Miễn dịch thực vật MỘT SỐ BỆNH ĐẠI DIỆN 1. Bệnh đạo ôn (tham khảo giáo trình bệnh cây nông nghiệp) Bệnh đạo ôn là bệnh quan trọng nhất trên lúa trên thế giới và ở Việt Nam. 1.1. Triệu chứng Nấm có thể xâm nhiễm gây bệnh tất cả các bộ phận trên mặt đất gồm lá, đốt thân, cổ bông, cổ gié. Các nghiên cứu gần đây cho thấy mức độ mẫn cảm của lá tỷ lệ thuận với mức độ mẫn cảm trên cổ bông. Tính mẫn cảm của cây đối với nấm phụ thuộc nhiều yếu tố môi trường cũng như các yếu tố liên quan đến phát triển của cây. Tính mẫn cảm thường giảm theo tuổi cây và tuổi lá; tính mẫn cảm tăng mạnh khi bón thừa đạm. Trái lại bón Si làm giảm tính mẫn cảm. Ngoài ra, đặc điểm vết bệnh thay đổi đáng kể theo mức độ mẫn cảm: Vết bệnh điển hình có hình elip hoặc thoi xuất hiện 5-7 ngày sau lây bệnh. Biểu hiện của vết bệnh thay đổi phụ thuộc theo giống: từ màu lục nhạt + vết bệnh phát triển (mẫn cảm) tới màu lục đậm với viền vết bênh màu nâu (tính kháng tập nhiễm cục bộ). 1.2. Tác nhân gây bệnh: Nấm gây bệnh có tên giai đoạn vô tính là Pyricularia oryzae (syn. Piricularia oryzae). Giaiđoạn hữu tính của nấm đã được đặt tên là Magnaporthe grisea và gần đây (2004), dựa vào các nghiên cứu phân tử, được đặt tên lại là M. oryzae. Nấm thuộc lớp nấm túi (Ascomycetes), tuy nhiên ngoài tự nhiên nấm chỉ sinh sản vô tính tạo cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh không màu, 2 vách ngăn, hình quả lê (hoặc nụ sen). 1.3. Xâm nhiễm gây bệnh. Nấm đạo ôn là nấm bán sinh dưỡng (hemibiotroph) với pha sinh dưỡng biotroph ở giai đoạn sớm của quá trình xâm nhiễm. Giai đoạn sớm của quá trình xâm nhiễm bao gồm pha tiền xâm nhập (prepeneration): bào tử nấm tiếp xúc trên bề mặt lá, đỉnh bào tử nứt vỡ và tiết ra một giọt chất nhầy gắn kết chặt bào tử và bề mặt lá. Lớp chất nhày này chứa các hợp chất cacrbonhydrate và glycoprotein. Tiếp theo, bào tử nấm nảy mầm tạo ống mầm, hình thành một tế bào ở đỉnh ống mầm và phát triển thành vòi áp (appressorium). Vòi áp của nấm là một cấu trúc dạng vòm, có vách dày, mầu đậm do bị melanin hóa. Sự melanin hóa làm vách vòi áp trở nên chắc chắn hơn. Bên trong vòi áp, nấm tích lũy nhiều glycerol và do vậy áp lực trương của vòi áp nấm đạo ôn rất lớn, có thể tới 80 at. Tiếp theo quá trình tiền xâm nhập là xâm nhập của bào tử: Từ vòi áp sẽ hình thành một sợi nấm nhỏ gọi là đễ xâm nhập (infection peg) để xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin và vào bên trong tế bào biểu bì. Bên trong tế bào biểu bì, đỉnh đế xâm nhập sẽ phình to tạo 1 thành vòi hút (haustorium). Nấm sẽ tiết các enzyme và effector qua màng vòi hút vào tế bào chất của tế bào ký chủ và hấp thụ dinh dưỡng. Trong quá trình dinh dưỡng, vách tế bào ký chủ dần dần sụp đổ và nấm tiếp tục phát triển sang tế bào bên cạnh (thông qua sợi liên bào) và lại tiếp tục hình thành vòi hút ở tế bào mới bị xâm nhập. Nhiều yếu tố dẫn truyền tín hiệu tham gia vào quá trình nhận biết và hình thành vòi áp của nấm P. oryzae. Sự hình thành vòi áp chỉ xuất hiện trên bề mặt cứng (như bề mặt lá). Hai yếu tố chính tham gia vào quá trình dẫn truyền tín hiệu để hình thành vòi áp là chất lượng và bản chất hóa học của sự gắn kết. Bề mặt bào tử nấm có chứa một lớp protein gọi là hydrophobin (Mpg1 protein) với phía ưa nước hướng vào tế bào nấm và phía ghét nước hướng về bề mặt của lá. Lớp hydrophobin giúp bào tử nhận biết được bề mặt ghét nước của lá và có vai trò quan trọng trong hình thành vòi áp. Một số gen của nấm (vd MagA, MagB) cảm ứng hình thành cAMP (cyclic adenosine monophosphate), một phân tử dẫn truyền tín hiệu kích thích hình thành vòi áp. 1.4. R và Avr proteins Hiện có khoảng 40 gen kháng chủ đối với nấm P.oryzae đã được xác đinh trên lúa với khoảng gần 10 gen đã được clon. Trong số các gen này, Pi-ta là gen kháng được nghiên cứu nhiều nhất. Pi-ta là gen nằm ở vùng trung tâm của nhiễm sắc thể số 12. Protein Pi-ta là một protein (928 aa) kháng R thuộc lớp CNL (CC-NB-LRR) hoạt động tại tế bào chất. Vùng lặp giàu leucine (LRR) của Protein Pi-ta tương tác trực tiếp với AvrPi-ta để tạo tính kháng. Các allen pi-ta (lặn) ở các giống nhiễm bệnh mã hóa cho một protein chỉ khác 1 aa so với allen Pi-ta (trội). Các gen kháng như Pi-ta 2 là gen allen của Pi-ta Nấm M. oryzae tao ra 3 nhóm Avr protein có thể được nhận biết ở mức đặc hiệu giống, trong đó quan trọng nhất là AvrPita protein. AvrPita gen nằm ở gần đầu nhiễm sắc thể của nấm và mất đỉnh nhiễm sắc thể nấm (chứa AvrPita gen) là một cơ chế dẫn tới nấm có khả năng gây bệnh. AvrPita có bản chất protease và tương tác với protein kháng tương ứng của ký chủ là Pita protein. Tương tác giữa AvrPita và Pita là tương tác trực tiếp. 1.4.1. Đa dạng của nấm/ Bộ giống chỉ thị Nấm Pyricularia oryzae được xem là một quần thể không đồng nhất. Dựa trên các phân tích phân tử, nhìn chung nấm được phân nhóm trên cở sở phân bố địa lý (vd nhóm châu Mỹ, châu Âu, Nhật bản, Iran…). Nhìn chung, các quần thể nấm thuộc các khu vực khởi nguyên cây lúa (chẳng hạn ở khu vự dãy Hymalaya, hoặc Đông Nam Á) có mức độ đa dạng cao hơn. Thông tin về mức độ đa dạng di truyền của bất kỳ quần thể tác nhân gây bệnh nào đều cần thiết cho các chương trình chọn tạo giống kháng bệnh. Đối với nấm đạo ôn, vào năm 1967, IRRI đã thiết lập một hệ thống phân biệt các chủng sinh lý race/pathotype của nấm dựa trên một bộ giống chỉ thị gồm 8 giống, theo thứ tự là: Raminad, Zenith, NP-125, Usen, Dular, Kanto 51, Sha-tiao-tsao, Caloro. Hệ thống phân biệt các race nấm này vẫn được sử dụng tại nhiều nước trên thế giới. 2 Các race nấm, được thử tính gây bệnh trên bộ giống này, sẽ được ký hiệu như sau: I (từ international); tiếp theo là 1 trong các chữ A, B, C, D, E, F, G, H, (mỗi chữ đại diện cho một giống chỉ thị và tương ứng với giống mẫn cảm đầu tiên khi thử trên tám giống theo thứ tự ở trên); cuối cùng là một số chỉ kiểu tính độc. Ví dụ một isolate nấm có phản ứng S, R, R, R, R, R, R, R (S = susceptible, R = resistant) có ký hiệu là IA. Dựa vào hệ thống này, tối đa 256 nhóm chủng (2 8 ) có thể được phân biệt, trong đó lần lượt 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2 và 1 nhóm chủng ở các nhóm chủng IA, IB, IC, ID, IE, IF, IG và IH. Tuy nhiên vì bộ giống chỉ thị này chỉ chứa ít gen kháng (khoảng 5 gen) nên không thể đánh giá được mức độ đa dạng của nấm. Hiện nay, ngoài bộ giống chỉ thị trên, các nước đều phát triển bộ giống chỉ thị riêng, đặc biệt sử dụng các dòng gần đẳng gen (near isogenic lines) chứa 1 hoặc vài gen kháng. 1.5. Quần thể nấm P. oryzae tại miền Bắc Việt Nam Sử dụng kỹ thuật AFLP, Nguyễn Thị Ninh Thuận (2006) đã nghiên cứu mức độ đa dạng và tính gây bệnh của 114 isolates nấm thu thập tại nhiều tỉnh thuộc đồng bằng sông Hồng. Nghiên cứu này cho thấy: • Quần thể nấm P. oryzae tại đồng bằng sông Hồng có tính đa dạng cao gồm 7 nhóm VNG1, VNG2, , VNG7. • Quần thể nấm phân lập trên các giống lúa tẻ khác quần thể nấm phân lập trên các giống lúa nếp. Quần thể nấm trên lúa tẻ gồm 4 nhóm VNG1, VNG2, VNG3 và VNG4, còn trên lúa nếp gồm 3 nhóm VNG 5, VNG6 và VNG7. • Các nhóm VNG1, VNG3, VNG 4 chiếm ưu thế với VNG1 chiếm tới hơn 50%. • Nhiều giống chỉ thị mang nhiều gen kháng có thể chống được quần thể nấm P. oryzae của miền Bắc (ví dụ giống Morobenekan mang các gen kháng Pi-7(t), Pi-10(t), Pi- 12(t), Pi-44(t), Pi-157), tuy nhiên không thể biết được gen nào điều khiển tính kháng. Dựa trên phản ứng của đại diện các nhóm đối với các giống chỉ thị có số lượng gen kháng ít, các gen kháng sau nên được sử dụng để tạo giống kháng nấm đạo ôn ở miền Bắc: Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-ta 2 , Pi-k. 1.6. Các giống kháng nhiễm Việt Nam thuộc khu vực khởi nguyên của cây lúa với tập đoàn giống phong phú. Nhiều giống cổ truyền của Việt Nam mang các gen kháng bệnh đạo ôn quí. Hiện nay, Việt Nam có ít nhất 1 giống lúa cổ truyền là Tetep đang được nhiều nước sử dụng (thông qua IRRI) làm vật liệu nghiên cứu tính kháng. Tetep là một giống có tính kháng cao đối với rất nhiều chủng đạo ôn; một số gen kháng đã được xác định trên giống này như Pi-3(t), Pi-ta, Pi-ta 2, Pi-tp(t). Ở Việt Nam, một số giống lúa kháng đạo ôn đã được tạo ra như C70, C71, IR1820, X20, X21. Hiện nay, một số giống lúa trồng phổ biến ở miền Bắc có chất lượng và năng suất tốt như Khang Dân 18, Bắc Thơm số 7, Hương Thơm số 1, Nếp IR352… đều nhiễm nấm đạo ôn. 3 2. Bệnh bạc lá (tham khảo giáo trình bệnh cây nông nghiệp) Bệnh bạc lá là bệnh vi khuẩn nguy hiểm nhất trên lúa. Bệnh phân bố ở tất cả các nước trồng lúa nhiệt đới và ôn đới. Tại Việt Nam, bệnh xuất hiện nặng trên lúa mùa và đặc biệt nghiêm trọng trên các giống lúa lai Trung Quốc. 2.1. Tác nhân gây bệnh. Bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra. Vi khuẩn lúc đầu được đặt tên là Bacillus oryzae, đổi tên thành X. oryszae (năm 1922). Năm 1978, vi khuẩn được đặt lại tên là Xanthomonas campestris pv. oryzae và vào năm 1990, vi khuẩn được phân loại lại với tên hiện đang được sở dụng là Xoo. Xo là vi khuẩn gram (-) hình gậy, 2 dầu tròn, kích thước (0.7-2) x (0.4-0.7), vi khuẩn di động với một lông roi. Khuẩn lạc trên môi trường nhân tạo tròn, lồi, nhầy, màu vàng (do hình thành sắc tố xanthomonadin). Xo tạo nhiều polysacharide ngoại bào EPS (= extracellualar polysacharide), có vai trò quan trọng trong việc hình thành giọt dịch vi khuẩn trên lá bệnh, bảo vệ vi khuẩn khỏi bị khô và tạo điều kiện cho vi khuẩn phát tán nhờ gió, mưa. Vi khuẩn hảo khia bắt buộc, không hình thành bào tử, nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 25-30 O C. 2.2. Xâm nhiễm gây bệnh Xoo xâm nhập vào lá qua thủy khổng ở mép lá và chót lá là chủ yếu. Vi khuẩn trên bề mặt lá có thể di chuyển trên màng nước (nhiều vào ban đêm) để xâm nhập vào thủy khổng. Sau khi xâm nhập vào bên trong, vi khuẩn nhân lên trong khoảng gian bào ở underlying epitheme, tiếp theo, chúng xâm nhập và lan truyền trong lá theo mạch xylem. Vi khuẩn cũng có thê xâm nhập vào xylem qua tổn thương cơ giới hoặc lỗ mở khi rễ mới hình thành ở gốc bẹ lá. Bên trong xylem, vi khuẩn di chuyển theo chiều dọc theo gân chính của lá nhưng cũng có thể từ xylem, di chuyển sang 2 bên. Trong vòng vài ngày, tế bào vi khuẩn và EPS lấp đầy mạch xylem và tiết dịch vi khuẩn qua thủy khổng thành giọt dịch hoặc sợi dịch vi khuẩn (dấu hiệu đặc trưng của bệnh và là nguồn bệnh thức cấp quan trọng). (Phân biệt với đốm sọc vi khuẩn (Xoc) : Xoc xâm nhập chủ yếu qua khí khổng, nhân lên trong substomatal cavity), sau đó phát triển trong gian bào của nhu mô. 2.3. R và Avr gen Các gen kháng lúa đã được bắt đầu nghiên cứu tại Nhật và IRRI khảng 30 năm trước đây. Tạo giống kháng mang gen kháng chủ là cách phòng chống hiệu quả nhất đối với bệnh bạc lá. Cho tới nay (tính tới 2007), khoảng 29 gen kháng Xoo (ký hiệu từ Xa21 tới Xa29) đã được khám phá trên lúa, trong số đó, 19 là gen kháng trội. Sáu gen (Xa1, Xa5, Xa21, Xa26 và Xa27) đã được phân lập và giải trình tự. Trong số 6 gen này, 2 gen Xa21 và Xa26 có đặc điểm giống như các receptor. Một số gen Xa quan trọng là : Xa21. Đây là gen đầu tiên trong số các gen kháng được phân lập trên lúa. Xa21 được phân lập đầu tiên từ cây lúa dại Oryzae longistaminata, tiếp theo được chuyển vào giống IR24 để tạo ra dòng gần đẳng gen IRBB21. Xa21 là một protein xuyên màng giống như receptor bề mặt có cấu tạo gồm một đầu LRR bên ngoài màng có chức năng nhận 4 biết, một phần xuyên màng và một đầu có hoạt tính kinase có chức năng truyền tín hiệu. Xa21 là một gen kháng chủ, trội, phổ rộng chống nhiều chủng Xoo (ít nhất đã được chứng minh trên nhiều chủng của Ấn Độ, Philippin). Ngoài ra Xa21 có khả năng kháng cao và đặc hiệu đối với các chủng Xoo thuộc race 1 của Nhật Bản và được sử dụng rộng rãi trong các chương trình tạo giống kháng bạc lá ở Nhật. Xa21 sẽ được biểu hiện khi lây nhiễm nhân tạo Xoo hoặc khi gây tổn thương cơ giới trên cây. Xa21 là một gen R qui định tính kháng vào giai đoạn trưởng thành của cây lúa. xa5. Đây gen kháng lặn, qui định tính kháng phổ rộng (ít nhất đã được chứng minh trên nhiều race Xoo của Philippin và Việt Nam). xa5 mã hóa tiểu phần γ của yếu tố phiên mã TFIIA (yếu tố phiên mã hoàn chỉnh ký hiệu là TFIIAγ). Tính kháng lặn của xa5 có thể được giải thích như sau : xa5 và Xa5 mã hóa các isoform của TFIIAγ (chỉ khác nhau ở aa số 39) và do đó có ái lực liên kết khác nhau với vùng hoạt hóa phiên mã (Activated Domain – AD) của AvrXa5 của vi khuẩn (AvrXa5 là một Avr thuộc họ AvrBs3 của vi khuẩn, chương 4). AvrXa5 liên kết với isoform TFIIAγ Xa5 (gen trội trên giống nhiễm) dẫn tới hoạt hóa các gen của ký chủ có lợi cho sự gây bệnh. Trái lại AvrXa5 không liên kết với isoform TFIIAγ xa5 (gen lặn trên giống kháng) dẫn tới các gen của ký chủ có lợi cho sự gây bệnh không được biểu hiện, hậu quả là cây kháng bệnh. Xa1. Đây là gen kháng trội thuộc nhóm NBS-LRR. Xa1 có đặc điểm cấu trúc và chức năng tương tự gen RPS2 trên cây Arabidopsis, gen N trên cây thuốc lá và gen L6 trên cây lanh. Tổn thương cơ giới và sự nhiễm bệnh do Xoo cảm ứng biểu hiện gen Xa1. Xa1 qui định tính kháng cao nhưng phổ hep, chống được các chủng thuộc race1 cua Nhật. Xa27. Đây là gen kháng phổ rộng chống được nhiều chủng Xoo. Tính kháng của Xa27 di truyền theo kiểu bán trội. Các allen của locus Xa27 mã hóa cho các protein đồng nhất (có nghĩa protein Xa27 giống hệt protein xa27). Điều này cho thấy sự khác nhau về tính kháng ở cây Xa27 và tính mẫn cảm ở cây xa27 là do sự khác nhau về trình tự nts trên vùng promotor của gen Xa27/xa27. Người ta đã chứng minh bằng thực nghiệm là chỉ gen Xa27 được biểu hiện khi nhiễm với Xoo mang gen AvrXa27 (là một Avr thuộc họ AvrBs3 của vi khuẩn, chương 4). AvrXa27 tương tác vơí vùng promotor của gen Xa27, kích hoạt sự biểu hiện của gen này và dẫn tới tính kháng. 2.4. Đa dạng của vi khuẩn Xoo Vi khuẩn Xoo có tính đa dạng cao. Tới nay (2007), khoảng 30 race vi khuẩn đã được công bố từ nhiều nước trên thế giới dựa vào đặc tính gây bệnh trên các bộ giống chỉ thị hoặc dựa vào các nghiên cứu phân tử. Tuy nhiên, vì được đánh giá độc lập nên các race từ các nước không giống nhau (mặc dù có thể chung ký hiệu). Ví dụ các isolates Philippin được chia thành 10 race (ký hiệu là race 1, 2 10) còn các isolates của Trung Quốc được chia thành 9 races (cũng ký hiệu là race 1, 3, 3 9) và các race của Trung Quốc không tương ứng với các race của Philippin. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, mặc dù có sự di chuyển của vi khuẩn từ vùng này sang vùng khác nhưng nhìn chung có sự khác nhau giữa quần thể Xoo của các nước. Điều này dẫn tới việc nghiên cứu mức độ đa dạng của mỗi nước/vùng sinh thái là cần thiết trước khi thực hiện các chương trình chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá. Các bộ giống chỉ thị hiện nay đang sử dụng phổ biến gồm các giống/dòng gần đẳng gen (near isogenic lines) chứa một gen kháng (single gene) hoặc vài gen (pyramid line). Ví dụ 5 các giống/dòng chỉ thị và gen kháng tương ứng trình bày ở Bảng 1. Tuy nhiên vì các dòng đa gen (pyramid) thường biểu hiện tính kháng với hầu hết các chủng nên ít có giá trị trong phân biệt các chủng. Bảng 1. Các dòng chỉ thị đẳng gen mang 1 hoặc vài gen kháng vi khuẩn bạc lá Xoo. Dòng Gen kháng 1 IR24 - 2 IRBB1 Xa1 3 IRBB2 Xa2 4 IRBB3 Xa3 5 IRBB4 Xa4 6 IRBB5 xa5 7 IRBB7 Xa7 8 IRBB8 Xa8 9 IRBB10 Xa10 10 IRBB11 Xa11 11 IRBB13 xa13 12 IRBB14 Xa14 13 IRBB21 Xa21 14 IRBB50 Xa4 + xa5 15 IRBB51 Xa4 + xa13 16 IRBB52 Xa4 + Xa21 17 IRBB53 xa5 + xa13 18 IRBB54 xa5 + Xa21 18 IRBB55 xa13 + Xa21 20 IRBB56 Xa4 + xa5 + xa13 21 IRBB57 Xa4 + xa5 + Xa21 22 IRBB58 Xa4 + xa13 +Xa21 23 IRBB59 Xa5 + xa13 + Xa21 24 IRBB60 Xa4 + xa5 + xa13 + Xa21 2.5. Đa dạng của Xoo tại Việt Nam Nghiên cứu hợp tác giữa trường ĐHNNI và ĐH Kyushu Nhật Bản trong giai đoạn 2001- 2005 dựa trên phản ứng kháng nhiễm đối với 11 dòng đẳng gen mang gen kháng đơn (dòng số 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 12, 13, bảng trên) cho thấy quần thể Xoo ở các tỉnh phía bắc Việt Nam khá đa dạng gồm 12 race (chú ý, một số nước dùng bộ dòng đẳng gen tương tự cũng phát hiện thấy mức đa dạng khá lớn; chẳng hạn ở Nepal là 26 races; Srilanka là 14). Các race chiếm ưu thế tại miền Bắc Việt Nam, theo thứ tự, là các race 5 (gen kháng: xa5, Xa7 và Xa21), race 3 (gen kháng: Xa4, xa5, Xa7 và Xa21) và race 2 (gen kháng: Xa4, xa5, Xa7, Xa14 và Xa21). 2.6. Các giống kháng nhiễm tại Việt nam Một số giống lúa cổ truyền của Việt Nam như Tẻ tép, tám có tính kháng cao. Các giống lúa lai Trung Quốc như Nhị ưu-838; Tạp giao 1 và Tạp giao 5 nhiễm bệnh bạc lá rất cao. 6 3. Bệnh xoăn lá cà chua (Begomovirus) Bệnh xoăn lá cà chua được ghi nhận đầu tiên trên thế giới từ cuối những năm 40 tại Israel. Bệnh đã được phát hiện tại vùng Đông Nam Á, châu Phi và châu Âu vào những năm 80. Bệnh lần đầu tiên được công bố tại châu Mỹ vào năm 1993. Hiện nay, bệnh xoăn vàng lá đã trở thành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp thế giới. 3.1. Triệu chứng bệnh Bệnh xoăn vàng lá xuất hiện triệu chứng trong vòng 2-4 tuần sau khi nhiễm bệnh và phát triển đầy đủ triệu chứng trong vòng 2 tháng. Triệu chứng có thể thay đổi theo điều kiện môi trường, giai đoạn sinh trưởng và điều kiện sinh lý của cây tại thời điểm nhiễm bệnh. Triệu chứng sớm nhất là lá cong xuống dưới vào phía bên trong. Về sau, lá không có hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chót lá lan vào giữa gân; lá cuốn cong lên phía trên thành hình thuyền; lá non biến vàng mạnh, giòn và nhỏ hẹp. Cuống lá có thể xoắn vặn. Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ, đốt thân ngắn. Cây nhiễm sớm thường không ra quả do hoa bị rụng Triệu chứng do các loài begomovirus khác nhau gây ra trên cà chua thường tương tự nhau. 3.2. Nguyên nhân gây bệnh 3.2.1. Tác nhân gây bệnh là một phức hợp loài Trước những năm 90, tác nhân gây bệnh xoăn vàng lá cà chua đã được xác định do các begomovirus (chi Begomovius, họ Geminiviridae) truyền qua bọ phấn (Bemisia tabaci) gây ra. Các begomovirus gây bệnh thường được đặt tên theo cây ký chủ (tomato) và triệu chứng (chủ yếu dưới 2 dạng xoăn lá (leaf curl) và biến vàng (yellow)) nên tên virus gây bệnh thường là “Tomato yellow leaf curl virus” và tên các isolate virus gây bệnh thường được kèm theo 1 từ chỉ địa phương nơi bệnh xuất hiện; ví dụ Tomato yellow leaf curl - Is (TYLCV-Is) phân lập từ Israel, Tomato yellow leaf curl – Th (TYLCV- Th) phân lập từ Thái Lan Do có ít lựa chọn trong việc đặt tên, các tác giả cũng có xu hướng lấy chỉ triệu chứng xoăn lá “leaf curl” để đặt tên virus; chẳng hạn Tomato leaf curl virus-Au (ToLCV-Au) phân lập từ Úc. Tomato leaf curl Guzarat virus (ToLCGV) mặc dù các virus này đều tạo triệu chứng biến vàng trên cà chua. Từ những năm 90 trở lại đây, sự tiến bộ của công nghệ sinh học đã cho phép giải trình tự toàn bộ bộ gen virus một cách dễ dàng. Dựa vào các phân tích phân tử, Ủy ban Phân loại Virus Quốc tế (International Committee on Taxonomy of Viruses -ICTV) đã xác định ngưỡng phân biệt loài begomovirus là 89 % tương đồng chuỗi nucleotide cho DNA-A. Chỉ tiêu này đã cho phép tách được nhiều begomovirus, vốn được xem là các isolate khác nhau của cùng một loài gây bệnh xoăn vàng lá cà chua, thành các loài phân biệt; ví dụ TYLCV-Ch trở thành loài Tomato yellow leaf curl China virus (TYLCCNV), TYLCV-Th trở thành loài Tomato yellow leaf curl Thailand virus (TYLCSV) và isolate TYLCV-Is phân lập từ Israel, do quyền ưu tiên, được công nhận là loài Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). Tương tự, Tomato leaf curl virus – Taiwan (ToLCV-TW) trở 7 thành loài Tomato leaf curl Taiwan virus (ToLCTWV) và isolate ToLCV-Au phân lập đầu tiên từ Úc, do quyền ưu tiên, được công nhận là Tomato leaf curl virus (ToLCV) Như vậy, tác nhân gây bệnh xoăn vàng lá cà chua được xem là một phức hợp các loài khác nhau. Hiện có khoảng 40 loài begomovirus hại cà chua đã được công bố trên thế giới với triệu chứng không thể phân biệt được. Hậu quả là, dựa trên triệu chứng quan sát, bệnh không thể được gán cho một loài begomovirus cụ thể trừ phi danh tính của virus đã được xác định. 3.2.2. Hình thái của begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua nói riêng và begomovirrus nói chung thuộc chi Begomovirus (họ Geminivirus). Các geminivirus đều có cấu trúc phân tử (virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron) nối với nhau để tạo ra phân tử hình cầu đa diện kép (gemini). 3.2.3. Đặc điểm bộ gien của begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua Các begomovirus là các virus thực vật có bộ gien DNA vòng đơn có kích thước khoảng 2.6 – 2.8 kb. Chúng hoặc có bộ gien kép gồm 2 phân tử DNA sợi vòng đơn gọi là DNA-A và DNA-B hoặc có bộ gien đơn tương đương DNA-A Đối với các virus có bộ gien đơn thì DNA-A của chúng chứa 6 gien được tổ chức theo 2 chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ (chiều virus) có 2 gien là (i) V1 mã hóa vỏ protein có chức năng chính là tạo vỏ phân tử virus, lan truyên qua vector, vận chuyển bộ gien virus vào và ra khỏi nhân tế bào ký chủ và vận chuyển bộ gien virus giữa các tế bào; và (ii) V2 mã hóa protein V2 có chức năng liên quan đến vận chuyển virus giữa các tế bào. Trên chiều ngược kim đồng hồ (chiều sợi tương đồng virus) có 4 gien là (i) C1 mã hóa protein tái sinh hay còn gọi là protein Rep có chức năng chính là cắt - nối bộ gien virus tại một vị trí đặc biệt ở vùng nguồn gốc tái sinh và tương tác với protein ký chủ để tạo điều kiện thuận lợi cho tái sinh virus, (ii) C2 mã hóa 1 protein hoạt hóa phiên mã, (iii) C3 mã hóa 1 protein tăng cường tái sinh và (iv) C4 mã hóa protein C4 với chức năng liên quan đén phổ ký chủ và phát triển triệu chứng. Giữa 2 vùng gen mã hóa ngược chiều nhau ở trên là một vùng không mã hóa chứa nguồn gốc tái sinh (ori = origin of replication) gồm (i) các chuỗi lặp đảo (iteron) cần thiết cho sự nhận biết và gắn kết của protein Rep và (ii) một cấu trúc thân – thòng lọng trong đó chuỗi TAATACTAT trên vùng thòng lọng là giống nhau ở tất cả các begomovirus và vị trí TA cuối cùng là nơi protein Rep cắt và nối bộ gien begomovirrus trong quá trình tái sinh. 8 Đối với các begomovirus có bộ gien kép thì DNA-A có tổ chức bộ gienome và chức năng các gien tương tự như DNA-A của các begomovirus có bộ gien đơn (tên các gien được thêm ký tự A vào đằng trước thành AV1, AV2, AC1, AC2, AC3 và AC4); còn DNA-B của chúng chỉ chứa 2 gien được sắp xếp theo 2 chiều ngược nhau và mã hóa 2 protein là (i) protein con thoi có chức năng vận chuyển bộ gien virus vào và ra khỏi nhân tế bào và (ii) protein vận chuyển có chức năng vận chuyển bộ gien virus giữa các tế bào ký chủ. 3.3. Xâm nhiễm gây bệnh 3.3.1. Lan truyền của begomovirus Tất cả các begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (B. tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn. Chưa có bằng chứng chứng minh begomovirus nhân lên trong cơ thể bọ phấn. Bọ phấn dùng vòi chọ vào mô mạch dẫn để hút dịch cây từ mạch phloem. Virus được hút qua vòi, tới diều, thấm qua màng ruột vào xoang cơ thể, đạt tới tuyến nước bọt và cuối cùng vào ống nước bọt. Nghiên cứu với TYLCV cho thấy thời gian chích nạp và chích truyền tối thiểu của bọ phấn là khoảng 15 – 20 phút. Kể từ khi bắt đầu chích nạp, virus được phát hiện có mặt ở phần đầu sau khoảng 10 phút, ở ruột giữa.sau khoảng 50 phút, ở xoang cơ thể sau khoảng 90 phút và ở tuyến nước bọt sau khoảng 7 giờ. Thời gian từ khi virus được phát hiện thấy ở tuyến nước bọt tới khi bọ phấn có thể truyền được bênh là khoảng 1 giờ. Như vậy thời kỳ ẩn của TYLCV trong cơ thể bọ phấn là khoảng 8 giờ. 3.3.2. Tái sinh (sinh sản) của begomovirus Begomovirus, giống như các geminivirus khác, tái sinh theo cơ chế vòng lăn (rolling circular mechanism). Cơ chế vòng lăn có thể được chia làm 2 pha và được thực hiện trong nhân tế bào ký chủ. Pha tổng hợp sợi DNA vòng đơn (bộ gien có mặt trong phân tử virus) thành sợi DNA vòng kép khi bộ gien virus được chuyển vào nhân tế bào. Như vậy sợi kép sẽ gồm một sợi virus và một sợi tương đồng virus. Pha này vẫn chưa được hiểu rõ. Pha tái sinh theo cơ chế vòng lăn: Protein Rep (sau khi được tổng hợp) sẽ cắt sợi virus tại chuỗi bảo toàn TATATTAC. Nhờ vật liệu cũng như enzyme DNA polymearase của tế bào, sợi virus được tổng hợp liên tục trên sợi tương đồng virus. Protein Rep lại tiếp tục cắt sợi virus mới được tổng hợp tại chuỗi TATATTAC (cũng vừa mới được tổng hơp) thành một sợi virus hoàn chỉnh dưới dạng sợi đơn mạch thẳng. Protein Rep sau đó sẽ nối 2 đầu của mạch thẳng để tạo ra bộ gien virus sợi đơn mạch vòng hoàn chỉnh. 3.4. Tính kháng của begomovirus 3.4.1. Tính kháng của begomovirus thông qua gen kháng Cho tới nay, người ta chưa phát hiện thấy gen kháng R chống lại begomovirus trên cây cà chua trồng (Lycopersicon esculentum). Tuy nhiên một số gen kháng chống lại begomovirus đã được phát hiện thấy trên một số giống cà chua dại. Ví dụ Ty1 gen được 9 phân lập từ cây cà chua dại (Lycopersicon chilense) và là một gen kháng trội không hoàn toàn. Ty-1 dường như tương tác với các protein chịu trách nhiệm di chuyển của virus để tạo tính kháng. Ty-1 đã được chuyển vào cà chua trồng để tạo giống kháng. 3.4.2. RNA slencing và begomovirus RNA silencing là cơ chế quan trọng của cây (cũng như của nấm, động vật) nhằm điều hòa biểu hiện gen và chống sự xâm nhiễm virus. Cây có một số đường hướng silencing, trong đó quan trọng nhất là đường hướng RNA silencing thông qua siRNA. Đây là đường hướng xảy ra ở tế bào chất và trong trường hợp chống sự xâm nhiễm virus sẽ gồm các bước chính sau: 1. Hình thành các dsRNA trong tế bào chất. Các virus RNA thực vật trong quá trình tái sinh sẽ hình thành các sản phẩm trung gian là dsRNA. Các begomovirus, do các gen mã hóa theo 2 chiều ngược nhau dẫn sản phẩm phiên mã của chúng (các transcripts) sẽ gối lên nhau và tương đồng ở đầu 3’. Phần tương đồng gối lên nhau này sẽ bắt cặp để tạo đoạn dsRNA. 2. Các protein Dicer (là một endonuclease thuộc RNAse nhóm 3, chịu trách nhiệm cắt các phân tử RNA sợi kép) của tế bào ký chủ sẽ cắt đoạn dsRNA thành các phân tử dsRNA nhỏ có kích thước 21-22 nts gọi là các siRNA. 3. Các phân tử siRNA sợi kép tách thành các phân tử siRNA sợi đơn và kết hợp với các phân tử protein của tế bào tạo thành phức hợp RISC (RNA Induced Silencing Complex), trong đó chứa một RNA endonuclease là Argonaute (ký hiệu là AGO). 4. RISC sẽ nhận biết được các phân tử RNA virus trong tế bào chất và tương đồng với siRNA. Đoạn siRNA sợi đơn sẽ bắt cặp đặc hiệu với phần tương đồng trên phân tử RNA virus và AGO của RISC sẽ cắt phân tử RNA virus. RNA silencing là một cơ chế của cây chống lại virus thì virus cũng có cơ chế để chống lại sự silencing của cây. Người ta đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng C4 (hay AC4) của begomovirrus có thể ức chế đường hướng RNA silencing của cây ký chủ trong tế bào chất. 3.4.3. Bệnh xoăn lá cà chua ở Việt Nam. Trong số bệnh virus hại cà chua ở Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá được xem là bệnh quan trọng nhất. Hiện nay tỉ lệ nhiễm bệnh xoăn lá trên các ruộng trồng cà chua thường rất cao, có khi tới 100 %. Ở Việt Nam, đã có 3 loài begomovirus được phát hiện gây ra bệnh xoăn lá cà chua. Loài thứ nhất là Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV), được phân lập từ cây cà chua bị bệnh xoăn lá ở miền Bắc vào năm 2001. Loài thứ hai là Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi (TYLCKaV), được phân lập đầu tiên ở tỉnh Kanchanaburi (Thái Lan) vào năm 2002 và được phát hiện thấy trên cây cà chua tại Việt Nam vào năm 2005. Gần đây, từ một mẫu cà chua bị bệnh xoăn lá thu thập tại Hà Nội, cùng với ToLCVV, một loài begomovirus thứ ba cũng đã được phân lập. Các phân tích phân tử đã cho thấy loài thứ ba này là một loài mới và được đặt tên là Tomato yellow leaf curl Vietnam virus 10 . 16 IRBB 52 Xa4 + Xa21 17 IRBB53 xa5 + xa13 18 IRBB54 xa5 + Xa21 18 IRBB55 xa13 + Xa21 20 IRBB 56 Xa4 + xa5 + xa13 21 IRBB57 Xa4 + xa5 + Xa21 22 IRBB58 Xa4 + xa13 +Xa21 23 IRBB59 Xa5 + xa13 + Xa21 24 . Xoo. Dòng Gen kháng 1 IR24 - 2 IRBB1 Xa1 3 IRBB2 Xa2 4 IRBB3 Xa3 5 IRBB4 Xa4 6 IRBB5 xa5 7 IRBB7 Xa7 8 IRBB8 Xa8 9 IRBB10 Xa10 10 IRBB11 Xa11 11 IRBB13 xa13 12 IRBB14 Xa14 13 IRBB21 Xa21 14 IRBB50 Xa4. virus thực vật có bộ gien DNA vòng đơn có kích thước khoảng 2. 6 – 2. 8 kb. Chúng hoặc có bộ gien kép gồm 2 phân tử DNA sợi vòng đơn gọi là DNA-A và DNA-B hoặc có bộ gien đơn tương đương DNA-A Đối