i MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÁC LOÀI MỰC 1.1.1 Mực ống (squid) 1.1.2 Mực nang (cutlefish) .4 1.1.3 Mực tuộc (octopus) .5 1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME 1.3 TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN 11 1.3.1 Quá trình thủy phân 11 1.3.2 Các phương pháp thủy phân protein 13 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân protein enzyme 15 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN PROTEIN TRÊN THẾ GIỚI VÀ ỨNG DỤNG 18 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 24 2.1.1 Phế liệu mực 24 2.1.2 Ezyme Protease 25 2.1.3 Cá kèo : 25 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.2.1 Phương pháp thu nhận xử lý mẫu 26 2.2.2 Phương pháp phân tích hóa học: 26 2.2.3 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu 29 2.2.4 Một số thiết bị sử dụng đề tài 39 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 40 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA PHẾ LIỆU MỰC TUỘC 41 ii 3.2 XÁC ĐỊNH CÁC THƠNG SỐ THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN CỦA PHẾ LIỆU MỰC 41 3.2.1 Xác định loại enzyme protease 41 3.2.2 Xác định tỷ lệ enzyme Alcalase 45 3.2.3 Ảnh hưởng pH đến trình thủy phân 49 3.2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân 53 3.2.5 Xác định pH nhiệt độ tối thích cho trình thủy phân 56 3.2.6 Xác định tỷ lệ ẩm cho trình thủy phân 58 3.2.7 Xác định tỷ lệ NaCl sorbitol bổ sung làm chất phịng thối cho q trình thủy phân 62 3.3 THỬ NGHIỆM DÙNG DỊCH THỦY PHÂN PHẾ LIỆU MỰC LÀM THỨC ĂN BỔ SUNG CHO CÁ 67 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 iii DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN TÊN BẢNG Trang Bảng 2.1 Điều kiện làm việc Neutrase, Alcalase Protamex 25 Bảng 2.2 Giá trị số , ß, htotal, protein từ vật liệu khác (Adler-Nissen 1986, trích từ P.M Nielsen cộng sự, 2001) 28 Bảng 3.1 Thành phần khối lượng mực (%) 41 Bảng 3.2 Thành phần hóa học phế liệu mực (%) 41 Bảng 3.3 Ảnh hưởng loại enzyme tới thay đổi trạng thái cảm quan theo thời gian mẫu thủy phân 42 Bảng 3.4 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme Alcalase tới thay đổi trạng thái cảm quan theo thời gian mẫu thủy phân 46 Bảng 3.5 Ảnh hưởng pH tới thay đổi trạng thái cảm quan theo thời gian mẫu thủy phân 50 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ tới thay đổi trạng thái cảm quan theo thời gian mẫu thủy phân 54 Bảng 3.7 Ảnh hưởng tỷ lệ ẩm tới thay đổi trạng thái cảm quan theo thời gian mẫu thủy phân 59 Bảng 3.8 Kết phân tích cảm quan, DH (%) hàm lượng Naa, NNH3 dịch thủy phân ảnh hưởng NaCl sorbitol bổ sung 63 Bảng 3.9 Kết phân tích cảm quan, DH (%) hàm lượng Naa, NNH3 dịch thủy phân phế liệu mực theo thời gian .67 iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TRONG LUẬN VĂN TÊN HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Mực ống Trung Hoa Hình 1.2 Mực nang vân hổ Hình 1.3 Mực tuộc Hình 1.4 Biểu đồ xuất khẫu mực tuộc năm 2000-2004 Hình 2.1 Mực tuộc .24 Hình 2.2 Phế liệu mực tuộc thu gom từ xí nghiệp chế biến 24 Hình 2.3 Cá kèo 25 Hình 2.4 Bể ni thử nghiệm cá kèo 25 Hình 2.5 Phản ứng tạo phức thuốc thử OPA với hợp chất chứa nhóm amino (H2N-R) .27 Hình 2.6 Qui trình thủy phân phế liệu mực 29 Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại enzyme protease thích hợp cho trình thủy phân .30 Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme protease thích hợp cho q trình thủy phân .31 Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH đến trình thủy phân 32 Hình 2.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân .33 Hình 2.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH nhiệt độ tối thích cho trình thủy phân .34 Hình 2.12 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ ẩm thích hợp cho trình thủy phân 35 Hình 2.13 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ NaCl sorbitol bổ sung thích hợp cho trình thủy phân 36 v Hình 2.14 Qui trình ni thử nghiệm cá kèo dịch thủy phân phế liệu mực 37 Hình 2.15 Thiết bị xác định protein theo phương pháp Kejldahn 39 Hình 2.16 Máy so màu UV/VIS 39 Hình 2.17 Thiết bị điện di 39 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng loại enzyme đến độ thủy phân (DH %) theo thời gian mẫu thủy phân 43 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng loại enzyme đến hàm lượng Naa theo thời gian mẫu thủy phân .43 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng loại enzyme đến hàm lượng NNH3 theo thời gian mẫu thủy phân 44 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ enzyme Alcalase đến độ thủy phân (DH %) theo thời gian mẫu thủy phân .47 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ enzyme Alcalase đến hàm lượng Naa theo thời gian mẫu thủy phân .47 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ enzyme Alcalase đến hàm lượng NNH3 theo thời gian mẫu thủy phân 48 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến độ thủy phân (DH %) theo thời gian mẫu thủy phân 51 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến hàm lượng Naa theo thời gian mẫu thủy phân 51 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến hàm lượng NNH3 theo thời gian mẫu thủy phân 52 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến độ thủy phân (DH %) theo thời gian mẫu thủy phân .55 Hình 3.11 Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng Naa theo thời gian mẫu thủy phân 55 Hình 3.12 Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng NNH3 theo thời gian mẫu thủy phân 56 vi Hình 3.13 Đồ thị mặt đáp ứng DH (%) theo pH nhiệt độ thủy phân 57 Hình 3.14 Đồ thị đường mức DH (%) theo pH nhiệt độ thủy phân 57 Hình 3.15 Đồ thị mặt đáp ứng Naa theo pH nhiệt độ thủy phân 58 Hình 3.16 Đồ thị đường mức Naa theo pH nhiệt độ thủy phân .58 Hình 3.17 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ ẩm đến độ thủy phân (DH %) theo thời gian mẫu thủy phân .60 Hình 3.18 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ ẩm đến hàm lượng Naa theo thời gian mẫu thủy phân 60 Hình 3.19 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ ẩm đến hàm lượng NNH3 theo thời gian mẫu thủy phân 61 Hình 3.20 Đồ thị mặt đáp ứng DH(%) theo NaCl sorbitol thủy phân .64 Hình 3.21 Đồ thị đường mức DH (%) theo NaCl sorbitol thủy phân .64 Hình 3.22 Đồ thị mặt đáp ứng Naa theo NaCl sorbitol thủy phân 64 Hình 3.23 Đồ thị đường mức Naa theo NaCl sorbitol thủy phân 65 Hình 3.24 Đồ thị mặt đáp ứng NNH3 theo NaCl sorbitol thời điểm thủy phân 65 Hình 3.25 Đồ thị đường mức NNH3 theo NaCl sorbitol thời điểm thủy phân 65 Hình 3.26: Dịch phế liệu mực sau thủy phân (mẫu 7) 66 Hình 3.27: Phổ điện di phế liệu mực theo thời gian thủy phân 68 Hình 3.28: Biểu đồ tổng lượng thức ăn (viên) cá kèo sử dụng 30 phút đầu cho ăn bể thời gian 10 ngày thí nghiệm 69 Hình 3.29: Biểu đồ khối lượng tăng trung bình ngày cá kèo bể thời gian 10 ngày thí nghiệm 69 vii DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN Kí hiệu viết tắt Diễn giải DH : Độ thủy phân DTP : Dịch thủy phân ĐC : Đối chứng Naa : Nitơ acid amin NF : Nitơ foocmol NNH3 : Nitơ amoniac NTS : Nitơ tổng số pHopt : pH tối thích pHth : pH thích hợp topt : Nhiệt độ tối thích tth : Nhiệt độ thích hợp TLK : Trọng lượng chất khơ MỞ ĐẦU Ngày nay, với phát triển khoa học kỹ thuật, ngành chế biến thủy sản coi ngành mũi nhọn xem nhiệm vụ chiến lược nước ta Theo Tổng cục Thống kê, năm 2009 kim ngạch xuất thuỷ sản nước đạt khoảng 4,2 tỷ USD, nguồn ngoại tệ đáng kể ngân sách nhà nước Các mặt hàng xuất đa dạng, bao gồm mặt hàng đông lạnh, đồ hộp, mặt hàng chế biến khơ,…Các đối tượng dùng sản xuất thường lồi tôm, cá, mực,… Bên cạnh mặt hàng xuất có giá trị lớn tơm cá mực sản phẩm có đóng góp lớn cho sức tăng trưởng xuất chung thủy sản Việt Nam nhiều năm qua (Vasep) Các mặt hàng chế biến mực phần lớn dạng đơng lạnh Block, IQF, semi-IQF, đơng lạnh khay đóng gói hút chân khơng Hình thức sản phẩm chế biến phi lê, cắt miếng, tỉa hoa, chế biến sẵn để nấu dạng sản phẩm sushi, sashimi để ăn gỏi, tẩm bột hay sản phẩm phối chế khác Cùng với gia tăng khối lượng mực xuất khẩu, lượng phế liệu từ mực tăng lên dẫn đến tồn nhiều vấn đề làm tăng chi phí xử lý nước thải, làm tăng ô nhiễm môi trường Lượng phế liệu mực thải từ qui trình sản xuất mực lớn, chiếm khoảng 40% nguyên liệu Hàm lượng protein phế liệu mực chiếm từ 72-77% thành phần chất khô [46] Theo theo Takaoka, 1995 Meyers, 1989 (trích từ P Z Lian, 2005) [46] thành phần protein mực có chứa betain, acid amin tự khoảng 1,5% peppid có trọng lượng phân tử thấp chất gây kích thích bắt mồi cho tơm Theo Jobling, 1998 hàm lượng protein phế liệu mực đủ cao cho trình thủy phân tạo peptid acid amin, có chứa hầu hết acid amin cần thiết cho phát triển tăng tỷ lệ sống cá ni Nhưng nhìn chung nước ta phế liệu mực đối tượng chưa tận dụng tốt Đó phế liệu mực (bao gồm da nội tạng…) khó phơi khô nhanh ôi thối, dẫn đến phế liệu mực làm khô (dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn chăn ni) thu có chất lượng khơng cao Vì vậy, đem thủy phân lượng phế liệu để thu hồi nguồn chất dinh dưỡng sau bổ sung vào thức ăn cho vật ni nâng cao giá trị nguyên liệu qui trình sản xuất mực cịn có tác dụng giảm tải lớn cho trình xử lý nước thải, hạn chế nhiễm mơi trường Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu trình thủy phân phế liệu mực Enzyme Protease thử nghiệm bổ sung dịch thủy phân vào thức ăn nuôi cá” hướng nghiên cứu cần thiết Ý nghĩa khoa học: Là tìm chế độ thủy phân thích hợp phế liệu mực làm tảng cho việc nghiên cứu qui mô pilot sản xuất công nghiệp sau Ý nghĩa thực tiễn: Góp phần vào việc xây dựng cơng nghiệp tận dụng phế liệu mực mang lại giá trị gia tăng cho ngành thủy sản, sử dụng nguồn nguyên liệu hiệu hơn, tạo mặt hàng mới, giảm ô nhiễm môi trường… CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÁC LOÀI MỰC Mực thuộc ngành động vật thân mềm (Mollusca), bao gồm loài mực ống, mực nang, mực tuộc nguồn lợi hải sản xuất quan trọng Việt Nam sau tôm cá Nhuyễn thể chân đầu phân bố khắp vùng biển Việt Nam, bao gồm vùng Vịnh Bắc bộ, vùng biển miền Trung vùng biển Đông, Tây Nam Trong đó, số lồi có vùng phân bố hẹp phạm vi một, hai vùng biển, song có lồi có mặt khắp vùng biển Những lồi phổ biến có giá trị kinh tế cao mực nang vân hổ (Sepia pharaonis) mực nang mắt cáo (S.lycidas), mực nang lửa (S.latimanus), mực nang vàng (S esculenta), mực (Sepioteuthis lessoniana), mực ống Đài Loan (Loligo chinensis), mực thẻ (L edulis), mực tuộc (Octopus dollfusi), mực tuộc Ôxen (Octopus ocellatus), mực tuộc đốm trắng (O vulgaris) [61] Sản lượng nhuyễn thể chân đầu xuất hàng năm đạt khoảng 50.00060.000 tấn, trị giá khoảng 150 triệu USD Theo Viện Nghiên cứu Hải sản, 10 tháng đầu năm 2007, xuất mực bạch tuộc đạt 67,7 nghìn tấn, trị giá 231 triệu USD, tăng 21% khối lượng 31% giá trị so với kỳ năm 2006, chiếm 7,7% tổng giá trị XKTS nước ta [60] 1.1.1 Mực ống (squid) Theo số liệu điều tra nhất, vùng biển Việt Nam có tới 25 lồi mực ống (mực lá), thuộc Teuthoidea Đa số mực ống sống độ sâu 100m nước Trong tháng mùa khô (tháng 12-tháng năm sau), mực ống di chuyển đến vùng nước nông hơn, độ sâu