngon thơm ngọt đậm. 2- Cam Xã Đoài: nguồn gốc từ vùng Xã Đoài, huyện Nghi Lộc, Nghệ An. Đưa lên vùng núi cao, mã quả đẹp hơn. Cây cao trung bình, tán lá hơi xoè, thích nghi rộng. Năng suất cao, khối lượng quả trung bình 200 - 250 g/quả, có 18 - 22 hạt/quả, ngon thơm, thu hoạch vào tháng 12-1. 3- Cam Valencia: nhập vào Việt Nam từ năm 1971. Quả to hơn cam Hamlin, trung bình 250 g/quả. Khi chín vỏ quả có màu vàng, ruột màu vàng da cam. Hạt 0 - 3 hạt/quả. Chín muộn vào dịp Tết âm lịch. 4- Cam Ham Lin: là giống của Mỹ, (Hamlin là tên ông chủ vườn ở Mỹ), được đưa vào Việt Nam từ năm 1971 thông qua Cu Ba. Hamlin là giống chín sớm vào tháng 9 - 10, vỏ quả mỏng, khối lượng quả trung bình 200 g/quả, ngọt đậm, 0 - 5 hạt/quả. 5- Cam Sông Con: nguồn gốc chọn từ cây gieo hạt ở Nông trường Sông Con, Nghệ An. Cây cao trung bình, tán gọn, không có gai trên cành, thích nghi rộng. Năng suất trung bình, khối lượng quả trung bình 200 - 250 g/quả, có 3 - 5 hạt/quả, ngon thơm, thu hoạch vào tháng 10 - 11. 6- Cam Vân Du: được chọn lọc từ những cây gieo hạt của giống cam Sunkist ở Trại nghiên cứu cam Vân Du (Thanh Hoá), trồng nhiều ở các nông trường vùng Thanh - Nghệ - Tĩnh trong những năm 70 - 80. Cây cao trung bình, tán gọn có gai trên cành, thích nghi rộng. Năng suất cao, khối lượng quả trung bình 180 - 200 g/quả, có 10 - 15 hạt/quả, ngon thơm, thu hoạch vào tháng 10 - 11. 7- Cam Bù Hà Tĩnh: là giống quýt được trồng nhiều ở Nghệ An - Hà Tĩnh. Cây cao trung bình, khối lượng quả 180 - 220 g, có 3 - 12 hạt/quả, ngọt đậm. Quả chín vào tháng 12 - 1. 8- Quýt chum: được trồng nhiều ở Bắc Quang - Hà Giang. Cây cao trung bình, quả chín màu vàng đỏ, nặng 100 - 150 g/quả, có 3 - 5 hạt/quả, chín muộn vào tháng 12 - 1, ngọt mát, năng suất cao. 9- Cam Canh: là giống quýt đường (Citrus Reticulata Blanco), được trồng nhiều ở vùng Từ Liêm - Hà Nội và Hoài Đức - Hà Tây. Hiện nay đã được trồng ở nhiều nơi như Châu Giang - Hưng Yên, vẫn cho phẩm chất tốt. Cây cao trung bình 3 - 3,5 m; đường kính tán 3 - 4 m; phân cành thấp, lá không có eo, màu xanh đậm, tán cây có hình dù rộng. Ra hoa tháng 2 - 3. Thu hoạch vào tháng 11 - 12. Quả có hình cầu dẹt, khối lượng trung bình 100 - 140 g/quả. Quả khi chín có màu đỏ, vỏ mỏng, ruột vàng, ngọt đậm. 10- Bưởi Đoan Hùng: là giống bưởi ngọt được trồng lâu đời ở Đoan Hùng - Phú Thọ. Cây sinh trưởng khoẻ, cao trung bình 4 - 5 m; đường kính tán trung bình 4 - 6m; lá xanh vàng. Ra hoa tháng 2 - 3, quả chín vào tháng 10 - 11. Quả tròn, khối lượng trung bình 0,8 - 1,2 kg/quả. Vỏ quả mỏng khi chín có màu vàng; tép quả màu hung vàng, ăn có vị ngọt, thơm mát. 11- Bưởi Diễn: có nguồn gốc từ giống bưởi ngọt Đoan Hùng, được trồng lâu đời ở xã Phú Diễn - Từ Liêm - Hà Nội song chín muộn hơn, mã quả đẹp hơn và trở thành giống đặc sản của địa phương. Cây sinh trưởng khoẻ, cao trung bình 3 - 5m; đường kính tán trung bình 4 - 6 m; lá xanh vàng, eo lá hình tim bầu, đỉnh lá chia thuỳ rõ. Ra hoa tháng 2 - 3, quả chín vào tháng 11 - 12. Quả tròn hơi dẹt, khối lượng trung bình 0,8 - 1,2 kg/quả. Vỏ quả mỏng khi chín có màu vàng, tép quả màu hung vàng, khô, ăn có vị ngọt, thơm mát. 12- Bưởi Phúc Trạch: trồng lâu đời ở huyện Hương Khê - Hà Tĩnh. Cây sinh trường khoẻ, cao trung bình 3 - 5 m; đường kính tán trung bình 4 - 6 m. Ra hoa tháng 2 - 3, quả chín vào tháng 9 - 10. Quả tròn, khối lượng trung bình 1,0 - 1,5 kg/quả. Vỏ quả mỏng khi chín có màu vàng, tép quả màu hung vàng, khô, ăn có vị ngọt, thơm mát. Cây có múi là một trong những cây ăn quả có giá trị kinh tế cao. Hiện nay, nhiều diện tích trồng cây có múi đạt giá trị trên 50 triệu đồng /năm. Cá biệt có nơi đạt doanh thu trên 200 triệu đồng /ha như ở nông trường Cao Phong - Hoà Bình, Nông trường 19 - 5 tại Nghệ An Tuy nhiên ở một số địa phương do nhân giống bằng cành chiết hoặc mắt ghép trồng và quản lý vườn cây chưa khoa học nên năng suất, chất lượng tuổi thọ vườn cây thấp, thậm chí trồng sau một vài năm lại phải chặt bỏ. Từ năm 1997, Viện Bảo vệ thực vật đã ứng dụng kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng, kỹ thuật PCR, ELISA để chẩn đoán bệnh Greening và Tristeza đã làm sạch bệnh và lưu giữ trong nhà lưới chống côn trùng nhiều giống cây có múi phổ biến ở các tỉnh phía Bắc như: Bưởi Phúc Trạch, Bưởi Diễn, Bưởi Đoan Hùng, Cam Xã Đoài, Cam Sông Con, Cam Vân Du, Cam Valencia, Cam Bù, Cam Canh, Cam Sành, Quýt Bắc Sơn Đồng thời đã đề xuất và triển khai hệ thống nhà lưới 3 cấp sản xuất giống cây có múi sạch bệnh. Hệ thống này đang phát huy hiệu quả tại Hà Giang, Tuyên Quang và Nghệ An với công suất 135.000 cây /năm. Các kết quả nghiên cứu sản xuất giống sạch bệnh và phát triển các giống cây có múi đặc sản ở các địa phương của Viện bảo vệ thực vật trong những năm vừa qua dựa trên 5 tiến bộ kỹ thuật, bao gồm: 1. Qui trình kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trưởng để làm sạch bệnh Greening và các bệnh vi rút khác 2. Qui trình ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán bệnh Greeng và ELISA để chuẩn đoán bệnh Tristeza trên cây có múi 2.2 Quy trình chẩn đoán nhanh bệnh Tristeza bằng phương pháp ELISA Quy trình này gồm 6 bước: Bước 1: Chuẩn bị đĩa phản ứng. Bước 2: Chuẩn bị dịch chiết. Bước 3: Cho kháng thể. Bước 4: Cho chất tổng hợp. Bước 5: Pha viên phản ứng. Bước 6: Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA. (Giữa các bước đều phải rửa đĩa bằng dung dịch PBS) Kỹ thuật Elisa (Enzyme-linked Immunosorbent assay) (Còn gọi là kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn enzym) ĐN: Elisa là một kỹ thuật sinh hóa để xác định KN VSV hoặc KT đặc hiệu chống VSV trong mẫu xét nghiệm Ứng dụng: Là kỹ thuật có độ chính xác cao, nhanh, nhạy, dễ thực hiện nên được sủ dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng CNSH trong: y học, nông nghiệp, đặc biệt là trong các qui trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học Nguyên tắc: Dựa vào tính đặc hiệu của phản ứng KN-KT. Để phát hiện, KT thường được gắn với 1 enzyme nhất định (phosphataza kiềm, peroxidaza…) Nếu muốn định tính và định lƣợng KT đặc hiệu chống VSV trong các mẫu nghiên cứu 1. Nhỏ KN VSV đã biết cho gắn lên thành giếng, rửa nhẹ để loại bỏ KN không bám 2. Nhỏ tiếp huyết thanh bệnh nhân chứa KT cần xét nghiệm rồi. Ủ 5 phút. Nếu huyết thanh chứa KT đặc hiệu sẽ tạo phức KN-KT. Rửa nhẹ để loại bỏ những KT không đặc hiệu nên không bám 3. Nhỏ tiếp huyết thanh bệnh nhân chứa KT cần xét nghiệm rồi. Ủ 5 phút. Nếu huyết thanh chứa KT đặc hiệu sẽ tạo phức KN-KT. Rửa nhẹ để loại bỏ những KT không đặc hiệu nên không bám 4. Thêm cơ chất thích hợp với enzym. Enzym gắn với antiglobulin sẽ phân hủy cơ chất từ không có màu biến thành sản phẩm có màu. Đo cường độ màu ở bước sóng hấp thụ thích hợp (cường độ màu sẽ tỉ lệ thuận với lượng KT trong huyết thanh) 1 TIỂU LUẬN CÁC KỸ THUẬT ELISA 2 1. Đặt vấn đề: Trong các nghiên cứu thí nghiệm, thực nghiệm cũng như thực tế phát hiện và điều trị các bệnh lý trên người, động vật và thực vật, lĩnh vực chẩn đoán luôn đóng một vai trò thiết yếu. Trong số những kỹ thuật quan trọng trong chẩn đoán, không thể không kể đến ELISA. ELISA là kỹ thuật được sử dụng rất rộng rãi trong y dược, thú y và bệnh lý thực vật, và cho đến nay vẫn là một trong những phương pháp chẩn đoán quan trọng nhất trong miễn dịch học cũng như một số lĩnh vực khác. Qua quá trình phát triển, nghiên cứu và ứng dụng thực nghiệm, ELISA đã có nhiều cải tiến và biến đổi, phân thành nhiều kỹ thuật nhỏ nhằm phù hợp cho từng trường hợp, từng điều kiện, từng đối tượng cụ thể. Sự đa dạng của ELISA dẫn đến sự cần thiết phải có một cái nhìn tổng thể, bao quát và so sánh cụ thể từng biến thể của ELISA nhằm lựa chọn và sử dụng các kỹ thuật trên một cách phù hợp nhất cho từng hoàn cảnh. Đó chính là mục đích của bài viết này. 2. Tổng quan: Enzyme-linked immunosorbent assay, hay còn gọi là ELISA, enzyme immunoassay hay EIA là kỹ thuật chẩn đoán dựa trên miễn dịch học rất phổ biến trong rất nhiều lĩnh vực, từ y học, y dược, thú y, sinh học, kiểm định thực phẩm, môi trường v.v… ELISA phổ biến rộng rãi nhờ vào những đặc tính có lợi cho thực nghiệm của nó: dễ thực hiện, tốc độ nhanh, chi phí thấp, dễ sản xuất, an toàn với độ nhạy và độ đặc hiệu chấp nhận được. Tiền thân của ELISA là kỹ thuật miễn dịch học phóng xạ (radioimmunoassay – RIA), được phát triển bởi Rosalyn Sussman Yalow và Solomon Aaron Berson (xuất bản lần đầu tiên năm 1960; Nobel y học cho Rosalyn S. Yalow năm 1977). Mặc dù phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, tuy nhiên việc đánh đấu bằng phóng xạ yêu cầu kỹ thuật cao, phức tạp, tốn kém, cũng như việc sử dụng phải vô cùng cẩn thận vì khả năng gây nguy hiểm của phóng xạ đã đưa đến nhu cầu tìm kiếm các phương pháp cải tiến thay thế. Để thay cho việc sử dụng chất đánh dấu phóng xạ, người ta đã sử dụng kỹ thuật liên kết kháng nguyên hoặc kháng thể với một enzyme (enzyme-linked) có khả năng thực hiện một phản ứng nhận biết (ví dụ như gây đổi màu một chất). Quy trình liên kết enzyme được phát triển độc lập bởi Stratis Avrameas và G.B. Pierce. Bên cạnh đó, việc cần phải loại bỏ các kháng nguyên/kháng thể thứ cấp không gắn dẫn tới kỹ thuật cố định các kháng nguyên/kháng thể sơ cấp (immunosorbent) được công bố bởi Wide và Jerker Porath năm 1966. Năm 1971, hai nhóm nghiên cứu Peter Perlmann và Eva Engvall cùng với Anton Schuurs và Bauke van Weemen đã độc lập công bố các bài báo tổng hợp các kỹ thuật trên thành ELISA. 3. ELISA – nguyên lý cơ bản và các biến thể: 3.1. Nguyên lý cơ bản: Theo nguyên lý cơ bản của miễn dịch học, mỗi một kháng nguyên (antigen) có nhiều yếu tố kháng nguyên (epitope), mỗi một epitope có khả năng kết hợp với một kháng thể (antibody) tương ứng với nó. Hầu hết các kháng nguyên đều có một hoặc vài epitope đặc trưng cho nó, dựa trên đó mà người ta có thể xác định được kháng nguyên. Bên cạnh đó, sự xuất hiện của kháng nguyên trong cơ thể trong một số trường hợp có khả năng kích thích cơ thể tạo ra kháng thể đơn dòng đặc hiệu để chống lại kháng nguyên đó. Thông qua việc xác định kháng thể này người ta cũng có thể gián tiếp xác định kháng nguyên trong cơ thể. 3 Dựa trên cơ sở đó, kỹ thuật ELISA được thiết lập nhằm chẩn đoán sự hiện diện của một kháng nguyên hay kháng thể. Để xác định một yếu tố cần chẩn đoán (kháng nguyên/kháng thể) người ta sử dụng một hoặc nhiều yếu tố phát hiện (kháng thể/kháng nguyên/bổ thể) có phản ứng miễn dịch đặc hiệu với yếu tố cần chẩn đoán. Các yếu tố phát hiện này được đánh dấu bằng enzyme sao cho phản ứng miễn dịch với yếu tố cần chẩn đoán sẽ tạo nên sự thay đổi có thể nhận biết được bằng mắt thường hay thậm chí định lượng được bằng các công cụ so màu khác khi cho cơ chất của enzyme đánh dấu vào. 3.2. Các biến thể của ELISA: Mặc dù nguyên tắc của ELISA khá đơn giản, nhưng qua quá trình thực nghiệm sử dụng đã vấp phải khá nhiều vấn đề, từ các vấn đề về hiệu quả của phương pháp như độ nhạy, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện cho đến những vấn đề về thực nghiệm như thời gian thực hiện, độ phức tạp, chi phí cũng như khả năng hệ thống hóa thành bộ dụng cụ (KIT) để sản xuất công nghiệp. Chính vì vậy, người ta đã không ngừng cải tiến phương pháp này, đưa ra nhiều phương pháp mới phù hợp với từng điều kiện, từng đối tượng khác nhau. Cho đến nay, đã có rất nhiều biến thể đa dạng của ELISA. Tuy nhiên nhìn chung, tất cả các biến thể này có thể được phân loại như sau: • ELISA dị pha (heterogeneous), hay còn gọi là ELISA pha rắn (solid phase), gồm các phương pháp: - ELISA trực tiếp (direct ELISA) - ELISA gián tiếp (indirect ELISA) - ELISA sandwich - ELISA cạnh tranh (competitive ELISA) • ELISA đồng pha (homogeneous), gồm các phương pháp ELISA đồng pha cạnh tranh (competitive) và không cạnh tranh (non-competitive). Trong giới hạn bài viết này, chỉ có thể khái quát về phương pháp chung cho từng loại biến thể trên. Trong thực nghiệm chẩn đoán, cần có những điều chỉnh thích hợp đối với từng quy trình cụ thể cho từng đối tượng khác nhau. Các ký hiệu quy ước trong các phần sau: ] Bề mặt rắn Ag Kháng nguyên mẫu. Ở đây quy ước là những yếu tố cần xác định trong mẫu có mang các yếu tố kháng nguyên (epitope) và có thể là một loại kháng thể. Agc Kháng nguyên cạnh tranh Ab Kháng thể E Enzyme AAb Kháng kháng thể . Liên kết giữa chất cần đánh dấu và chất đánh dấu = Liên kết với bề mặt rắn – Liên kết miễn dịch 3.2.1. ELISA dị pha: Trong ELISA dị pha, các yếu tố cần chẩn đoán được tách ra khỏi hỗn hợp dung dịch mẫu bằng cách cố định lên một bề mặt rắn (có thể là nhựa, thủy tinh, giấy, màng nitrocellulose, agarose, polyacrylamide gel hay thậm chí vi khuẩn được cố định) tạo thành hai pha cố định và tự do, theo sau là môt bước loại bỏ pha tự do. Yếu tố phát hiện được thêm vào sau đó để phát hiện sự hiện diện của yếu tố cần chẩn đoán còn lại trên pha cố định thông qua hoạt tính của enzyme. Các phương pháp cố định các yếu tố lên bề mặt rắn và loại bỏ pha tự do sẽ được đề cập đến trong phần 4.1. 4 3.2.1.1. ELISA trực tiếp: Phương pháp này ít được sử dụng trong ELISA định lượng mà thường được sử dụng cho ELISA định tính. Yếu tố cần chẩn đoán (ví dụ như kháng nguyên) được cố định trực tiếp lên một bề mặt rắn và sau đó được xác định sự hiện diện bằng yếu tố phát hiện. Phương pháp có thể được mô tả tổng quát qua sơ đồ sau: ] = Ag + Ab . E → ] = Ag – Ab . E Phương pháp này có ưu điểm là chỉ cần một lần ủ do đó tiết kiệm thời gian và tối thiểu được việc kiểm soát các điều kiện trong quá trình thực hiện (thay đổi nhiệt độ và buffer cho mỗi lần ủ, tính thời gian…). Tuy nhiên, nhược điểm của nó là nhuộm màu nền (background staining) cao do sự liên kết không đặc hiệu của kháng thể với bề mặt rắn và các protein cố định trên bề mặt rắn. Việc đánh dấu từng loại kháng thể sử dụng cho mỗi kháng nguyên cũng khá tốn kém, nhất là khi phải chẩn đoán một số lượng lớn các loại kháng nguyên khác nhau. Ngoài ra, phương pháp này cũng có giới hạn phát hiện cao, và cần một lượng lớn các yếu tố cần chẩn đoán do sự liên kết kém hiệu quả của yếu tố này lên bề mặt rắn cũng như sự cạnh tranh của các protein khác trong quá trình phản ứng miễn dịch. 3.2.1.2. ELISA gián tiếp: Phương pháp ELISA gián tiếp tương tự như ELISA trực tiếp, nhưng ở đây người ta sử dụng tới hai lớp yếu tố phát hiện, và chỉ có lớp yếu tố phát hiện cuối cùng mới mang enzyme. Sơ đồ phương pháp gồm những bước như sau: ] = Ag + Ab + AAb . E → ] = Ag – Ab – AAb . E Ưu điểm của phương pháp này là chỉ cần tạo một loại kháng kháng thể mang enzyme để nhận biết cho nhiều kháng nguyên khác nhau. Kháng thể sơ cấp cũng là những protein, và cũng mang những epitope của riêng nó. Nếu nhiều loại kháng thể khác nhau được sản xuất từ cùng một loài sinh vật, tất cả các loại kháng thể này đều mang những epitope chung đặc trưng cho loài đó. Việc sản xuất một kháng kháng thể có khả năng liên kết với epitope đó là hoàn toàn có thể, thông qua việc tiêm các kháng thể trên vào một loài sinh vật khác. Phương pháp này cũng cho giới hạn phát hiện thấp hơn khoảng 10 lần so với ELISA trực tiếp, do khả năng liên kết nhiều kháng kháng thể lên một phân tử kháng thể sơ cấp, làm tăng số lượng enzyme được cố định. Tuy nhiên nhược điểm của nó là tăng số bước thực hiện do đó làm tăng việc kiểm soát các điều kiện quá trình và kéo dài thời gian chẩn đoán. Nhằm tăng khả năng phát hiện, người ta có thể sử dụng kỹ thuật nối cầu (brigde) bổ trợ cho ELISA gián tiếp. Về nguyên tắc, kỹ thuật brigde cũng tương tự như ELISA gián tiếp, nhưng ở đây sử dụng nhiều lớp yếu tố phát hiện hơn (trên hai lớp). Qua mỗi lớp yếu tố phát hiện, tín hiệu lại được khuếch đại lên vài lần. Tuy nhiên cần lưu ý là càng nhiều lớp yếu tố phát hiện, số bước thực hiện càng nhiều và sẽ kéo dài thời gian, tăng thêm việc kiểm soát điều kiện cho từng quá trình, cũng như tăng khả năng liên kết chéo giữa các yếu tố phát hiện với nhau. Các kỹ thuật brigde sẽ được liệt kê trong phần 4.2. 3.2.1.3. ELISA sandwich: Tương tự như ELISA trực tiếp và gián tiếp, trong phương pháp này yếu tố cần chẩn đoán cũng được cố định lên bề mặt rắn. Tuy nhiên việc cố định này không được thực hiện trực tiếp mà thông 5 qua liên kết miễn dịch với một yếu tố phát hiện (thường là kháng thể) đã được gắn cố định sẵn trên bề mặt rắn. Sơ đồ tổng quát như sau: ] = Ab1 + Ag + Ab2 . E → ] = Ab1 – Ag – Ab2 . E Sau khi bắt giữ yếu tố cần chẩn đoán, lúc này phương pháp quay lại tương tự như ELISA trực tiếp và gián tiếp sau khi đã cố định yếu tố cần chẩn đoán. Người ta có thể sử dụng một kháng thể liên kết enzyme để xác định trực tiếp yếu tố trên (như ELISA trực tiếp), hoặc cũng có thể dùng một trong số các phương pháp brigde của ELISA gián tiếp. Bên cạnh kháng thể người ta cũng có thể cố định một số yếu tố khác lên mặt rắn như Clq, receptor, lectin… [...]... brigde trong ELISA gián tiếp: Kỹ thuật brigde có thể hiểu đơn giản là kỹ thuật liên kết giữa yếu tố cần chẩn đoán và yếu tố phát hiện mang enzyme thông qua nhiều lớp yếu tố phát hiện trung gian Các kỹ thuật brigde không chỉ giới hạn trong ELISA gián tiếp mà có thể dùng cho các phương pháp khác như ELISA sandwich hay ELISA cạnh tranh Có ba phương pháp brigde chính thường sử dụng trong ELISA: 4.2.1 Brigde... kháng nguyên cạnh tranh có thể được đánh dấu với enzyme, cơ chất của enzyme, cofactor, inhibitor, v.v… Còn về mặt biến đổi hoạt tính enzyme có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng, sẽ được điểm qua trong phần 4.3 4 Các biến thể trong các kỹ thuật bổ trợ khác cho ELISA: Trong phần này sẽ đề cập đến một số kỹ thuật bổ trợ khác trong các phương pháp kể trên của ELISA Các kỹ thuật này không nhất thiết... đối với hai loại bệnh có mức độ nguy hiểm như nhau, tuy nhiên một loại bệnh có tỉ lệ mắc trong dân cư thấp, thì yêu cầu phải tăng độ đặc hiệu nhằm giảm số lượng những ca chẩn đoán nhầm Sau khi xác định được độ nhạy và độ đặc hiệu cần thiết, việc lựa chọn một kỹ thuật hay một phương pháp có các thông số tương thích cũng là một vấn đề không dễ dàng Độ nhạy và độ đặc hiệu của một kỹ thuật hay một phương... tiến và nhiều phương pháp khác nhau tiếp tục ra đời nhằm hoàn thiện và tối ưu hóa kỹ thuật này trong từng trường hợp cụ thể Qua những phương pháp và kỹ thuật tổng quát nhất được thảo luận trên đây, 16 chúng ta có thể thấy được phần nào sự đa dạng của kỹ thuật ELISA Sự đa dạng này cho phép có nhiều lựa chọn hơn trong sử dụng ELISA, tuy nhiên nó cũng yêu cầu người thực hiện càng cần phải nắm rõ tất cả các... nhạy và độ đặc hiệu Nền tảng của kỹ thuật ELISA dựa trên liên kết miễn dịch đặc hiệu, do đó việc có được kháng thể đặc hiệu với một yếu tố là điều tiên quyết trong ELISA Đây là nguyên nhân chính yếu và quan trọng nhất khiến ELISA hay một số phương pháp trong ELISA không thể sử dụng được trong một số trường hợp, ví dụ như phân biệt các subtype của một số vi khuẩn và virus Thời gian thực hiện xét nghiệm... xét nghiệm Về phương diện này, ELISA có ưu điểm là rất đa dạng về phương pháp, cho phép nhiều lựa chọn trong thực tiễn 6 Kết luận: Mặc dù đã có sự xuất hiện của nhiều phương pháp mới, ELISA cho đến nay vẫn là một trong những kỹ thuật quan trọng nhất trong miễn dịch học và nhiều lĩnh vực khác, nhờ vào tính đơn giản, nhanh chóng, khá đặc hiệu và giá thành thấp Chính vì vậy, ELISA đã không ngừng được cải... hiện xét nghiệm cũng là yếu tố rất quan trọng trong thực tiễn Mặc dù ELISA là kỹ thuật có thời gian thực hiện khá nhanh, tùy theo xét nghiệm có thể từ khoảng một tiếng cho đến vài ngày nếu sử dụng các bộ KIT ELISA chuẩn bị sẵn, tuy nhiên do yêu cầu thực tế, đôi khi thời gian xét nghiệm này vẫn chưa thích hợp, buộc người ta phải lựa chọn các kỹ thuật khác nhanh hơn dù tốn kém hơn Giới hạn phát hiện của... này cần có những thiết kế chính xác về cấu trúc không gian của các thành phần, một yêu cầu khá phức tạp, tốn kém, hầu hết chỉ có thể áp dụng được với các kháng nguyên nhỏ và gây rất nhiều hạn chế trong việc sản xuất các thành phần của một phản ứng ELISA Đây cũng là yếu tố chính đã giới hạn rất lớn kỹ thuật ELISA đồng pha Ngoài ra, kết quả có thể bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố khác trong mẫu có khả năng... advidin sẽ đóng vai trò tương tự như inhibitor trong phương pháp trên đối với các enzyme chứa biotin Hình 8: Phương pháp của Bacquet và Twumasi (1984) Agc X + Ag Agc Ag Agc X + Ag Agc Ag Biotin X Avidin Cofactor 15 5 Lựa chọn phương pháp ELISA thích hợp: Việc lựa chọn ELISA trong số rất nhiều kỹ thuật chẩn đoán cũng như việc lựa chọn phương pháp thích hợp nhất của ELISA để dùng vào một xét nghiệm phụ thuộc... trong các phương pháp kể trên của ELISA Các kỹ thuật này không nhất thiết cố định cho từng loại ELISA mà có thể kết hợp tự do tùy theo nhu cầu và thiết kế của thí nghiệm chẩn đoán 4.1 Các kỹ thuật cố định các yếu tố miễn dịch lên bề mặt rắn trong ELISA dị pha: Chọn lựa bề mặt rắn thích hợp là nhân tố quan trọng trong việc cố định các yếu tố miễn dịch Một bề mặt rắn cần thõa mãn các yêu cầu sau: Khả năng . Đo cường độ màu ở bước sóng hấp thụ thích hợp (cường độ màu sẽ tỉ lệ thuận với lượng KT trong huyết thanh) 1 TIỂU LUẬN CÁC KỸ THUẬT ELISA . định hoặc thay đổi pH. 4.1.1.2. Cố định bằng liên kết cộng hóa trị: Phương pháp này rất thuận tiện cho việc sản xuất một lượng lớn bề mặt rắn tráng các yếu tố miễn dịch, cũng như cần thiết