VI KHUẨN BACILLUS ANTHRACIS VÀ BỆNH THAN - Phần 1 TÍNH CHẤT VI SINH HỌC Hình dạng vi the Bacillus anthracis là một trực khuẩn Gram dương lớn, sinh nha bào, không di động. Trên phết nhuộm từ mô bệnh, vi khuẩn đứng đơn hay thường sắp xếp thành chuỗi ngắn, nang polypeptid có thể trông thấy bằng cách nhuộm Giemsa, mực Tàu, hay polychrome methylene blue. Trong cơ thể động vật vi khuẩn không tạo nha bào. Khi để vi khuẩn ra ngoài không khí thì sự sinh nha bào bắt đầu xảy ra, tốc độ tùy thuộc vào nhiệt độ và điều kiện khác của môi trường. Biến dưỡng Vi khuẩn mọc tốt trên môi trường bình thường như thạch dinh dưỡng, thạch máu, không tiêu huyết. Khúm của dòng độc lực thì xám trắng, hơi thô ráp, bờ hơi uốn lượn không tròn đều. Phết nhuộm cho thấy vi khuẩn hình que thẳng, xếp thành chuỗi dài. Nang chỉ được thấy nếu môi trường cấy chứa 0,7% bicarbonate hoặc 5% huyết thanh và ủ trong khí trường có 5-10% CO 2 , khi đó khúm trơn láng và nhày. Vào cuối thời kỳ tăng trưởng lũy thừa, nha bào bắt đầu xuất hiện trong nuôi cấy và rất nhiều sau 48 giờ. Nha bào hình bầu dục, nằm giữa hay gần một đầu tế bào vi khuẩn và không làm phồng tế bào. Nha bào đề kháng cao với nhiệt, lạnh, khô, tia cực tím, pH cao hoặc thấp, hóa chất tẩy uế và sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn khác. Mặc dù tăng trưởng tốt nhất trong điều kiện hiếu khí, vi khuẩn bệnh than cũng tăng sinh trong điều kiện kỵ khí tuyệt đối. Điều kiện hiếu khí cần thiết cho sự sinh nha bào chứ không cần cho sự nảy mầm. 1 Bộ môn Vi sinh Khoa Y, Đại học Y Dược TP HCM 2 Khoa Vi sinh, Bệnh viện Chợ Rẫy Vi khuẩn lên men nhiều loại đường như glucose, sucrose, maltose, fructose, Hoạt tính protease, amylase, catalase, lecithinase, collagenase được chứng tỏ với nước lọc canh cấy hay dịch thuần nhất tế bào (homogenate). Tính chất kháng nguyên - Nhóm kháng nguyên tế bào (kháng nguyên thân): Ngoài polysaccharide ở vách tế bào, vi khuẩn còn có một týp kháng nguyên nang duy nhất thành phần là g-polypeptide của acid D-glutamic. Nang có tính kháng thực bào và có vai trò trong tính gây bệnh vì dòng biến dị không nang thì không có độc lực. Tuy nhiên vai trò này chỉ giới hạn trong việc hình thành nhiễm khuẩn. Do vậy kháng thể chống nang không bảo vệ được. - Kháng nguyên polysaccharide vách chứa đồng lượng N-acetyl glucosamine và D-galactose. Trong vách tế bào nó liên kết với một peptide chứa acid diaminopimelic. Kháng nguyên này phản ứng chéo với polysaccharide týp 14 của phế cầu khuẩn và nhóm máu A của người. Kháng thể chống kháng nguyên này không có tính bảo vệ. - Nhóm kháng nguyên thành phần ngoại độc tố: 3 yếu tố PA, EF và LF. Tính chất biến dị di truyền Gây đột biến từ dòng B. anthracis hoang dại cho thấy nhiều khác biệt về độc lực, nhu cầu dinh dưỡng, tính nhạy cảm với kháng sinh, với bacteriophage và với lysozyme. Cấy truyền nhiều lần trong môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ 42,5 o C dòng hoang dại dần dần trở nên mất độc lực. Không phải tất cả dòng có nang đều là dòng độc lực, nhưng chỉ có những dòng vừa sản xuất nang vừa tiết ngoại độc tố trong cơ thể ký chủ thì mới có tính sinh bệnh cao. Sự tạo nha bào và độc lực không liên hệ nhau, vì nhiều dòng đột biến không tạo nha bào vẫn còn độc lực. VI SINH LÂM SÀNG Nếu nghĩ đến bệnh than, tất cả bệnh phẩm và nuôi cấy vi khuẩn phải được xử lý và xem xét hết sức cẩn thận trong phòng cách ly có trang bị tủ cấy an toàn sinh học cấp 2. Tủ an toàn phải đảm bảo vận hành tốt, nhất là luồng không khí lưu thông, tủ phải được lau chùi sạch bằng dung dịch tẩy uế trước và sau khi sử dụng. Hạn chế người vào ra phòng này nếu không được phân công. Thay giày, áo choàng trước khi vào phòng. Mọi thao tác phải tránh tạo ra những hạt khí dung nhiễm khuẩn. Nhân viên xét nghiệm phải mặc áo choàng, mang khiên che mặt (hoặc ít nhất phải có khẩu trang, kính bảo vệ mắt) và găng lúc thao tác với bệnh phẩm. Không nhất thiết chủng ngừa cho nhân viên. Khi xong việc, mọi dụng cụ đã dùng phải hấp tiệt trùng, các bề mặt tủ an toàn và bàn xét nghiệm phải được tẩy uế. Những vật lấy ra khỏi tủ an toàn như phiến phết để soi kính hiển vi cũng phải thực hành cẩn trọng. Các dụng cụ bị nhiễm như pipét, kim, lam kính, phải được ngâm trong dung dịch tẩy uế trước khi đem đi hấp. Trong trường hợp huyền dịch chứa vi khuẩn tràn ra bề mặt thì phải phủ dung dịch tẩy uế lên ít nhất là 5 phút đối với bệnh phẩm có mật độ nha bào thấp và ít nhất là 1 giờ đối với bệnh phẩm có mật độ nha bào cao trước khi làm sạch. Người làm sạch cũng phải mang áo choàng, găng, kính và khẩu trang khi làm sạch. Dung dịch tẩy uế được dùng là hypochlorite 0,5% (tức nước Javel pha loãng 1/10) hay phenol 5%. Lấy bệnh phẩm Bệnh than thể da - Giai đoạn mụn nước: Vi khuẩn được phát hiện nhiều nhất trong giai đoạn này. Dùng 2 que tăm bông khô ấn vào mụn nước chưa vỡ và thấm dịch chảy ra gởi đến phòng thí nghiệm. - Giai đoạn loét hoại tử: Dùng hai que tăm bông xoay qua lại ở rìa hay bờ dưới của vết loét nhưng không lấy mảng loét. Bệnh than thể tiêu hoa Bệnh phẩm thường là mẫu phân của bệnh nhân. Tuy nhiên trong giai đoạn trễ, cấy máu có thể phát hiện vi khuẩn nếu như trước đó chưa dùng kháng sinh. Bệnh than thể hô hấp Bệnh phẩm thường là đàm. Tương tự như trên, trong giai đoạn muộn, cấy máu có thể phát hiện vi khuẩn nếu như kháng sinh chưa được dùng. Qui trình nuôi cấy Phải đảm bảo an toàn Như đã nêu ở trên, tất cả thao tác với bệnh phẩm phải thực hiện trong tủ an toàn sinh học cấp 2. Xử lý bệnh phẩm và nuôi cấy Tất cả bệnh phẩm đều được thực hiện theo qui trình bình thường như đối với các loại vi khuẩn khác cộng thêm sự cẩn trọng đã nêu ở trên. Dùng 2 que tăm bông, 1 để cấy và 1 dùng để nhuộm Gram. Dịch não tuỷ được ly tâm 1500 vòng/ phút trong 15 phút. Lấy cặn cấy và nhuộm Gram. Ba môi trường cấy thường được dùng là thạch máu cừu, thạch MacConkey (MC) và môi trường tăng sinh lỏng (tryptic soy broth hoặc thioglycollate). Riêng đối với bệnh phẩm phân thì không dùng môi trường tăng sinh; có thể loại trừ ngoại nhiễm trên môi trường phân lập dựa vào tính đề kháng nhiệt hoặc ethanol của nha bào. Các môi trường cấy được ủ ở 35-37 0 C trong điều kiện khí trường bình thường. Xem xét các hộp thạch sau 18-24 giờ. Đặc điểm định danh Quan sát vi the Trên phết nhuộm Gram, B. anthracis là trực khuẩn Gram dương lớn đầu vuông đường kính 1-1,5 x 3-5 mm xếp thành chuỗi. Trên các phết nhuộm trực tiếp từ bệnh phẩm thường không thấy nha bào nhưng lại thấy nang. Ngược lại nha bào thường thấy ở các lứa cấy ủ trong khí trường CO 2 còn nang thì lại không thấy ở phết nhuộm vi khuẩn từ thạch máu ủ bình thường. Nha bào hình bầu dục, nằm giữa hay gần một đầu tế bào vi khuẩn và không làm phồng tế bào. Khi nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng với 5% CO 2 hoặc nuôi cấy trong các môi trường cơ bản khác có cho thêm 0,7% sodium bicarbonat, dòng vi khuẩn độc lực sẽ xuất hiện dưới dạng là các trực khuẩn có nang. Nang này có thể thấy được bằng phương pháp nhuộm mực Tàu. Hình dạng khúm khuẩn Vi khuẩn mọc tốt trên môi trường bình thường như thạch dinh dưỡng, thạch máu nhưng không mọc được trên MC. Khác với các loại Bacillus khác, B. anthracis không tiêu huyết trên thạch máu. Khúm B. anthracis phẳng hoặc hơi lồi. Khúm của dòng độc lực thì xám trắng, hơi thô ráp, bờ không đều, có hình dạng giống “đầu sứa” hoặc dạng kính mờ. Nếu dùng que cấy nâng một góc khúm khuẩn lên thì phần còn lại của khúm khuẩn cũng được nâng lên theo giống như lòng trắng trứng, đó là đặc tính kết dính của khúm khuẩn. Định danh B. anthracis Định danh B. anthracis trong phòng xét nghiệm dựa theo các tiêu chuẩn sau: Khúm khuẩn phẳng bờ không đều (dạng kính mờ, dạng đầu sứa), không tiêu huyết trên thạch máu. Trực khuẩn Gram dương, có nha bào ở giữa xếp thành chuỗi giống “cây tre”, có nang. Không di động. Tiết lecithinase, catalase. Thử nghiệm với 0,5-10U/ml Penicillin cho hình ảnh “chuỗi ngọc trai”. Không mọc được trên môi trường Phenylethyl alcohol (PEA). Có thể hỗ trợ định danh bằng các test kit API, Plainview, NY hoặc nhuộm kháng thể huỳnh quang chuyên biệt. Các thử nghiệm khác: Tạo nang trên môi trường thạch bicarbonate. Phân tích acid béo tế bào vi khuẩn bằng sắc ký khí. Gửi dòng phân lập đến labô chuẩn thức (reference laboratory) làm thử nghiệm nhạy cảm với g-phage. DNA probes, PCR, Dot ELISA. HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN VÀ TEST DA CỦA BỆNH THAN Dùng kỹ thuật ELISA để phát hiện kháng thể kháng độc tố. Chẩn đoán huyết thanh học dương tính khi khi hiệu giá kháng thể giữa giai đoạn cấp và giai đoạn hồi phục cách nhau 4 tuần tăng gấp 2 lần hoặc hiệu giá kháng thể 1 lần duy nhất >1/32. Test da chẩn đoán bệnh than được đánh giá bởi Liên bang Xô Viết trước đây như là biện pháp thay thế cho chẩn đoán vi khuẩn học bệnh than ở người (có thể chỉ 10-40% ca trong vòng 3 tuần đầu của bệnh). Kết quả của test da phát hiện được miễn dịch qua trung gian tế bào của vi khuẩn than dương tính trong 81% cas trong 3 ngày đầu của bệnh và 97% cas trong 2-3 tuần kế tiếp. Tỉ lệ dương tính còn 82% sau 4-15 năm và 72% sau 16-31 năm sau khi khỏi bệnh. Vì vậy test da dường như là một phương pháp có giá trị trong chẩn đoán sớm bệnh than cấp tính đồng thời là biện pháp duy nhất có sẵn để chẩn đoán hồi cứu bệnh than ở người. . VI KHUẨN BACILLUS ANTHRACIS VÀ BỆNH THAN - Phần 1 TÍNH CHẤT VI SINH HỌC Hình dạng vi the Bacillus anthracis là một trực khuẩn Gram dương lớn, sinh nha bào,. thể 1 lần duy nhất > ;1/ 32. Test da chẩn đoán bệnh than được đánh giá bởi Liên bang Xô Vi t trước đây như là biện pháp thay thế cho chẩn đoán vi khuẩn học bệnh than ở người (có thể chỉ 1 0-4 0%. loãng 1/ 10) hay phenol 5%. Lấy bệnh phẩm Bệnh than thể da - Giai đoạn mụn nước: Vi khuẩn được phát hiện nhiều nhất trong giai đoạn này. Dùng 2 que tăm bông khô ấn vào mụn nước chưa vỡ và thấm