Các kỹ thuật chẩn đoán lao tại BV Phạm Ngọc Thạch

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM VI SINH CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO ĐANG ÁP DỤNG TẠI BV.PNT KHOA VI SINH BV.PHẠM NGỌC THẠCH ISO 15189 2007 1 CÁC YÊU CẦU CHO MỘT XÉT NGHIỆM VI SINH CHẨN ĐOÁN  Nhanh  Độ nhậy và độ đặc hiệu  Đơn giản  Dễ thực hiện  Rẻ tiền  An toàn cho môi trường  Không độc hại ISO 15189 2007 2 WHO Khuyến cáo về các kĩ thuật chẩn đoán lao, lao đa kháng Soi kính Kính hiển vi ánh sáng thường Kinh hiển vi huỳnh quang thông thường Kính hiển vi huỳnh quang đèn LED Nuôi cấy , định danh Kháng sinh đồ Thuốc chống lao hàng 1 Thuốc chống lao hàng 2 Sinh học phân tử ISO 15189 2007 3 QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN CỦA CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN VK LAO ISO 15189 2007 4 1880s Phương pháp nhuôm ZiehlNeelsen 1900s Mantoux test (tuberculin) 1920s Purified Protein Derivative (PPD) 1930s LowensteinJensen 1940s Dubos agar, Ogawa 1950s Middlebrook 7H9 1990s Khuyếch đại a xít Nucleic 2000s ELISPOT, QuantiFERON 20XX Hain, Xpert ????? Soi TT Miễn dịch Nuôi cấy SHPT SOI KÍNH HIỂN VI Tìm sự hiện diện của AFB trong mẫu bệnh phẩm  Phương pháp soi trực tiếp : Làm tiêu bản trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm  Phương pháp soi thuần nhất: Làm tiêu bản từ mẫu bệnh phẩm đã được xử lý.  Nhuộ m Ziehl – Neelsen : S = 4560% , Sp = 99%  Nhuộ m Auramin : S = 45 – 80% , Sp > 90% Bệnh phẩm áp dụng: TẤT CẢ CÁC LOẠI BỆNH PHẨM ISO 15189 2007 5 SOI KÍNH HIỂN VI (tt) Ưu điểm:  Đơn giản, rẻ tiền, Cho kết quả trong vòng 2 giờ  Phát hiện được nguồn lây  Giúp theo dõi kết quả điều trị .  Kỹ thuật đơn giản. Nhược điểm:  Độ nhạy thấp. Mẫu bệnh phẩm phải có từ > 5000 vi khuẩn 1 ml , mới có kết quả dương tính.  Không phân biệt được MTB với NTM  Không phân biệt được VK sống hay chết; VK kháng thuốc. ISO 15189 2007 6 SOI KÍNH HIỂN VI (tt)  Nghiên cứu so sánh độ nhạy của soi trực tiếp và thuần nhất từ bệnh phẩm đàm: không có sự khác biệt về ĐỘ NHẠY giữa 2 phương pháp  Không có đủ bằng chứng thuyết phục cho thấy xử lí đờm bằng hoá chất, hoặc li tâm cho kết quả tốt hơn làm tiêu bản trực tiếp nên việc sử dụng các kỹ thuật này trong chương trình chống lao không được khuyến cáo. ISO 15189 2007 7 Đọc kết quả (KQ KHQ được quy đổi sang ZN) Kết quả ZN Kết quả trên phiếu yêu cầu 0 AFB 0 AFB 100 qt 0 AFB Ghi số cụ thể 19 AFB 100 qt AFB 4 AFB 1+ 1099 100 qt AFB 1+ 2+ 1 10 AFB 1 qt AFB 2+ 3+ >10 AFB 1 qt AFB 3+ ISO 15189 2007 8 Nuôi cấy và định danh ISO 15189 2007 9 Ưu điểm Chẩn đoán xác định MTB Độ nhạy cao, tăng số BN phát hiện (30%50% so với STT) Chẩn đoán ở giại đoạn sớm (trước khi thành nguồn lây chính) Phân lập được chủng VK để làm KSĐ, Nghiên cứu... Nhược điểm Phức tạp, Giá thành cao; chuẩn bị môi trường, xử lí bệnh phẩm Thời gian kéo dài (VK mọc) Trang thiết bị đặc chủng Đòi hỏi kĩ năng của KTV Điều kiện ATSH Hạn chế Việc khử tạp cũng giết chế một phần vi khuẩn lao LOD: 100 bacilliml sputum •Cấy lỏng nhạy hơn 10%, nhanh hơn vài tuần, nhưng có tỉ lệ ngoại nhiễm cao hơn Cấy đặc và đòi hỏi điều kiện ATSH cao hơn •Định danh chỉ xác định MTB và NTM •Các kỹ thuật định danh: SVHH, miễn dịch, SHPT Phương pháp nuôi cấy Có 2 phương pháp:  Nuôi cấy trên môi trường đặc – Cấy LJ OGAWA  Nuôi cấy trên môi trường lỏng – Cấy MGIT  Được coi như “tiêu chuẩn vàng” vì có thể định danh được VK lao với độ đặc hiệu > 98% Bệnh phẩm áp dụng: TẤT CẢ CÁC LOẠI BỆNH PHẨM ISO 15189 2007 10 QUY TRÌNH XN LAO TẠI PXN ISO 15189 2007 11 Mẫu bệnh phẩm Xử lý mẫu Nuôi cấy TBNTM 68 tuần Nhuộm soi Âm tính Dương tính Định danh KSĐ Nuôi cấy trên môi trường đặc Nguyên tắc:  VK lao có khả năng mọc trên một số môi trường đặc biệt tạo thành các khuẩn lạc trên bề mặt môi trường có thể quan sát bằng mắt thường . Thời gian (+) trung bình 3 6 tuần ; () 8 tuần  Bệnh phẩm lâm sàng gửi tới PXN để cấy tìm VK lao nếu không đảm bảo vô trùng thì sẽ được khử tạp để loại bỏ các VK thông thường các loại VK mọc nhanh. ISO 15189 2007 12 Đọc và ghi nhận KQ cấy Đọc Báo cáo KQ Các khuẩn lạc mọc dầy khắp mặt môi trường (>500 khuẩn lạc) 4+ Mọc nhiều > 200 khuẩn lạc, nhưng không đầy khắp mặt môi trường 3+ 100 ~ 200 khuẩn lạc 2+ 20 ~ 100 khuẩn lạc 1+ < 20 khuẩn lạc Ghi số khuẩn lạc đếm được Không mọc Âm tính Ngoại nhiễm Ngoại nhiễm ISO 15189 2007 13 Nuôi cấy trên môi trường lỏng BACTEC MGIT 960  960 vị trí đặt tuýp  Thời gian nuôi cấy: (+) 7 21 ngày () 6 tuần  Áp dụng cho tất cả các loại bệnh phẩm lâm sàng trừ máu và nước tiểu ISO 15189 2007 14 Cấy âm tính Ít hoặc không phát quang Cấy dương tính Phát quang mạnh Vị trí nhạy cảm ở giữa Bề mặt Nguyên lý ISO 15189 2007 15 F F F F FO2 FO2 F F F F CO2 O2 O2 O2 O2 O2 F F FO2 FO2 FO2 FO2 FO2 F FO2 FO2 CO2 O2 O2 O2 O2 O2 O2 O2 O2 CO2 CO2 O2 Cấy vào môi trường ISO 15189 2007 16 Đọc kết quả ISO 15189 2007 17 ISO 15189 2007 18 M. TB, NTM Yếu tố thừng NTM Ngoại nhiễm tạp khuẩn Một số phiếu KQ nuôi cấy ISO 15189 2007 19 MA = MOTT = NTM  Tỷ lệ ≈ 7%  Nhóm sinh trưởng nhanh ( M. fortuitum, M. chelonae …)  Nhóm sinh trưởng chậm (MAC , M. kansasii , M. marinum )  Nhóm sinh trưởng chậm khác ( M. simiae complex, M. xenopi …. )  Nhóm sinh trưởng khó ( M. haemophilium, M. ulcerans) Thu thập mẫu bệnh phẩm  Mẫu thu thập trong lọ vô trùng, có nắp vặn chặt  Lưu trữ lạnh nếu thời gian chuyển mẫu đến phòng XN > 1 giờ  Không cần môi trường vận chuyển hay chất bảo quản  Mẫu bệnh phẩm hô hấp : thu thập 3 mẫu sáng sớm trong 3 ngày khác nhau  Mẫu dịch thể, ápxe, mô : hút hay cắt chứ không dùng gạc để lấy mẫu. Mẫu mô có thể ngâm trong ít nước muối vô trùng để tránh bị khô. Định danh NTM  Hình thái vi khuẩn, sắc tố  Thời gian sinh trưởng  Sinh hóa  Hain test  DNA Sequence hay PCR ELISA DST NTM  Mối tương quan giữa DST in vitro và đáp ứng lâm sàng : hạn chế  Ngưỡng kháng của nhiều loại NTM không có ý nghĩa lâm sàng (xác định ngưỡng cho từng loài)  Độ lặp lại kém  Cẩn trọng khi sử dụng DST vì nhiều bệnh NTM không đáp ứng điều trị khi dựa trên kết quả DST in vitro  Không làm DST cho NTM nhóm sinh trưởng nhanh trên môi trường agar vì kết quả mâu thuẫn  DST trong môi trường broth Điều trị NTM ISO 15189 2007 24 Điều trị theo cá thể Phối hợp thuốc Thời gian điều trị ??? Theo dõi điều trị ??? đến khi cấy () Một số ví dụ về điều trị NTM  M. kansasii: rifampin, isoniazid, ethambutol, ethionamide, streptomycin, and clarithromycin  M. fortuitum : macrolides và quinolones, doxycycline và minocycline, sulfonamides . Một số nghiên cứu mức độ nhạy cảm amikacin (100%), ciprofloxacin ofloxacin (100%), sulfonamides (100%), cefoxitin (50%), imipenem (100%), clarithromycin (80%), doxy cycline (50%)  M. chelonae: tobramycin (l00%), clarithromycin (l00%), linezolid (90%), imipenem (60%), amikacin (50%), clofazimine, doxycycline (25%), and ciprofloxacin (20%) Nhóm mọc nhanh: Kháng tự nhiên với các thuốc kháng lao ISO 15189 2007 25 Kháng sinh đồ ISO 15189 2007 26 Ưu điểm Chẩn đoán xác định lao kháng thuốc Là tiêu chuẩn vàng Các kỹ thuật: KSĐ gián tiếp  Kiểu hình: KSĐ trên môi trường đăc; môi trường lỏng  Các thuốc: Hàng 1: H, S, R, E, Z Hàng 2: Of, Km, Cm, Am Nhược điểm Thời gian dài: 42 ngày Phải có chủng thuần Áp dụng Mẫu cấy dương tính MTB Hạn chế: Một số thuốc chống lao hàng 2 hiện không thực hiện vì KQ không chính xác KQ KSĐ ISO 15189 2007 27 Không thực hiện KSĐ ISO 15189 2007 28 Sự kháng chéo giữa các thuốc chống lao  Các thuốc có chung liên hóa học: Nhóm I thuốc tổng hợp: Isoniazid, Ethionamid, Thiacetazon, Kanamycin, Capreomycin Ethionamid – Thiacetazon: CS.NH 2 Isoniazid – Ethionamid: NHNH 2 (kháng H ở nồng độ thấp) Nhóm II kháng chéo một chiều Kanamycin Capreomycin Kanamycin Steptomycin ISO 15189 2007 29 WHO Khuyến cáo về các kĩ thuật chẩn đoán lao, lao đa kháng Sinh học phân tử ISO 15189 2007 30 Ưu điểm Nhanh, Chuẩn hóa Không đòi hỏi điều kiện ATSH cao so với KSĐ LPAs được WHO chứng thực 2008 Nhược điểm LPAs chỉ được thực hiện với mẫu soi dương (V1) Hạn chế LPAs chỉ áp dụng được tại các PXN tuyến trung ương Xpert được WHO chứng thực 2011, nhanh, đơn giản, thực hiện cả với mẫu soi âm, không đòi hỏi điều kiện ATSH cao, phù hợp với các PXN tuyến dưới Kỹ thuật MTBDR plus ( Hain test)  Hain test dựa trên kỹ thuật lai với đoạn dò đặc hiệu gắn trên thanh giấy, cho phép định danh VK lao MTB complex và tính đề kháng đối với R và H  Bệnh phẩm: từ mẫu cấy dương hoặc tất cả các mẫu bệnh phẩm trừ : Mẫu mô Máu nước tiểu phân, ISO 15189 2007 31 ISO 15189 2007 32 RIFRES INHRES MDR SENSITIVITY 93.2% 92.7% 89% SPECIFICITY 100% 100% 100% PPV 100% 100% 100% NPV 93% 92.8% 89.8% Performance of the Hain MTBDR plus assay to predict drug resistance (n=111, Culture) ISO 15189 2007 33 RIFRES INHRES MDR SENSITIVITY 93.5% 88.7% 86.7% SPECIFICITY 96.7% 97.8% 96.7% PPV 94.7% 97.9% 94.2% NPV 95.9% 88.2% 92.2% Performance of the Hain MTBDR plus assay to predict drug resistance (n=198, sputum) Nguyên lý của reverse line blot ISO 15189 2007 34 Quy trình ISO 15189 2007 35 Diễn giải kết quả Hain test : Phát hiện vi khuẩn lao Kháng sinh đồ: RIF và INH ISO 15189 2007 36 MTB RIF INH Các trường hợp đặc biệt Có thể có vi khuẩn lao nhưng số lượng ít không phát hiện được ISO 15189 2007 37 Nên cấy để chẩn đoán xác định Kết quả ISO 15189 2007 38 Nếu soi AFB (+): nhiều khả năng là MOTT: nên cấy để chẩn đoán xác định Nếu soi AFB () và nghi ngờ BN bị lao: nên cấy để chẩn đoán xác định Kết quả ISO 15189 2007 39 Có thể do vi khuẩn quá ít Nên cấy và thực hiện Hain từ mẫu cấy (+) Trường hợp đặc biệt  KSĐ : nhạy RIF và INH  Hain test : Nhạy Rif và kháng INH ( 3 lần đều như nhau)  Lý do : Hain đột biến gen inhA kháng INH nồng độ thấp nên KSĐ không phát hiện được Đột biến gen inhA Kháng INH nồng độ thấp Đột biến gen katG Kháng INH nồng độ cao Thực hiện Hain test TRONG VÒNG 2 NGÀY = KẾT QUẢ Khoa VS: Làm Hain vào 2 ngày thứ 2 và thứ 5 Trả KQ : Thứ 3 thứ 6 Sắp tới: Có làm tiếp hay không ??? ISO 15189 2007 42 GeneXpert Khuyếch đại acid nucleic (NAAT ) Cepheid Xpert MTBRIF Xác định phân tử MTB và kháng RIF (rpoB) Ưu điểm : Mẫu đàm AFB(+) và () Các loại bệnh phẩm khác (hạn chế số liệu bằng chứng) Hệ thống kín và tự động hoàn tòan, gọn nhẹ Kết quả ~ 2h Không đòi hỏi yêu cầu an toàn sinh học Thao tác dễ, đơn giản ISO 15189 2007 43 Nhược điểm : Đối tượng chẩn đoán liên quan tới PPV Hiệu chỉnh máy hàng năm ( gửi về nơi sản xuất ) Phòng máy lạnh Giá thành còn cao so với soi , cấy Phần mềm chưa Việt hóa ISO 15189 2007 44 Xpert MTBRIF ISO 15189 2007 45 http:www.who.inttbfeatures_archivenew_rapid_testenindex.html WHOendorsed December, 2010 ISO 15189 2007 46 XPERT MTBRIF Độ nhạy Đặc hiệu Cấy (+) Soi (+) cấy (+) Soi ()cấy(+) Không lao 3 mẫu đàm n=xy (%) 723741 (97.6) 566567 (99.8) 157174 (90.2) 604616 (98.1) 2 mẫu đàm n=xy (%) 14231482 (96.0) 11271134 (99.4) 296348 (85.1) 12151232 (98.6) 1 mẫu đàm n=xy (%) 675732 (92.2) 551561 (98.2) 124171 (72.5) 604609 (99.2 ISO 15189 2007 47 Catharina C Boehme et al. NEJM, 2010 Catharina C Boehme et al. NEJM, 2010 ISO 15189 2007 48 ISO 15189 2007 49 1. Bình Thuận 2. Ninh Thuận 3. Bà Rịa Vũng tàu 4. TP.HCM 5. Đồng Nai 6. Tây Ninh 7. Long An 8. Bến Tre 9. Đồng Tháp 10. Tiền Giang 11. Sóc Trăng 12. Cà Mau 13. Cần Thơ 14. Bạc Liêu 15. Kiên Giang 16. An Giang Nguồn: WHO Policy Framework for implementing New Tuberculosis Diagnostics 2010 ISO 15189 2007 50 ISO 15189 2007 51 CHÂN THÀNH CÁM ƠN SỰ CHÚ Ý THEO DÕI