Đang tải... (xem toàn văn)
hi Citrus là một chi lớn thuộc họ Cam (Rutaceae) và được cho là có nguồn gốc từ Đông Nam Á. Ở Việt Nam, chi Citrus có khoảng 20 loài và dưới loài. Các cây Citrus rất phổ biến ở Việt Nam gồm có: 1) Bƣởi: tên khoa học là Citrus grandis (L.) Osbeck (tên đồng nghĩa C. decumana Murr. và C. maxima (Burm.) Merr.), 2) Cam: C. sinensis (L.) Osbeck, (C. aurantium L.), 3) Chanh: tên khoa học C. limonia Osbeck (chanh kiên) và C. aurantifolia Swingle (chanh ta) 4) Quít: tên khoa học C. reticulate Blanco (C. nobilis Lour. ; C. chrysocarpa Lush.), 5) Quất: C. japonica Thunb. (Fortunella spp)Ngoài việc sử dụng ruột quả làm thức uống giải khát thì vỏ quả cũng có nhiều tác dụng không kém.Nhóm hợp chất chính trong vỏ quả các loài thuộc chi Citrus là các flavonoid có hàm lượng cao, có thể lên tới 510% tính theo vỏ quả khô. Đây là thành phần hoạt chất chính có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, giảm mỡ máu, chống các bệnh tim mạch, và chống ung thư và rất nhiều bệnh tật khác. Có vài chục flavonoid được gọi là citroflavonoid vì chúng được tìm thấy chủ yếu trong các loài Citrus , trong đó naringin và hesperidin là hai flavanon glycosid phổ biến nhất có trong quả các loài Citrus. Y học cổ truyền của Trung Quốc và một số nước châu Á có sử dụng vỏ quả (hoặc quả) của nhiều loài Citrus làm thuốc như bưởi, cam chua và cam ngọt (chỉ thực, chỉ xác), chanh, quýt (trần bì), thanh yên… . Các citroflavonoid còn được dùng làm thuốc điều trị các bệnh rối loạn thành mạch máu, một số biệt dược được bán trên thị trường hiện nay như Daflon, Diosmin, Flebosmin, Cemaflavone, Ciricularine... Như vậy, có thể coi citroflavonoid được làm thuốc dùng trong cả y học cổ truyền và y học hiện đại.
i MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 PHẦN I. TỔNG QUAN 3 1. CÁC LOÀI CITRUS 3 2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI CITRUS 4 2.1. Thành phần hóa học 4 2.2. Flavonoid trong vỏ quả các loài Citrus (citroflavonoid) 5 3. TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CITROFLAVONOID 7 3.1. Tác dụng chống oxy hóa 7 3.2. Tác dụng giảm mỡ máu 8 3.3. Tác dụng chống viêm 8 3.4. Chống các bệnh tim mạch 8 3.5. Chống ung thƣ 9 3.6. Các sản phẩm thuốc trên thị trƣờng có hoạt chất là các citroflavonoid 9 4. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VỀ CITROFLAVONOID 9 5. CHIẾT XUẤT CITROFLAVONOID 10 6. VẤN ĐỀ TỒN TẠI CẦN GIẢI QUYẾT 13 PHẦN II. ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 14 2. NGUYÊN LIỆU 14 2.1. Nguyên liệu cho chiết xuất 14 2.2. Dung môi, hóa chất 14 2.3. Động vật thí nghiệm 14 3. THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 15 3.1. Thiết bị sử dụng cho điều tra, khảo sát các loài Citrus 15 3.2. Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu qui mô phòng thí nghiệm 15 3.4. Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu ở qui mô pilot 15 3.5. Thiết bị sử dụng cho kiểm nghiệm 16 3.5. Thiết bị sử dụng cho thử tác dụng sinh học 16 4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 4.1. Phƣơng pháp điều tra, thu thập mẫu các loài thuộc chi Citrus 16 4.2. Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng các citroflavonoid 16 4.3. Xây dựng qui trình chiết xuất citroflavonoid qui mô phòng thí nghiệm 17 4.4. Triển khai các quy trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid ở qui mô pilot 17 4.5. Phân lập các hoạt chất flavonoid chính làm chất đối chiếu 17 4.6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu vỏ quả Citrus và sản phẩm bột citroflavonoid 18 4.7. Phƣơng pháp thử tác dụng sinh học của bột citroflavonoid 18 4.7.1. Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của các sản phẩm 18 4.7.2. Thử độc tính cấp 21 4.7.3. Thử độc tính bán trường diễn 21 4.7.4. Đánh giá tác dụng phòng chống vữa xơ động mạch 22 4.7.5. Xử lý số liệu 23 4.7.6. Nơi thực hiện nghiên cứu 23 PHẦN III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 24 1. ĐIỀU TRA, KHẢO SÁT, THU THẬP VÀ PHÂN TÍCH THÔNG TIN VỀ NGUỒN NGUYÊN LIỆU CITRUS TẠI VIỆT NAM 24 1.1. Phạm vi điều tra 24 1.2. Thu thập tiêu bản và xác định tên khoa học của các loài Citrus 24 1.3. Kết quả thu mua nguyên liệu vỏ quả các loài Citrus 25 1.4. Điều tra phỏng vấn nguồn nguyên liệu vỏ quả từ các loài Citrus 26 ii 1.4.1. Kết quả điều tra, phỏng vấn về diện tích trồng và sản lượng các loài 26 1.4.2. Kết quả điều tra, phỏng vấn các công ty/xí nghiệp kinh doanh các sản phẩm từ các loài thuộc chi Citrus 27 1.5. Kết luận 28 2. XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG CITROFLAVONOID TRONG MẪU VỎ QUẢ CITRUS VÀ CHẾ PHẨM CHIẾT XUẤT 28 2.1. Xây dựng phƣơng pháp Định tính các citroflavonoid 28 2.1.1. Nguyên tắc 28 2.1.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) 29 2.1.3. Định tính bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 31 2.2. Phƣơng pháp định lƣợng bằng phép đo UV-VIS 35 2.2.1. Nguyên tắc 35 2.2.2. Thực nghiệm 35 2.2.3. Kết quả 36 2.3. Phƣơng pháp định lƣợng naringin và hesperidin bằng HPLC 36 2.3.1. Nguyên tắc 36 2.3.2. Thực nghiệm 36 2.3.3. Kết quả 37 3. XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CITROFLAVONOID TRONG MẪU VỎ QUẢ CITRUS THU THẬP 40 3.1. Nguyên liệu 40 3.2. Phƣơng pháp định lƣợng 41 3.3. Phƣơng pháp xác định độ ẩm của mẫu thử 41 3.4. Tiến hành định lƣợng 41 3.5. Kết quả 42 3.5.1. Kết quả định lượng citroflavonoid 42 3.5.2. Bàn luận 44 3.6. Kết luận 45 4. PHÂN LẬP CÁC CITROFLAVONOID CHÍNH LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU 46 4.1. Phƣơng pháp nghiên cứu 46 4.2. Thực nghiệm và kết quả 46 4.2.1. Phân lập Naringin (ký hiệu là CF-1) 46 4.2.2. Phân lập Hesperidin (CF-2) 47 4.2.3. Điều chế Naringenin (CF-3) 50 4.2.4. Điều chế Hesperetin (CF-4) 51 5. KẾT QUẢ THỬ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO 53 5.1. Kết quả thử tác dụng dọn gốc tự do 53 5.1.1. Tác dụng dọn gốc tự do DPPH 53 5.1.2. Tác dụng dọn gốc tự do superoside (O 2 –● ) 53 5.1.3. Tác dụng dọn gốc tự do hydroxy (OH ● ) 54 5.2. Tác dụng ức chế sự oxy hóa lipid 54 5.3. Tác dụng chống oxy hóa lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL) 55 5.4. Bàn luận 55 6. LỰA CHỌN NGUỒN NGUYÊN LIỆU CHO CHIẾT XUẤT 56 7. XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÂN LẬP CITROFLAVONOID TỪ VỎ QUẢ CÁC LOÀI CITRUS Ở QUI MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM 57 7.1. Phƣơng pháp thực nghiệm chung 57 7.1.1. Nguyên vật liệu 57 7.1.2. Thực nghiệm 57 7.2. Khảo sát các điều kiện chiết xuất citroflavonoid từ dƣợc liệu 57 7.2.1. Khảo sát dung môi chiết 57 7.2.2. Khảo sát nhiệt độ chiết xuất 58 7.2.3. Khảo sát thời gian và số lần chiết xuất 59 iii 7.2.4. Khảo sát tỷ lệ dung môi/dược liệu 60 7.2.5. Khảo sát kích thước dược liệu 60 7.3. Qui trình loại tạp từ citroflavonoid chiết xuất 61 7.3.1. Nguyên liệu 61 7.3.2. Thực nghiệm 61 7.3.3. Kết quả 61 7.3.4. Kết luận 62 7.4. Xây dựng qui trình chiết xuất citroflavonoid từ dƣợc liệu 63 7.4.1. Nguyên vật liệu 63 7.4.2. Thực nghiệm 63 7.4.3. Kết quả 63 7.4.4. Kết luận 64 8. TRIỂN KHAI QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHIẾT XUẤT CITROFLAVONOID TỪ VỎ QUẢ CITRUS QUY MÔ PILOT 66 8.1. Triển khai và điều chỉnh các thông số kỹ thuật phù hợp cho từng công đoạn của quy trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid 66 8.1.1. Nguyên vật liệu 66 8.1.2. Trang thiết bị, máy móc 66 8.1.3. Thực nghiệm 66 8.1.4. Xây dựng qui trình 67 8.2. Hoàn thiện độ ổn định của quy trình công nghệ chiết xuất Citroflavonoid 70 8.2.1. Nguyên vật liệu 70 8.2.2. Máy móc, trang thiết bị 70 8.2.3. Thực nghiệm 70 8.2.3. Kết luận 71 9. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO NGUYÊN LIỆU VÀ SẢN PHẨM 74 9.1. Tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu vỏ quả Citrus dùng cho chiết xuất 74 9.1.1. Nguyên vật liệu 74 9.1.2. Thực nghiệm 74 9.1.3. Kết quả 75 9.1.4. Tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu 78 9.2. Tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm bột citroflavonoid 79 9.2.1. Nguyên vật liệu 79 9.2.2. Thực nghiệm 79 9.2.3. Kết quả 79 9.2.4. Kết luận 81 10. XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH CẤP CỦA BỘT CITROFLAVONOID 81 10.1. Nguyên vật liệu 81 10.2. Thực nghiệm 82 10.3. Kết quả 82 11. XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH BÁN TRƢỜNG DIỄN CỦA BỘT CITROFLAVONOID 82 11.1. Nguyên liệu 82 11.2. Thực nghiệm 83 11.3. Kết quả 83 11.3.1. Kết quả theo dõi tình trạng chung và cân nặng động vật thí nghiệm 83 11.3.2. Kết quả theo dõi các chỉ số huyết học 83 11.3.3. Kết quả theo dõi các chỉ số thuộc chức năng gan 84 11.3.4. Kết quả theo dõi các chỉ số thuộc chức năng thận 85 11.3.5. Kết quả xét nghiệm mô học 86 11.4. Kết luận 86 12. TÁC DỤNG PHÒNG CHỐNG VỮA XƠ ĐỘNG MẠCH CỦA SẢN PHẨM BỘT CITROFLAVONOID 86 12.1. Thực nghiệm 86 iv 12.1.1. Nguyên vật liệu 86 12.1.2. Tiến hành thí nghiệm 87 12.2. Kết quả 87 12.2.1. Ảnh hưởng của thuốc thử trên các chỉ số lipid máu 87 12.2.2. Tác dụng của citroflavonoid lên mô bệnh học 89 12.3. Kết luận 90 13. NGHIÊN CỨU ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA SẢN PHẨM BỘT CITROFLAVONOID 91 13.1. Nguyên liệu nghiên cứu 91 13.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 91 13.3. Kết quả 91 13.3.1. Lần kiểm nghiệm thứ nhất 91 13.3.2. Lần kiểm nghiệm thứ hai 91 13.3.3. Lần kiểm nghiệm thứ ba 92 13.3.3. Lần kiểm nghiệm thứ tư 92 PHẦN IV. BÀN LUẬN 94 1. Bàn luận về các kết quả nghiên cứu đã thu đƣợc 94 1. 1. Khảo sát nguồn nguyên liệu vỏ quả một số loài thuộc chi Citrus tại Việt Nam 94 1.2. Xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính, định lƣợng các flavonoid bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 94 1.3. Lựa chọn đƣợc một flavonoid để nghiên cứu chiết xuất ở qui mô lớn 96 1.4. Nghiên cứu và lựa chọn đƣợc qui trình chiết xuất citroflavonoid ở qui mô phòng thí nghiệm (1 kg/mẻ) để áp dụng cho qui trình sản xuất ở qui mô lớn (>100 kg/mẻ) 98 1. 5. Đã triển khai quy trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid từ vỏ quả Citrus ở qui mô pilot (>100 kg/mẻ). 99 1.6. Xây dựng đƣợc tiêu chuẩn cơ sở cho vỏ quả Citrus và cho sản phẩm bột citroflavonoid 102 1.7. Tác dụng sinh học và độc tính của sản phẩm bột citroflavonoid 103 1.8. Độ ổn định của bán thành phẩm bột citroflavonoid 103 2. Phân tích hiệu quả kinh tế của việc sản xuất thử nghiệm bột citroflavonoid 103 2.1. Các số liệu thống kê về kinh tế của Qui trình chiết xuất 104 2.2. Phân tích về hiệu quả kinh tế nếu sản xuất thử nghiệm 105 3. Một số vấn đề còn tồn tại cần giải quyết 107 3.1. Khó khăn về tìm kiếm nguồn nguyên liệu cho chiết xuất lớn 107 3.2. Việc thực hiện chiết xuất ở qui mô pilot (≥ 120 kg) còn một số tồn tại 107 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 108 1. Kết luận 108 2. Kiến nghị 109 TÀI LIỆU THAM KHẢO 110 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Tổng hợp kết quả về diện tích trồng và sản lƣợng quả một số loài Citrus 26 Bảng 2. Dung môi rửa giải cho định lƣợng citroflavonoid 32 Bảng 3. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống 38 Bảng 4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của narigin và hesperidin 38 Bảng 5. Kết quả khảo sát độ lặp lại phƣơng pháp 38 Bảng 6. Kết quả khảo sát độ đúng của phƣơng pháp 40 Bảng 7. Kết quả xác định hàm lƣợng naringin và hesperidin trong các mẫu 42 Bảng 8. Số liệu 1 H và 13 C NMR của các chất CF-1 và CF-2 48 Bảng 9. Số liệu 1 H- và 13 C-NMR của các chất CF-3 và CF-4 trong DMSO 51 Bảng 10. Tác dụng dọn gốc tự do DPPH của các mẫu thử 53 Bảng 11. Tác dụng dọn gốc tự do superoxide của các mẫu thử 54 Bảng 12. Tác dụng dọn gốc tự do hydroxy của các mẫu thử 54 Bảng 13. Tác dụng chống oxy hóa lipid của các mẫu thử 55 Bảng 14. Tác dụng chống oxy hóa LDL của các mẫu thử 55 Bảng 15. Tác dụng chống oxy hóa của các chất phân lập đƣợc 56 Bảng 16. Kết quả loại tạp bằng phƣơng pháp tủa trong nƣớc 62 Bảng 17. Kết quả loại tạp bằng phƣơng pháp tủa trong cồn 62 Bảng 18. Kết quả loại tạp bằng phƣơng pháp tủa trong cồn-nƣớc lạnh 62 Bảng 19. Hiệu suất chiết xuất và hàm lƣợng citroflavonoid trong sản phẩm 64 Bảng 20. Hiệu suất sản phẩm chiết xuất và hàm lƣợng citroflavonoid trong sản phẩm 68 Bảng 21. Hiệu suất chiết xuất và hàm lƣợng citroflavonoid trong sản phẩm (quy mô pilot) 71 Bảng 22. Độ ẩm của các mẫu trần bì 75 Bảng 23. Độ tro toàn phần của các mẫu trần bì 76 Bảng 24. Độ tro không tan trong acid clohydric của các mẫu trần bì 76 Bảng 25. Kết quả xác định tạp chất của các mẫu trần bì 76 Bảng 26. Hàm lƣợng hesperidin trong các mẫu trần bì 78 Bảng 27. Kết quả xác định độ ẩm của các mẫu citroflavonoid 79 Bảng 28. Kết quả tro toàn phần của các mẫu citroflavonoid 80 Bảng 29. Hàm lƣợng % hesperidin trong các mẫu bột citroflavonoid 81 Bảng 30. Số liệu thử độc tính cấp của citroflavonoid 82 Bảng 31. Trọng lƣợng thỏ thí nghiệm ở các thời điểm theo dõi (kg) 83 Bảng 32. Kết quả theo dõi các chỉ số của máu thỏ ở các lô thí nghiệm 84 Bảng 33. Kết quả theo dõi các chỉ số thuộc chức năng gan thỏ ở các lô thí nghiệm 85 Bảng 34. Kết quả theo dõi các chỉ số thuộc chức năng thận thỏ ở các lô thí nghiệm 85 Bảng 35. Ảnh hƣởng của thuốc thử lên nồng độ triglycerid 87 Bảng 36. Ảnh hƣởng của thuốc thử lên nồng độ cholesterol toàn phần 88 Bảng 37. Ảnh hƣởng của thuốc thử lên nồng độ HDL- cholesterol 88 Bảng 38. Ảnh hƣởng của thuốc thử lên nồng độ LDL- cholesterol 88 Bảng 39. Kết quả quan sát đại thể và vi thể động mạch chủ 89 Bảng 40. Kết quả quan sát đại thể và vi thể gan 90 Bảng 41. Kết quả kiểm nghiệm bột citroflavonoid lần thứ 1 91 Bảng 42. Kết quả kiểm nghiệm bột citroflavonoid lần thứ 2 92 Bảng 43. Kết quả kiểm nghiệm bột citroflavonoid lần thứ 3 92 Bảng 44. Kết quả kiểm nghiệm bột citroflavonoid lần thứ 4 93 Bảng 45. Kết quả kiểm nghiệm bột citroflavonoid lần thứ 5 93 Bảng 46. Chi phí cho chiết xuất 120kg dƣợc liệu (1 mẻ chiết) ở qui mô nghiên cứu 105 Bảng 47. Dự kiến chi phí cho chiết xuất 1000kg dƣợc liệu ở quy mô sản xuất 106 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Cấu trúc cơ bản của các flavonoid trong vỏ quả của các loài Citrus. 5 Hình 2. Flavonoid nhóm flavan trong quả các loài Citrus và các glycosid của chúng 6 Hình 3. Flavonoid nhóm flavon và flavonon có trong vỏ quả các loài Citrus. 7 Hình 4. Các nhóm chức đem lại tác dụng chống oxy hóa mạnh cho flavonoid 8 Hình 5. Qui trình (I) chiết xuất flavonoid từ dƣợc liệu 10 Hình 6. Qui trình (II) chiết xuất flavonoid từ dƣợc liệu 11 Hình 7. Qui trình (III) chiết xuất flavonoid từ vỏ bƣởi 12 Hình 8. Qui trình (IV) chiết xuất flavonoid từ vỏ bƣởi 12 Hình 9. Sắc ký đồ của 4 hoạt chất tinh khiết có trong các loài Citrus 30 Hình 10. Sắc ký đồ của 4 hoạt chất tinh khiết có trong các loài Citrus 31 Hình 11. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn hỗn hợp hesperidin và naringin (trên), mẫu naringin (giữa) và mẫu hesperidin (dƣới). 33 Hình 12. Sắc ký đổ của mẫu chuẩn hỗn hợp (trên cùng), mẫu thu hái chứa hesperidin (vỏ quả quýt, giữa) và mẫu chứa naringin (vỏ bƣởi, dƣới cùng). 34 Hình 13. Sắc ký đổ của mẫu dƣợc liệu chỉ chứa naringin (trên), mẫu thử chỉ chứa hesperidin (giữa) và mẫu chứa cả hai chất này (dƣới) 39 Hình 14. Qui trình phân lập và tinh chế naringin (CF-1) từ dƣợc liệu 47 Hình 15. Cấu trúc hóa học của CF-1 (naringin) và CF2 (hesperidin) 48 Hình 16. Qui trình phân lập và tinh chế hesperidin (CF-2) từ dƣợc liệu 49 Hình 17. Nguyên tắc điều chế naringenin 50 Hình 18. Nguyên tắc điều chế hesperitin 52 Hình 19. Ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hiệu suất chiết xuất và hàm lƣợng citroflavonoid toàn phần trong sản phẩm 58 Hình 20. Ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến hiệu suất chiết xuất và hàm lƣợng citroflavonoid toàn phần trong sản phẩm 59 Hình 21. Ảnh hƣởng của thời gian và số lần chiết đến hiệu suất chiết xuất 59 Hình 22. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung môi chiết đến hiệu suất chiết xuất và hàm lƣợng citroflavonoid toàn phần trong sản phẩm 60 Hình 23. Ảnh hƣởng của kích thƣớc dƣợc liệu đến hiệu suất chiết xuất và hàm lƣợng citroflavonoid toàn phần trong sản phẩm 61 Hình 24. Sơ đồ quy trình chiết xuất citroflavonoid từ dƣợc liệu qui mô phòng thí nghiệm 65 Hình 25. Sơ đồ quy trình chiết xuất citroflavonoid từ vỏ quýt 69 Hình 26. Qui trình chiết xuất citroflavonoid ở qui mô pilot 73 Hình 27. Sắc ký đồ TLC định tính dƣợc liệu trần bì 77 Hình 28. SKĐ HPLC của hesperidin đối chiếu và dƣợc liệu trần bì 77 Hình 29. Đồ thị của phƣơng trình hồi qui 78 Hình 30. Sắc ký đồ TLC định tính bột citroflavonoid 80 Hình 31. Sắc ký đồ HPLC của hesperidin đối chiếu và mẫu bột citroflavonoid 81 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Chi Citrus là một chi lớn thuộc họ Cam (Rutaceae) và đƣợc cho là có nguồn gốc từ Đông Nam Á. Các cây thuộc chi Citrus thƣờng là các cây gỗ nhỏ hay cây bụi, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Quả mọng kiểu cam quít, ăn đƣợc. Vỏ quả ngoài chứa nhiều túi tiết tinh dầu, vỏ quả giữa màu trắng, xốp, vỏ quả trong có chứa những lông mọng nƣớc (đƣợc gọi là tôm, tép) có vị chua hay ngọt. Ở Việt Nam, chi Citrus có khoảng 20 loài và dƣới loài. Các cây Citrus rất phổ biến ở Việt Nam gồm có: 1) Bƣởi: tên khoa học là Citrus grandis (L.) Osbeck (tên đồng nghĩa C. decumana Murr. và C. maxima (Burm.) Merr.), đƣợc trồng từ lâu đời ở Việt Nam, phân bố khắp đất nƣớc; 2) Cam: C. sinensis (L.) Osbeck, (C. aurantium L.), đƣợc trồng từ lâu đời khắp đất nƣớc; 3) Chanh: tên khoa học C. limonia Osbeck (chanh kiên) đƣợc trồng nhiều ở miền Bắc và C. aurantifolia Swingle (chanh ta) đƣợc trồng nhiều ở miền Nam; 4) Quít: tên khoa học C. reticulate Blanco (C. nobilis Lour. ; C. chrysocarpa Lush.), nhiều giống quít nổi tiếng nhƣ: quít đƣờng (có vỏ dày), quít tiều, quít Bắc Sơn, quít hồng…; 5) Quất: C. japonica Thunb. (Fortunella spp), đƣợc trồng rất nhiều ở Hà Nội và các tỉnh lân cận chủ yếu làm cây cảnh. Thành phần hóa học chính của các loài Citrus là acid hữu cơ, alkaloid, carotenoid, coumarin, flavonoid, limonoid, tinh dầu và các vitamin đƣợc phân bố trong các bộ phận (rễ, thân, cánh, lá, và quả) của cây. Flavonoid là thành phần chính và quan trọng trong các loài Citrus, phân bố ở tất cả các bộ phận và đặc biệt có hàm lƣợng cao trong vỏ quả. Hiện nay số lƣợng flavonoid đã đƣợc phân lập và xác định từ vỏ quả các loài Citrus là khoảng hơn 60 chất, thuộc các nhóm flavanon, flavon, flavonol, và anthocyanin. Thành phần flavonoid chính có trong tất cả vỏ quả của các loài Citrus là các flavan. Các flavan aglycon và các flavan glycosid của chúng chiếm hàm lƣợng rất lớn trong vỏ quả của các loài Citrus, tới hơn 90% trong flavonoid toàn phần. Trong số các flavan, hay gặp và có hàm lƣợng lớn nhất là naringenin, hesperitin và đặc biệt các glycosid của chúng là naringin, hesperidin. Các chất này chiếm hàm lƣợng rất lớn, có thể tới 5−10% tính theo vỏ quả khô. Điều đặc biệt là narigenin, naringin, hesperitin, và hesperidin có hàm lƣợng lớn trong các loài thuộc chi Citrus nhƣng lại rất hiếm gặp ở các chi và họ khác. Vì vậy, chúng đƣợc coi là các flavonoid đặc trƣng của chi Citrus, và đƣợc gọi là citroflavonoid. Các citroflavonoid có rất nhiều các tác dụng sinh học đƣợc quan tâm, gồm có: 1) chống oxy hóa; 2) hạ cholesterol trong máu, góp phần điều hòa mỡ trong máu của ngƣời béo phì, ngƣời già, ngƣời bệnh; 3) chống viêm do ức chế các enzym gây ra quá trình viêm (cyclooxygenase, lipoxigenase, phospholipase, phosphodiesterase); 4) chống các bệnh tim mạch: có tác dụng làm bền thành mạch, chống vữa xơ động mạch, chống kết dính tiểu cầu và tăng tính thấm của mao mạch; và 5) chống ung thƣ. Về công dụng, các cây thuộc chi Citrus đƣợc trồng để thu hái quả. Bƣởi, cam, chanh, và quít là những loài thu hái quả quan trọng và phổ biến cả trên thế giới và Việt Nam. Vỏ quả và lá của các loài Citrus còn đƣợc sử dụng để khai thác tinh dầu phục vụ công nghiệp mỹ phẩm và thực phẩm. Tại các nƣớc Đông Á và Việt Nam, vỏ quả của các loài Citrus cũng đƣợc dùng trong y học cổ truyền và y học dân gian. Vỏ quít (C. reticulate) thái mỏng phôi khô, còn đƣợc 2 gọi là trần bì, đƣợc dùng làm thuốc chữa ho, hen, viêm họng có đờm. Quả cam chua (C. aurantium) thái phơi khô, đƣợc gọi là chỉ xác hay chỉ thực, đƣợc dung chữa chán ăn, không tiêu, đau bụng, nôn mửa. Trong công nghiệp Dƣợc phẩm, các flavonoid của chi Citrus đƣợc dùng làm thuốc điều trị bệnh rối loạn thành mạch máu. Các công ty Dƣợc phẩm hàng đầu thế giới của nƣớc Pháp đã đƣa ra một số sản phẩm có hoạt chất là các citroflavonoid nhƣ Daflon, Diosmin, Flebosmin, Cemaflavone, Circularine. Trong số này, sản phẩm thuốc Daflon của công ty Dƣợc phẩm Servier (Pháp) là nổi tiếng và bán chạy nhất. Thành phần chính của thuốc Daflon là phân đoạn flavonoid chiết xuất từ vỏ quả của các loài Citrus, hàm lƣợng 500 mg, gồm diosmin 450 mg và flavonoid tƣơng đƣơng với 50 mg hesperidin. Thuốc có tác dụng làm tăng trƣơng lực của tĩnh mạch, giảm ứ trệ ở tĩnh mạch, tăng sức bền ở mao mạch, đƣợc dùng điều trị các bệnh suy tĩnh mạch bạch huyết (nặng chân, đau chân, bứt rứt, đau chân, phù chân) và đặc biệt đƣợc dùng để điều trị bệnh trĩ. Các cây thuộc chi Citrus đƣợc trồng rất rộng rãi ở nƣớc ta với mục đích chính là lấy quả và làm cảnh. Nhân dân có sử dụng quả hoặc vỏ quả của một số loài để làm thuốc theo y học cổ truyền, y học dân gian, tuy nhiên, số lƣợng sử dụng là không nhiều vì nhu cầu thấp. Có thể dễ dàng nhận thấy sau khi sử dụng quả của các loài Citrus, vỏ quả giữa (còn đƣợc gọi là cùi) đƣợc đem vứt đi mà không đƣợc sử dụng gì cả. Đây là một nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc rất dồi dào, sẵn có quanh năm, là phế phẩm của ngành thực phẩm. Thế nhƣng hiện tại chƣa có sản phẩm nào có thành phần là các flavonoid chiết xuất từ vỏ của các loài Citrus đƣợc sản xuất bởi các công ty dƣợc phẩm Việt Nam trong khi chúng ta có nhu cầu rất lớn về các thuốc này. Tuy có một số nghiên cứu ở Việt Nam về việc ứng dụng các flavonoid để làm thuốc chữa bệnh, nhƣng chƣa có nghiên cứu cho qui mô công nghiệp và do đó chƣa thể triển khai đƣợc trong công nghiệp. Công nghệ hóa dƣợc và sản xuất dƣợc phẩm ở nƣớc ta nói chung và ở Hà Nội nói riêng, đã có những phát triển vƣợt bậc trong những năm qua. Chúng ta có thể triển khai những qui trình công nghệ chiết xuất và sản xuất thuốc trên những dây chuyền công nghệ mới của các công ty dƣợc phẩm. Tại Viện Dƣợc liệu cũng có dây chuyền chiết xuất hoạt chất và dây chuyền sản xuất viên bao phim ở qui mô bán công nghiệp (qui mô Pilot). Với những lý do kể trên, chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid từ vỏ quả các loài thuộc chi Citrus, họ Rutaceae”. Mục tiêu tổng quát của đề tài là xây dựng đƣợc qui trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid đạt tiêu chuẩn dƣợc dụng, có thể dùng để sản xuất các thuốc điều trị bệnh rối loạn thành mạch rất hiệu quả, đem lại nhiều lợi nhuận về kinh tế và xã hội. Các mục tiêu cụ thể của đề tài gồm có: 1. Xây dựng đƣợc qui trình công nghệ chiết xuất sản phẩm chứa trên 50% citroflavonoid từ vỏ quả của một số loài thuộc chi Citrus, họ Rutaceae làm nguyên liệu sản xuất thuốc. 2. Đánh giá đƣợc độc tính cấp, độc tính bán trƣờng diễn và tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh rối loạn thành mạch của sản phẩm. 3. Xây dựng đƣợc tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm bột citroflavonoid. 3 PHẦN I. TỔNG QUAN 1. CÁC LOÀI CITRUS Chi Citrus là một chi thực vật lớn thuộc họ Cam (Rutaceae) [1], [2], đƣợc cho là có nguồn gốc từ Đông Nam Á [3]. Các cây thuộc chi Citrus thƣờng là các cây gỗ nhỏ hay cây bụi, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Quả mọng kiểu cam quít, có múi, ăn đƣợc. Vỏ quả ngoài chứa nhiều túi tiết tinh dầu, vỏ quả giữa màu trắng, xốp, vỏ quả trong có chứa những lông mọng nƣớc (đƣợc gọi là tôm, tép) có vị chua hay ngọt [1], [2]. Có nhiều phân loại về các loài trong chi Citrus [3], [4]. Theo Engler thì có 9 loài [4], theo Swingle có 16 loài [5], còn Tanaka lại liệt kê 166 loài thuộc chi Citrus [6]. Ngày nay, đã có rất nhiều cá thể lai giữa các loài trong chi này nên phân loại rất phức tạp. Ở Việt Nam, chi Citrus có khoảng 20 loài và dƣới loài [1], [2], [7], [8], trong đó có các cây cho quả ăn rất phổ biến sau: - Bƣởi: tên khoa học là Citrus grandis (L.) Osbeck, (còn có các tên đồng nghĩa C. decumana Murr. và C. maxima (Burm.) Merr.). Đây là cây đƣợc trồng phổ biến ở các nƣớc Đông Nam Á và Nam Á. Ở Việt Nam, bƣởi là cây đƣợc trồng từ rất lâu đời, phân bố khắp đất nƣớc. Có nhiều giống bƣởi ở nƣớc ta, hay đƣợc biết đến nhƣ bƣởi Biên Hòa (Đồng Nai), Da Xanh (Bến Tre), Đoan Hùng (Phú Thọ), Năm Roi (Cần Thơ), Phúc Trạch (Hà Tĩnh). Tại Hà Nội có bƣởi Diễn cũng khá nổi tiếng. - Cam: tên khoa học Citrus sinensis (L.) Osbeck (cam vỏ nhẵn) và C. nobilis Lour. (cam sành). Cam là cây trồng thu hái quả phổ biến nhất, đƣợc trồng rộng rãi ở các nƣớc nhiệt đới và á nhiệt đới trên thế giới. Ở nƣớc ta cam cũng đƣợc trồng từ lâu đời. Ngày nay có nhiều giống cam quí đƣợc trồng ở nƣớc ta nhƣ cam Bố Hạ (Yên Thế, Bắc Giang), cam Vinh và cam xã Đoài (Nghệ An), cam Bắc Quang (Hà Giang). - Chanh: Citrus limonia Osbeck (chanh kiên) đƣợc trồng nhiều ở miền Bắc và C. aurantifolia Swingle (chanh ta) đƣợc trồng nhiều ở miền Nam. Tuy chanh đƣợc trồng nhiều nơi để lấy quả và lá, nhƣng năng suất quả thấp hơn các loài kể trên nên đƣợc trồng ít hơn cam và bƣởi. - Quít: Citrus reticulate Blanco, (C. nobilis Lour. và C. chrysocarpa Lush). Giống quít C. reticulate đƣợc trồng nhiều ở các nƣớc nhiệt đới. Ở nƣớc ta có nhiều giống quít nổi tiếng nhƣ: quít đƣờng (có vỏ dày), quít tiều, quít Bắc Sơn, quít hồng… Quít đƣợc trồng lấy quả ở các tỉnh miền núi phía bắc nhƣ Bắc Giang, Cao Bằng, Hà Giang, Lai Châu, Lạng Sơn, Thái Nguyên. Ở Hà Nội (Hà Tây cũ) cũng có nhiều vùng trồng quít. - Quất: Citrus japonica Thunb., (Fortunella spp.), có nguồn gốc từ Trung Quốc, ngày nay đƣợc trồng nhiều tại các nƣớc nhiệt đới và bán nhiệt đới. Ở Việt Nam quất đƣợc trồng rất nhiều ở Hà Nội và các tỉnh lân cận với mục đích làm cây cảnh, trang trí cho ngày Tết là chính. Vùng trồng quất nổi tiếng là Quảng Bá, Quảng An, Tứ Liên. Ngày nay thì các tỉnh lân cận Hà Nội cũng trồng nhiều, và đã đƣợc di thực vào miền Nam. Mặc dù quất ra rất nhiều quả nhƣng ít đƣợc dùng làm thức ăn hơn các loài Citrus kể trên. - Chấp: C. aurantium L., đƣợc trồng nhiều tại miền bắc. 4 - Phật thủ: Citrus medica L. var. sarcodactylis (Sieb.) Swingle Các loài liệt kê ở trên là các loài có nguồn gốc từ châu Á, đã đƣợc trồng trọt từ lâu. Ngày nay, đã có rất nhiều cá thể lai mà chúng ta không xác định đƣợc chính xác tên loài [4], nhƣng để xác định các cá thể thuộc chi Citrus là tƣơng đối dễ dàng. Về công dụng, các cây thuộc chi Citrus đƣợc trồng để thu hái quả. Bƣởi, cam, chanh, và quít là những loài thu hái quả quan trọng và phổ biến trên cả trên thế giới và ở Việt Nam. Vỏ quả và lá của các loài Citrus còn đƣợc sử dụng để khai thác tinh dầu phục vụ công nghiệp mỹ phẩm và thực phẩm. Tại các nƣớc Đông Á, lá và vỏ quả của các loài Citrus cũng đƣợc dùng trong y học cổ truyền và y học dân gian [7], [8]. Trong công nghiệp Dƣợc phẩm, các flavonoid của chi Citrus đƣợc dùng làm thuốc điều trị bệnh rối loạn thành mạch máu. 2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI CITRUS 2.1. Thành phần hóa học Các cây Citrus đã đƣợc các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu rất kỹ về thành phần hóa học. Các thành phần hóa học chính của chúng là acid hữu cơ, alkaloid, coumarin, tinh dầu và các vitamin đƣợc phân bố trong các bộ phận (rễ, thân, cánh, lá, và quả) của cây. ● Carotenoid: các carotenoid có trong vỏ quả các loài Citrus là các chất sắc tố từ vàng đến đỏ cam và tan trong tinh dầu vỏ [9]. Các chất thƣờng gặp là caroten (, , ), cryptoxanthin, auroxanthin [9]. ● Tinh dầu: vỏ quả ngoài của tất cả các loài Citrus chứa một lƣợng lớn tinh dầu nằm trong túi tiết [10], [11]. Thành phần trong tinh dầu rất đa dạng, bao gồm các monoterpen, các alcol, các aldehyd, các ester, ether, và các ceton. Một số thành phần chính trong tinh dầu Citrus có thể kể đến là cymen, geraniol, geranial, limonene (chiếm hơn 80%), -pinen, - pinen, sabinen, terpinen, terpinolen… Vỏ quả của các loài Citrus thu hái tại nhiều nơi ở Việt Nam cũng đƣợc xác định có chứa hàm lƣợng lớn về tinh dầu [12]. Tinh dầu Citrus có tác dụng chống oxy hóa, chống ung thƣ, kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm [10], [13]. Tinh dầu đƣợc sử dụng trong công nghiệp làm mỹ phẩm và làm gia vị [10]. ● Limonoid: đây là thành phần đặc trƣng và có hàm lƣợng lớn của các cây thuộc họ Rutaceae và Meliaceae nói chung, chi Citrus nói riêng [14], [15]. Về cấu trúc hóa học, limonoid là các dẫn chất của triterpen có chứa nhiều oxy trong phân tử và có một vòng furan ở vị trí C-17, tồn tại cả ở dạng aglycon tự do và dạng glycosid [14], [15]. Một số limonoid có vị đắng và đây chính là nguyên nhân gây ra vị đắng trong vỏ quả và cả dịch quả của các loài Citrus [14]. Các limonoid có các tác dụng sinh học chống ung thƣ, giảm cholesterol trong máu, có tác dụng diệt côn trùng và ký sinh trùng sốt rét, kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm, và kể cả chống HIV [14], [15]. ● Coumarin: các coumarin có nhiều trong các cây thuộc họ Rutaceae nói chung [10], [17], [18], [19], [20]. Tuy nhiên hàm lƣợng coumarin trong vỏ quả thấp hơn trong rễ, thân, cành [18]. Vì coumarin là các chất ít phân cực nên có thể tìm thấy trong tinh dầu của vỏ quả, nhƣng cũng có thể tìm thấy trong vỏ quả trong [10], [18]. Một số coumarin hay gặp trong các loài Citrus là bergamottin, bergapten, imperatorin, isoimperatorin, osthol, psoralen Coumarin có các tác [...]... LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu là vỏ quả của các loài Citrus thu hái tại Việt Nam và các hoạt chất flavonoid của chúng 2 NGUYÊN LIỆU 2.1 Nguyên liệu cho chiết xuất Sau khi khảo sát các loài trên về nguồn liệu, hàm lƣợng citroflavonoid, chiết xuất citroflavonoid ở qui mô nhỏ, vỏ quả của một (hoặc vài) loài Citrus sẽ đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu về xây dựng qui... trọt để tăng giá trị kinh tế Vẫn còn có ít nghiên cứu về các citroflavonoid Năm 1990, Nguyễn Thị Chung đã có nghiên cứu về chiết xuất và bào chế các flavonoid từ vỏ quả của một số loài Citrus ở Việt Nam ở qui mô nhỏ [39] Gần đây, Võ Văn Lèo đã thực hiện luận án nghiên cứu về các loài Citrus thu hái ở miền nam Đây là nghiên cứu sâu và toàn diện về thành phần citroflavonoid [40] Tác giả đã công bố một... nguyên liệu vỏ quả Citrus phù hợp nhất phục vụ cho nghiên cứu chiết xuất Nó cũng góp phần định hƣớng cho việc thu mua nguồn nguyên liệu cho chiết xuất khi có ứng dụng trong thực tiễn về sau 2 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG CITROFLAVONOID TRONG MẪU VỎ QUẢ CITRUS VÀ CHẾ PHẨM CHIẾT XUẤT 2.1 Xây dựng phƣơng pháp Định tính các citroflavonoid 2.1.1 Nguyên tắc Theo các nghiên cứu trƣớc đây... - Quy mô mẻ chiết: 1 kg dƣợc liệu/mẻ - Tiêu chí đánh giá qui trình: hiệu suất chiết xuất, hàm lƣợng citroflavonoid trong sản phẩm chiết xuất, tính khả thi của qui trình (dùng dung môi ít độc, rẻ tiền, quy trình đơn giản dễ áp dụng cho sản xuất quy mô lớn) - Khảo sát độ ổn định của qui trình chiết xuất về hiệu suất chiết xuất, hàm lƣợng citroflavonoid trong sản phẩm dựa trên ít nhất 06 mẻ chiết 4.4 Triển... nghệ chiết xuất citroflavonoid ở qui mô pilot [48] - Áp dụng qui trình chiết xuất đã xây dựng ở quy mô phòng thí nghiệm với khối lƣợng mẻ chiết lớn hơn (≥ 100 kg/mẻ) trên dây chuyền thiết bị quy mô pilot - Điều chỉnh các thông số kỹ thuật phù hợp để đạt hiệu quả chiết xuất cao, tiết kiệm đƣợc dung môi và năng lƣợng - Khảo sát độ ổn định của qui trình chiết xuất về hiệu suất chiết xuất, hàm lƣợng citroflavonoid. .. Nếu muốn có qui trình sản xuất ở qui mô công nghiệp thì phải có nghiên cứu đầy đủ, từ nguồn nguyên liệu, lựa chọn hoạt chất, lựa chọn nguyên liệu, qui trình chiết xuất, hiệu suất chiết xuất, hàm lƣợng các citroflavonoid trong sản phẩm, hiệu quả kinh tế… Vấn đề cần giải quyết ở đây là qui trình công nghệ chiết xuất citroflavonoid ở qui mô công nghiệp để có thể áp dụng cho sản xuất lớn Trong đề tài này,... Thuốc Daflon đã đƣợc lƣu hành ở Việt Nam từ lâu và bán rất chạy trên thị trƣờng Hiện tại chƣa có sản phẩm nào có thành phần là các flavonoid chiết xuất từ vỏ của các loài Citrus đƣợc sản xuất bởi các công ty dƣợc phẩm Việt Nam trong khi chúng ta có nhu cầu rất lớn về các thuốc này 4 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VỀ CITROFLAVONOID Các nghiên cứu trong nƣớc về chi Citrus lại chủ yếu về tinh dầu, dinh dƣỡng,... dung môi độc hại, đắt tiền (n-hexan, CHCl3, EtOAc) và có hiệu suất chiết xuất không cao Các qui trình này chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu, chiết tách và phân lập flavonoid từ dƣợc liệu Tác giả Võ Văn Lẹo có đƣa ra 3 qui trình chiết xuất hesperidin và naringin [40] là chiết ngấm kiệt hoặc chiết nóng với cồn (Hình 7, qui trình III) và chiết với nƣớc nóng (Hình 8, qui trình IV) Qui trình III tƣơng tự... định tính và định lƣợng: + Hàm lƣợng citroflavonoid toàn phần + Hàm lƣợng hesperidin + Hàm lƣợng naringin 4.3 Xây dựng qui trình chiết xuất citroflavonoid qui mô phòng thí nghiệm [42], [46], [47] - Xây dựng quy trình chiết xuất dựa trên các khảo sát về dung môi dùng để chiết xuất, kích thƣớc dƣợc liệu phù hợp, tỷ lệ giữa dƣợc liệu và dung môi, nhiệt độ chiết, thời gian chiết, năng lƣợng cần đủ - Loại tạp... Nếu tận dụng đƣợc, chúng ta có thể sản xuất trong nƣớc mà không phải nhập khẩu thuốc hay nguyên liệu làm thuốc nữa Thực tế thì vẫn còn ít nghiên cứu về qui trình chiết xuất các citroflavonoid ở Việt Nam Các qui trình đã đƣợc nêu trong phần tổng quan là các qui trình đƣợc áp dụng trong nghiên cứu cơ bản ở mô hình phòng thí nghiệm, đƣợc xây dựng thông qua các nghiên cứu cơ bản phục vụ luận văn tốt nghiệp, . (I) chiết xuất flavonoid từ dƣợc liệu 10 Hình 6. Qui trình (II) chiết xuất flavonoid từ dƣợc liệu 11 Hình 7. Qui trình (III) chiết xuất flavonoid từ vỏ bƣởi 12 Hình 8. Qui trình (IV) chiết xuất. flavonoid để nghiên cứu chiết xuất ở qui mô lớn 96 1.4. Nghiên cứu và lựa chọn đƣợc qui trình chiết xuất citroflavonoid ở qui mô phòng thí nghiệm (1 kg/mẻ) để áp dụng cho qui trình sản xuất ở qui. sát các điều kiện chiết xuất citroflavonoid từ dƣợc liệu 57 7.2.1. Khảo sát dung môi chiết 57 7.2.2. Khảo sát nhiệt độ chiết xuất 58 7.2.3. Khảo sát thời gian và số lần chiết xuất 59 iii 7.2.4.