Đang tải... (xem toàn văn)
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC …. … KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: Vƣơng Hồ Vũ Thành phố Hồ Chí Minh tháng / 2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC …. … KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS TS Bùi Cách Tuyến Vƣơng Hồ Vũ Thành phố Hồ Chí Minh tháng / 2005 LỜI CẢM TẠ Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ Cha mẹ, em dòng họ chỗ dựa vững tinh thần vật chất cho Em vô biết ơn Thầy Bùi Cách Tuyến tận tình hƣớng dẫn truyền đạt cho em kinh nghiệm quý báu suốt thời gian làm đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ Mơn Công Nghệ Sinh Học tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian học tập vừa qua Ban giám đốc Trung Tâm Phân Tích - Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh tồn thể anh chị Trung Tâm tạo điều kiện thuận lợi tối đa nhƣ tận tình giúp đỡ em thời gian thực tập tốt nghiệp Anh Nguyễn Văn Sơn tồn thể cán cơng nhân viên Chi cục Bảo vệ Thực vật tỉnh Lâm Đồng giúp đỡ em hoàn thành tốt đề tài TS Bùi Minh Trí, ThS Trần Nhật Phƣơng Quý Thầy - Cơ ngồi trƣờng tận tình giúp đỡ, dạy bảo trang bị cho em kiến thức bổ ích Em xin chân thành cảm ơn anh Tồn, chị Huệ, chị Phƣơng, chị Hƣng, chị Hà hết lịng giúp đỡ em để em hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Cảm ơn bạn lớp Công Nghệ Sinh Học K27 đồng hành, chia sẻ vui buồn, động viên giúp đỡ suốt thời gian học tập làm đề tài Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2005 Vƣơng Hồ Vũ iii TÓM TẮT KHÓA LUẬN VƢƠNG HỒ VŨ, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng / 2005 “Nghiên cứu số virus khoai tây (PVX, PVY, PLRV) Đà Lạt kỹ thuật ELISA, RTPCR giải trình tự” đƣợc thực từ tháng đến tháng năm 2005 Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Hội đồng hƣớng dẫn: PGS TS Bùi Cách Tuyến Đề tài thực nội dung sau: Xác định tỷ lệ nhiễm loại virus PVX, PVY PLRV phƣờng (5, 8, 9, 11 12) thành phố Đà Lạt kỹ thuật ELISA Khuếch đại đoạn gene có kích thƣớc 336 bp mã hóa protein vỏ virus PLRV kỹ thuật RT-PCR Giải trình tự đoạn gene 336 bp virus PLRV so sánh với ngân hàng gene (NCBI) để đánh giá mức độ tƣơng đồng đoạn gen Kết đạt đƣợc Xác định đƣợc tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY PLRV phƣờng nhƣ sau: - Phƣờng 5: PVX: 56,25%, PVY: 90,91%, PLRV: 96,97% - Phƣờng 8: PVX: 17,39%, PVY: 100%, PLRV: 100% - Phƣờng 9: PVX: 21,21%, PVY: 96,97%, PLRV: 96,97% - Phƣờng 11: PVX: 41,18%, PVY: 100%, PLRV: 100% - Phƣờng 12: PVX: 72,73%, PVY:100 %, PLRV: 100% Phát đƣợc virus PLRV kỹ thuật RT-PCR Đã giải đƣợc trình tự đoạn gen 336 bp cho kết tƣơng đồng 100% sau so sánh với trình tự gen virus PLRV ngân hàng gen iv MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng .viii Danh sách hình biểu đồ ix MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc khoai tây bệnh khoai tây 2.2 Giới thiệu virus PVX, PVY PLRV gây bệnh khoai tây 2.2.1 Sơ lƣợc virus PVX (Potato virus X) 2.2.2 Sơ lƣợc virus PVY (Potato virus Y) 2.2.3 Sơ lƣợc virus PLRV (Potato leafroll virus) 2.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh 2.3.1 Phƣơng pháp chẩn đoán bên 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học 2.3.3 Phƣơng pháp quang phổ 2.3.4 Phƣơng pháp so sánh độ đục dịch 2.3.5 Phƣơng pháp chiết quang kép 2.3.6 Phƣơng pháp chẩn đoán kính hiển vi điện tử 2.3.7 Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) 2.3.7.1 Phƣơng pháp ELISA trực tiếp kiểu Sandwich 10 2.3.7.2 Phƣơng pháp ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) 10 v 2.3.8 Phƣơng pháp RT-PCR 10 2.3.9 Phƣơng pháp giải trình tự gen 11 2.4 Nghiên cứu nƣớc PVX, PVY PLRV khoai tây 12 2.4.1 Nghiên cứu nƣớc virus PVX, PVY PLRV 12 2.4.2 Nghiên cứu nƣớc virus PVX, PVY, PLRV 13 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 14 3.2 Vật liệu nghiên cứu 14 3.2.1 Vật liệu dùng kỹ thuật ELISA phát PVX, PVY PLRV 14 3.2.2 Vật liệu dùng kỹ thuật RT-PCR để phát PLRV 15 3.2.2.1 Vật liệu dùng ly trích RNA 15 3.2.2.2 Vật liệu dùng phản ứng RT-PCR 15 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Nội dung nghiên cứu 16 3.3.2 Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu 16 3.3.3 Phƣơng pháp phát PVX, PVY PLRV 17 3.3.3.1 Phát virus PVX, PVY PLRV kĩ thuật ELISA 17 3.3.3.2 Phát virus PLRV phƣơng pháp RT-PCR 20 3.3.3.3 Giải trình tự trực tiếp đoạn gen virus PLRV 25 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Tình hình canh tác khoai tây Thành phố Đà Lạt 27 4.2 Kết phát virus PVX, PVY PLRV kỹ thuật ELISA 27 4.2.1 Kết kiểm tra ELISA phƣờng 27 4.2.2 Kết ELISA theo giống 29 4.2.3 Kết ELISA theo hệ 30 4.2.4 Kết ELISA theo tháng tuổi 30 4.3 Kết RT-PCR 31 4.4 Kết giải trình tự 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC 40 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT - cDNA: Complementary Deoxyribonucleotide acid - ctv: Cộng tác viên -ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate - DEPC: Diethyl pyrocarbonate -dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate - M-MLV: Moloney murine leukemia virus - PBS-T: Phosphate – buffered saline with tween 20 - PLRV: Potato leafroll virus - p-NPP: p - nitrophenol phosphate - PVP: Polyvinylpyrrolidone - RNA: Ribonucleic acid - RT-PCR: Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction - PVX: Potato virus X - PVY: Potato virus Y - VPg: Protein linked genome vii DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 3.1 Số mẫu thu thập từ phƣờng thuộc TP.Đà Lạt 17 Bảng 3.2 Tỷ lệ pha loãng kháng thể 18 Bảng 3.3 Tỷ lệ pha loãng kháng thể gắn enzyme 19 Bảng 3.4 Tỷ lệ pha loãng chất tạo màu 20 Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho phản ứng tổng hợp cDNA 23 Bảng 3.6 Thành phần hóa chất phản ứng khuếch đại cDNA 24 Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm PVX ,PVY, PLRV phƣờng 28 Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm kép virus PVX ,PVY, PLRV 29 Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY PLRV theo giống 29 Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY PLRV theo hệ 30 Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY PLRV theo tháng tuổi 30 Bảng 4.6 Kết qủa thành phần hóa chất cho phản ứng tổng hợp cDNA 31 Bảng 4.7 Kết qủa thành phần hóa chất phản ứng khuếch đại cDNA 32 viii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ TRANG Hình 2.1 Hình thái virus PVX Hình 2.2 Khoai tây bị nhiễm virus PVX Hình 2.3 Hình thái virus PVY Hình 2.4 Khoai tây bị nhiễm virus PVY Hình 2.5 Hình thái virus PLRV Hình 2.6 Khoai tây bị bệnh Hình 2.7 Sơ đồ tổng quát kỹ thuật RT-PCR 11 Hình 4.1 Kết điện di 33 Hình 4.2 Kết giải trình tự dạng peak Sense primer 34 Hình 4.3 Kết giải trình tự dạng peak Antisense primer 34 Hình 4.4 So sánh kết giải trình tự từ primer 35 Hình 4.5 Trình tự sợi Sense đoạn cDNA mã hóa cho protein vỏ PLRV 36 Hình 4.6 Kết so sánh trình tự sản phẩm RT-PCR PLRV ngân hàng gen 36 Biểu đồ 4.1 So sánh tỷ lệ nhiễm PVX, PVY PLRV theo phƣờng 28 Biểu đồ 4.2 So sánh tỷ lệ nhiễm bệnh hai giống 06 07 29 Biểu đồ 4.3 So sánh tỷ lệ nhiễm bệnh hệ 29 Biểu đồ 4.4 So sánh tỷ lệ nhiễm lứa tuổi 31 ix PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Khoai tây (Solanum tuberosum L.) nguồn thực phẩm quan trọng ngƣời (xếp thứ năm loại thực phẩm giới sau lúa mì, gạo, bắp đại mạch ) Tuy nhiên trở ngại lớn việc phát triển khoai tây bệnh hại bệnh virus vơ nghiêm trọng Khoai tây bị nhiễm 30 loại virus khác nhau, phổ biến nguy hại loại virus PVX (Potato virus X), PVY (Potato virus Y) PLRV (Potato leafroll virus) với triệu chứng khảm, cuốn, đốm, nhăn nheo hoại tử Sản lƣợng khoai tây bị thiệt hại nghiêm trọng bị tạp nhiễm lúc nhiều loại virus Năng suất khoai tây giảm tới 80% bị nhiễm tổ hợp PVX, PVS PLRV (Salazar 1982) Ở nƣớc ta, khoai tây đƣợc trồng chủ yếu vào vụ đông đồng Sông Hồng, tỉnh phía Bắc (sản xuất 85% khoai tây Việt Nam) trồng quanh năm Đà Lạt (chiếm 15% sản lƣợng) với loại giống chủ yếu nhƣ 06 07 Mặc dù vậy, nhận thức nông dân nhƣ nghiên cứu bệnh virus thiệt hại bệnh virus khoai tây hạn chế Do việc chẩn đốn nhanh, xác nhằm đƣa biện pháp phịng trừ thích hợp để hạn chế tối đa thiệt hại bệnh gây cần thiết Do đặc điểm phức tạp bệnh virus nên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn, địi hỏi nhiều dụng cụ trang thiết bị đại thực đƣợc Ngày với phát triển nhanh chóng hỗ trợ đắc lực công nghệ sinh học đặc biệt sinh học phân tử với kỹ thuật chẩn đoán nhƣ ELISA, RT-PCR, Sequencing, tạo điều kiện thuận lợi cho cơng tác nghiên cứu, chẩn đốn nhƣ phịng trừ bệnh virus khoai tây Xuất phát từ thực tế thực đề tài: “Nghiên cứu số virus khoai tây (PVX, PVY, PLRV) Đà Lạt kỹ thuật ELISA, RT-PCR giải trình tự” ... số virus khoai tây (PVX, PVY, PLRV) Đà Lạt kỹ thuật ELISA, RT-PCR giải trình tự? ?? 1.2 Mục đích - Phát loại virus (PVX, PVY, PLRV) khoai tây thành phố Đà Lạt kỹ thuật ELISA - Phát virus PLRV kỹ thuật. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC …. … KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA,. .. HỒ VŨ, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tháng / 2005 ? ?Nghiên cứu số virus khoai tây (PVX, PVY, PLRV) Đà Lạt kỹ thuật ELISA, RTPCR giải trình tự? ?? đƣợc thực từ tháng đến tháng năm 2005 Trung tâm