Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 371 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA P24 CỦA HIV-1 PHÂN TYPE AE CỦA BỆNH NHÂN Ở HÀ NỘI EXPRESSION OF GENE ENCODING P24 PROTEIN FROM HIV-1 SUBTYPE CRF_01AE OF PATIEN IN HANOI SVTH: Phạm Thị Kim Thảo Lớp 05SH, Khoa Hoá, Trường Đại học Bách Khoa GVHD: PGS.TS. Đinh Duy Kháng Phòng Vi sinh vật phân tử, Viện công nghệ sinh học, Viện khoa học Việt Nam TÓM TẮT HIV-1 CRF01_AE là phân type chiếm tỷ lệ lây nhiễm cao tại Việt Nam và các nước Đông Nam Á. Sự xuất hiện của các chủng kháng thuốc, văcxin chưa thực sự có hiệu lực và các tệ nạn xã hội đang góp phần làm cho đại dịch HIV lan tràn với tốc độ chóng mặt. Vì vậy việc chẩn đoán sớm nhiễm HIV là biện pháp tốt nhất để ngăn chặn sự lây nhiễm trong cộng đồng và đảm bảo an toàn trong công tác truyền máu. Hiện nay trên thị trường có nhiều kit chẩn đoán HIV dựa trên cơ sở các protein tái tổ hợp gp120, gp41 và p24 nhưng giá thành rất cao và chưa phù hợp với các phân týp HIV đang lưu hành ở Việt Nam. Sự phát hiện protein p24 của HIV-1 giúp chẩn đoán sớm nhiễm HIV, theo dõi diễn tiến của bệnh và đánh giá hiệu quả của liệu pháp kháng retrovirus. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã biểu hiện thành công protein tái tổ hợp p24 trong tế bào E.coli BL21 star TM DE3, tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện và tinh sạch bằng cột Ni 2+ -Resin để tạo kit chẩn đoán. Protein tái tổ hợp thu được phản ứng đặc hiệu với huyết thanh của bệnh nhân nhiễm HIV bằng phương pháp Western Blot. ABSTRACT HIV-1 CRF01_AE appears to be the cause of high proportion of infections in Viet Nam and Southeast Asia. Emergence of multidrug resistant strains, non-availability of an effective vaccine and inappropriate social behaviors of populations have caused the HIV pandemic cross astounding proportions. So early diagnosis of HIV infection is perhaps the best way to stop its spread among populations and ensuring safety of blood obtained from donors. Now Diagnostic kit is very multiform but they are high cost and may be not suitable for HIV-1 strain circulating in Vietnam. For development of the kits, the three recombinant proteins gp120, gp41 and p24 have been used. HIV-1 p24 detection provides a means to aid the early diagnosis of HIV-1 infection, track the progression of disease and assess the efficacy of antiretroviral therapy. In the present study, we successfully expressed recombinant p24 protein in E.coli BL21 star TM DE3, optimized expressing conditions and purified by Ni 2+ -Resin column to produce HIV-1 diagnotic kit. Purified recombinant p24 protein specifically responded with the serum of HIV-1 infected patients by Western Blot analysis. 1. Mở đầu Sự gia tăng nhanh chóng về số người nhiễm HIV trên toàn thế giới với khoảng 20 triệu người chết vì AIDS mỗi năm, 33 triệu người mang HIV và hàng triệu ca nhiễm mới mỗi ngày (UNAIDS, 2009) vẫn đang là mối hiểm họa đối với toàn nhân loại. Dịch bệnh làm gia tăng sự nghèo đói, tác động không nhỏ đến tình hình kinh tế, xã hội và chính trị đối với nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Việc nghiên cứu thuốc và văcxin phòng chống HIV là vấn đề được cả thế giới quan tâm, tuy nhiên hiện vẫn chưa nhận được Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 372 các kết quả như mong đợi. Do vậy việc chẩn đoán sớm các trường hợp nhiễm HIV là hết sức quan trọng, góp phần ngăn chặn các hành vi nguy cơ làm lan truyền HIV/AIDS trong cộng đồng. Các kit chẩn đoán HIV rất đa dạng và phong phú, được nhiều hãng nghiên cứu và sản xuất. Tuy nhiên, giá thành vẫn còn cao và chưa hẳn đã phù hợp với các phân týp HIV đang lưu hành ở Việt Nam. HIV-1 là type lưu hành chủ yếu và gây đại dịch trên toàn cầu. HIV-1 gồm bốn phân nhóm chính M, N, O, P, trong đó Nhóm M chiếm 90% các trường hợp nhiễm HIV-1. Có ít nhất là 9 phân type di truyền, gồm A, B, C, D, F, G, H, J, K và các thể tái tổ hợp (CRFs). Có khoảng 30 thể tái tổ hợp đã được phát hiện mới. Các phân type này phân bố theo từng vùng địa lý khác nhau. Hiện nay, type CRF01_AE (tái tổ hợp vật chất di truyền giữa typ A và E) là phân typ gây đại dịch ở các nước Đông Nam Á và cũng là phân nhóm chiếm đến 97% phân typ HIV-1 lưu hành tại Việt Nam. Việc chế tạo các kit chẩn đoán đòi hỏi phải dựa trên sự lưu hành phân typ trong nước thì mới đảm bảo được tính chính xác và độ nhạy cao, đồng thời hạ giá thành sản phẩm. Các bộ Kit này dựa trên cơ sở các protein gp120, gp41 và p24 tái tổ hợp. Đáng lưu ý là p24, là protein nucleocapsit hay còn gọi là protein lõi, có vai trò quan trọng ở các giai đoạn khác nhau trong chu trình sống của HIV. Trước tiên p24 tham gia vào quá trình cởi áo sau khi virus xâm nhập, nó ảnh hưởng đến mối liên kết giữa RNA và DNA trong giai đoạn đầu của quá trình nhiễm, hoạt động như là yếu tố hỗ trợ (cofactor) cho enzym phiên mã ngược, làm nhiệm vụ nhận biết các dấu hiệu đóng gói, trung gian cho sự kết hợp giữa hai phân tử RNA khác nhau để hình thành genom của hạt virion HIV-1 mới. Trong chẩn đoán, p24 là kháng nguyên đặc hiệu của HIV. P24 xuất hiện sớm nhất, 2 – 3 tuần sau nhiễm HIV và duy trì trong suốt giai đoạn cấp tính của nhiễm trùng HIV. Sau đó, kháng nguyên p24 giảm dần đồng thời có sự xuất hiện kháng thể p24. Điều này báo hiệu giai đoạn không triệu chứng của nhiễm HIV. Vài tháng cho tới vài năm sau nhiễm trùng, kháng thể p24 mất đi, kháng nguyên p24 tái xuất hiện, báo hiệu giai đoạn xuất hiện triệu chứng của bệnh (AIDS). Đây là cơ sở để xây dựng các phác đồ điều trị cho những bệnh nhân nhiễm HIV. Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa p24 của HIV-1 phân typ A/E của bệnh nhân ở Hà Nội” 2. Nguyên liệu và phương pháp 2.1. Nguyên liệu Gen p24 của HIV phân type đã được tách dòng thành công trong vector tái tổ hợp pCR2.1- p24AE. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp biến nạp: Tế bào E. coli được biến nạp theo phương pháp tạo tế bào khả biến bằng muối CaCl 2 của Seidman C.E và cộng sự [1]. Các phản ứng cắt, nối ghép các đoạn DNA, điện di trên gel agarose được tiến hành theo Sambrook và cộng sự [2]. Phản ứng PCR: Biến tính DNA khuôn ở 94°C trong 2 phút; tiếp theo thực hiện 30 Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 373 chu kỳ mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Biến tính ở 94°C 1 phút, gắn mồi ở 60°C 50 giây, kéo dài chuỗi ở 72°C 1phút 20 giây; phản ứng kết thúc ở 72°C 8 phút và ủ mẫu ở 4°C. Tinh sạch protein bằng cột ái lực ProBond Nikel-Chelating Resin (Invitrogen). Định lượng protein bằng Bradford [3]. Phản ứng lai Western Blot[4]. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Thiết kế vector biểu hiện 3.1.1. Khuếch đại bằng cặp mồi biểu hiện đoạn gen p24 từ vector tách dòng Nhằm tạo đầu gắn tương thích khi đưa vào vector biểu hiện. Đoạn gen p24 được khuếch đại với cặp mồi biểu hiện có gắn trình tự cắt hạn chế của BamHI và XhoI từ khuôn là vector tách dòng pCR2.1-p24AE Sản phẩm PCR với cặp mồi biểu hiện mang gen p24 sẽ có kích thước khoảng 584bp. Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, hình 1 cho thấy kích thước đoạn gen là phù hợp với dự đoán. Hình 1. A Cặp mồi biểu hiện và B sản phẩm PCR của gen p24 bằng cặp mồi biểu hiện Đường chạy M: thang DNA chuẩn, Đường chạy số 1: sản phẩm PCR 3.1.2. Tạo vector dòng trung gian và vector biểu hiện Các enzym giới hạn thường khó nhận biết và cắt ở những vị trí đầu cùng của phân tử DNA. Do đó để tạo đầu dính trên sản phẩm PCR chúng tôi tiến hành tạo vector tái tổ hợp dòng trung gian, bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector tạo dòng pCR2.1 tạo vector tái tổ hợp pCR2.1-p24AE.BX sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Nuôi vi khuẩn trong môi trường LB bổ sung ampicilin (0,1mg/ml) và X-gal (0,1mg/ml), nuôi 37°C qua đêm, chọn 11 khuẩn lạc trắng và 1 khuẩn lạc xanh tách plasmid, điện di kiểm tra hình2A. Chọn 5 plasmid ở Hình 2A đường chạy số 3, 5,6, 7, 8, cắt kiểm tra bằng Bam HI và Xho I, Căn cứ vào kết quả ở hình 2B đường chạy 2, 3, 4 văng ra hai băng, có khả năng chúng tôi tạo được plasmid tái tổ hợp dòng trung gian mang gen kích thước khoảng 584bp. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 374 Hình 2. Kết quả tạo vector tái tổ hợp dòng trung gian pCR2.1.p24AEBam-Xho A. Kết quả tách chiết plasmid dòng trung gian. B. Kết quả kiểm tra plasmid dòng trung gian bằng enzym giới hạn Bam HI và Xho I. ĐC 1A-11A. Plasmid tách chiết từ khuẩn lạc trắng; ĐC X. Plasmid tách chiết từ khuẩn lạc xanh; ĐC M. Thang ADN chuẩn; ĐC 1B-5B. Plasmid 3,5, 6, 7, 8 cắt bằng enzym giới hạn Bam HI và Xho I; ĐC6B. Sản phẩm PCR gen p24chạy bằng cặp mồi biểu hiện. Kết quả giải trình tự và dịch mã ra các axit amin trên cơ sở lý thuyết, cho phép chúng tôi khẳng định rằng đã tách dòng thành công vector dòng trung gian và đoạn gen p24 thu được trong vector pET32a+ có khung đọc đúng, có mã khởi đầu và kết thúc, không có điểm kết thúc ở vùng khởi động, đảm bảo cho quá trình biểu hiện thông suốt. Xử lý plasmid pCR2.1.p24AEBam-Xho và pET32a+ bởi hai enzym Bam HI và Xho I. Tiến hành phản ứng gắn tạo vector biểu hiện pET32a+.p24, sau đó biến nạp vào tế bào E.coli DH5α, trải trên LB bổ sung ampicilin. Thu các khuẩn lạc đã nuôi cấy tách chiết plasmid, rồi cắt kiểm tra bằng Bam HI và Xho I. Hình3. Trình gen p24 và kết quả cắt kiểm tra các vector dòng tái tổ hợp pET32a+.p24 bằng enzym giới hạn. Vị trí cắt của Bam HI. GGATCC; Vị trí cắt của Xho I. CTCGAG Hình 4. Kết thiết kế vector biểu hiện A. Kiểm tra sản phẩm thôi gel; B. kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET32a+p24 tách từ E.coli;C. Kiểmm tra các vector pET32a+ dòng tái tổ hợp mang gen p24 bằng Bam HI và Xho I; ĐC1A.gen p24 thu được sau xử lý Bam HI và Xho I; ĐC 2A plasmid pET32a+ đã được cắt mở vòng bằng Bam HI và Xho I, M. thang DNA chuẩn; ĐC1B. plasmid pET 32a+; ĐC2B-10B. các plasmid tái tổ hợp tách từ E.coli DH5α; ĐC1C-3C các dòng plasmid tái tổ hợp được cắt bằng Bam HI và Xho I; ĐC 4C. sản phẩm PCR gen p24. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 375 Kết quả từ điện di đồ cho thấy các dòng plasmid khi cắt bằng BamHI và XhoI đều văng ra đoạn gen p24 có kích thước khoảng 584bp. Vậy chúng tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện mang đoạn gen p24 mã hóa kháng nguyên lõi của HIV-1 Type AE. 3.2. Biểu hiện ở tế bào E.coli BL21 DE3 Vector pET32a+.p24 được biến nạp vào E.coli BL21 DE3 nuôi cấy biểu hiện. Để tối ưu hóa điều kiện biểu hiện, chúng tôi tiến hành nuôi biểu hiện khảo sát các thông số nhiệt độ, thời gian, nồng độ IPTG cảm ứng. Bảng 1. Mức độ biểu hiện protein khảo sát với các thông số nhiệt độ, thời gian và nồng độ IPTG +/-Mức độ biểu hiện thấp không đánh giá được trên bảng điện di SDS-PAGE + Mức độ biểu hiện quan sát được trên bảng điện SDS-PAGE Tổng hợp tất cả các điều kiện tối ưu khảo sát được chúng tôi nuôi kiểm tra một lần nữa với chủng mang vector tái tổ hợp được cảm ứng và không cảm ứng. Kết quả thể hiện ở hình 4. Nhằm thu lượng lớn để tinh sạch và kiểm tra tính kháng nguyên, Chủng tái tổ hợp E.coli BL21DE3 mang vector pET32a+.p24 nuôi biểu hiện trong 100ml LB, bổ sung ampicilin (0,1mg/ml), IPTG 0,5mg/ml ở 37°C, và thu protein sau 3 giờ cảm ứng. 3.3. Tinh sạch Để có thể sử dụng protein tái tổ hợp phục vụ cho mục đích chẩn đoán, chúng tôi cần tinh sạch protein này. Do protein tái tổ hợp có 6 histidine ở đầu C và đầu N nên có ái lực cao với ion Ni 2+ trên cột. Trong quá trình tinh chế, imidazol được sử dụng như chất cạnh tranh Ni 2+ trong phức hợp Ni 2+ -histidine. Các protein lẫn trong dịch chiết protein tái tổ hợp tan được loại bỏ hiệu quả khỏi protein tái tổ hợp ở nồng độ imidazol 50 mM. Sau đó protein tái tổ hợp được đẩy ra khỏi cột nhờ buffer đẩy (Native Elution Buffer), chúng tôi thu 8 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1ml. Sau khi tinh chế, protein tái tổ hợp được kiểm tra độ sạch bằng điện di trên gel polyacrylamit (Hình 6). Hỗn hợp từ phân đoạn 1 – 6 ở hình 6 chúng tôi tiến hành xác định nồng độ bằng phương pháp Bardford thì hàm lượng protein thu được là 0,5mg/ml trong 100ml dịch nuôi cấy. Sử dụng 5µl protein tái tổ hợp được sinh sạch để tiến hành thí nghiệm Hình 5. Biểu hiện tối ưu protein p24 ĐC M: Thang protein chuẩn, ĐC1: protein dòng mang plasmid tái tổ hợp không được cảm ứng IPTG, ĐC2: dòng plasmid mang vecter tái tổ hợp cảm ứng IPTG Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 376 Hình 6. kết quả tinh sạch của các phân đoạn protein thu được M thang protein chuẩn, ĐC F: mẫu protein trước tinh sạch, ĐC 1 – 8: tương ứng các phân đoạn thu được sau tinh sạch. Biểu đồ 1. Đồ thị đường chuẩn để xác định nồng độ protein p24 tái tổ hợp Kết quả OD 595nm = 0,614. Dựa trên đường chuẩn chúng tôi tính được nồng độ protein tái tổ hợp là 0,5mg/ml. 3.4. Kiểm tra mức độ phản ứng của protein tái tổ hợp với mẫu huyết thanh bệnh nhân bằng kỹ thuật Western Blot Hình 7. phản ứng Western Blot của protein p24 tái tổ hợp với các mẫu huyết thanh bệnh nhân A: phản ứng protein tái tổ hợp với huyết thanh dương tính, B: phản ứng của p24 tái tổ hợp với huyết thanh âm tính. ĐC M: Protein chuẩn; ĐC 1, 3: Protein tái tổ hợp p24; ĐC 2, 4: Protein Thioredoxin. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 377 4. Kết luận Đã thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp chứa các quyết định kháng nguyên của protein lõi p24 của HIV-1 phân type AE trong hệ biểu hiện pET32a+, Ecoli BL21DE3. Đã tối ưu hóa được các điều kiện biểu hiện để nâng cao sản lượng protein tái tổ hợp. Đã tinh sạch được protein tái tổ hợp p24 bằng cột ái lực Ni 2+ -Resin Hàm lượng protein thu được trong 100 ml dịch nuôi sau là 0,5 mg/ml. Protein tái tổ hợp p24 phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng HIV trong các mẫu huyết thanh bệnh nhân dương tính và không phản ứng với các mẫu âm tính. Các nghiên cứu tạo kít chuẩn đoán HIV đang tiếp tục được thực hiện. Hướng đến việc thiết kế qui trình tạo kit và sản xuất kit chẩn đoán ở qui mô ngoài phòng thí nghiệm. Hạ giá thành sản phẩm, áp dụng xét nghiệm rộng rãi trong cộng đồng TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Seidman C. E., Struhl K., Sheen J., Jessen T. (1997), Current Protocols in Molecular Biology,pp.1.8.1-1.8.10 [2] Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T., 1989: Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. [3] Bradford, M. M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72:248-254. [4] Towbin, H. et. al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9):4350-4. . Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 371 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA P24 CỦA HIV-1 PHÂN TYPE AE CỦA BỆNH NHÂN Ở HÀ NỘI EXPRESSION OF GENE ENCODING P24 PROTEIN. tôi tiến hành nghiên cứu đề tài Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa p24 của HIV-1 phân typ A/E của bệnh nhân ở Hà Nội 2. Nguyên liệu và phương pháp 2.1. Nguyên liệu Gen p24 của HIV phân type đã. văng ra đoạn gen p24 có kích thước khoảng 584bp. Vậy chúng tôi đã thiết kế thành công vector biểu hiện mang đoạn gen p24 mã hóa kháng nguyên lõi của HIV-1 Type AE. 3.2. Biểu hiện ở tế bào E.coli