2/28/2011 Nguồn gốc sống? CHƢƠNG II CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MƠ & TẾ BÀO THỰC VẬT • Các nhà khoa học theo thuyết tự sinh: đất ẩm  cỏ dại, bùn  lươn,…  Sự sống tự sinh (ngẫu nhiên) Nguồn gốc sống? • Pasteur: sữa để lâu  chua  sinh vật có nguồn gốc từ sinh vật Sinh vật trì nịi giống Tính tồn thế nào? Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật = Thuật ngữ mô tả phương pháp nuôi cấy phận thực vật ống nghiệm có chứa mơi trường dinh dưỡng thích hợp điều kiện vơ trùng Lịch sử phát triển • Năm 1902, Haberlandt lần đưa ý tưởng cấy mơ sinh vật ngồi thể • Năm 1934, White thành công việc phát sống vô hạn việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua • Năm 1962, Murashige Skoog cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu bước tiến kỹ thuật ni cấy mơ • Năm 1960 – 1964, Morel nhân giống vơ tính lan ni cấy đỉnh sinh trưởng  thương mại hóa 2/28/2011 Tầm quan trọng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật • Về mặt lý luận sinh học Các bƣớc nhân giống in vitro B1 B2 • Về mặt thực tiễn sản xuất Chọn lựa khử trùng mẫu cấy Tạo thể nhân giống Nhân giống in vitro Tái sinh hoàn chỉnh Chuyển vườn ươm B5 Chọn lựa khử trùng mẫu cấy • Khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý đến tuổi sinh lý quan dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng lấy mẫu, kích thước vị trí lấy mẫu • Mẫu cấy sau chọn lựa rửa xà phòng khử trùng bề mặt chất khử trùng hóa học calcium hypochloride, chlorur thủy ngân, Nhân giống in vitro • Vật liệu ni cấy thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi, nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với trình nhân giống kéo dài • Điều kiện ni cấy thích hợp giúp cho trình tăng sinh diễn nhanh Cây nhân giống in vitro trạng thái trẻ hóa trì thời gian dài B3 B4 Tạo thể nhân giống in vitro • Mẫu ni cấy mơi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống in vitro • Có thể nhân giống in vitro thể chồi thể cắt đốt Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngồi tự nhiên trồng • Đối với lồi khơng có khả nhân giống, người ta thường nhân giống cách tạo cụm chồi từ mơ sẹo Tái sinh in vitro hồn chỉnh • Đây giai đoạn tạo hồn chỉnh có đầy đủ thân, rễ để chuẩn bị chuyển vườn ươm Cây phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống mơi trường bình thường • Các chất có tác dụng tạo chồi loại bỏ, thay vào chất kích thích q trình tạo rễ Điều kiện ni cấy gần với điều kiện tự nhiên bên 2/28/2011 Chuyển vƣờn ƣơm • Cây rễ lấy khỏi ống nghiệm, rửa agar đặt chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp, • Đây giai đoạn quan trọng quy trình nhân giống vơ tính thường bị chết khác biệt điều kiện sống in vitro ex vitro Ảnh hƣởng mẫu cấy  Kiểu di truyền: • Những hai mầm thơng thường có khả tái sinh mạnh mầm hạt trần khó tái sinh • Nếu lồi dễ tái sinh quan mơi trường tự nhiên chúng dễ tái sinh in vitro • Trong số hai mầm Solanaceae, Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae Cruciferae họ thực vật dễ tái sinh Ảnh hƣởng mẫu cấy  Tuổi mơ quan: • Những mơ cịn non mềm thường dễ ni cấy mơ cứng có nhiều trường hợp ngoại lệ • Các mẫu cấy từ cuống cịn non tái sinh tốt mẫu cấy từ cuống già quan chúng già nên khả tái sinh phân chia tế bào giảm Các yếu tố ảnh hƣởng đến q trình ni cấy mơ thực vật Ánh sáng Mẫu cấy Độ thống khí Môi trường nuôi cấy Ảnh hƣởng mẫu cấy  Tuổi sinh lý cây: • Các mơ phơi thường có khả tái sinh cao • Các phận non dễ tái sinh hơn, già đi, khả tái sinh chúng giảm theo • Đơi qua nhiều lần cấy chuyền, mẫu cấy già bước trẻ hóa tăng khả tái sinh phân chia tế bào Ảnh hƣởng mẫu cấy  Tình trạng sinh lý: • Thông thường phận giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh giai đoạn sinh sản • Các chồi giai đoạn ngủ đơng khó ni cấy in vitro chồi vượt qua giai đoạn 2/28/2011 Ảnh hƣởng mẫu cấy Ảnh hƣởng mẫu cấy  Vị trí mẫu cấy cây:  Kích thước mẫu cấy: • Những chồi ban đầu tách từ vị trí thấp phát triển môi trường in vitro tốt hơn, chồi gốc tăng trưởng nhanh chồi nách • Các cấu trúc nhỏ tế bào, cụm tế bào mô phân sinh khó cảm ứng để tăng trưởng cấu trúc lớn thân, lá, củ • Điều đáng lưu ý mô sẹo phát sinh từ mẫu cấy có nguồn gốc từ phần khác rễ, chồi, cuống có phản ứng in vitro giống Ảnh hƣởng mẫu cấy • Các phận có chứa nhiều chất dinh dưỡng dự trữ củ, thân hành thường dễ tái sinh môi trường in vitro quan chất dự trữ Ảnh hƣởng mẫu cấy  Vết thương:  Phương pháp cấy: • Sự tổn thương bề mặt mẫu cấy đóng vai trị quan trọng tái sinh mẫu cấy • Các mẫu cấy đặt mơi trường theo nhiều cách khác nhau: có cực khơng có cực • Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng hấp thu chất dinh dưỡng chất điều hòa đồng thời ethylene tạo nhiều Ảnh hƣởng mẫu cấy  Kiểu di truyền  Tuổi sinh lý  Tuổi mô quan  Tình trạng sinh lý  Vị trí mẫu cấy  Kích thước mẫu cấy  Vết thương • Chồi rễ thường tái sinh dễ nhanh mẫu cấy không cực Ảnh hƣởng mơi trƣờng  Khống đa lượng: • Nhu cầu khống mơ, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với trồng điều kiện tự nhiên • Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp N, P, K, Ca, Mg  Phương pháp cấy 2/28/2011 Ảnh hƣởng môi trƣờng Ảnh hƣởng mơi trƣờng  Khống vi lượng:  Carbon nguồn lượng: • Trước đây, kỹ thuật nuôi cấy mô đời, người ta khơng nghĩ đến việc bổ sung khống vi lượng vào mơi trường ni cấy • Hai dạng đường thường gặp glucose sucrose • Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Fe, Mn, Zn, Cu, B, Co, I, Mo… Ảnh hƣởng mơi trƣờng • Các nguồn carbonhydrate khác tiến hành thử nghiệm lactose, galactose, maltose tinh bột carbonhydrate có hiệu so với glucose sucrose Ảnh hƣởng môi trƣờng  Vitamin:  Chất điều hòa tăng trưởng thực vật: • Thơng thường thực vật tổng hợp vitamin cần thiết cho tăng trưởng phát triển chúng • Có nhóm chất điều hồ quan trọng nuôi cấy mô thực vật: auxin, cytokinin, gibberellin, acid abscisic ethylen • Các vitamin thường sử dụng nhiều nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic, pyridoxine (B6) myo-inositol • Tỉ lệ auxin/cytokinin (A/C) xác định dạng phân hoá quan tế bào thực vật nuôi cấy: A/C cao giúp tạo rễ, A/C thấp giúp tạo chồi Auxin • Auxin phối hợp với cytokinin giúp tăng trưởng chồi non khởi phát tạo mô phân sinh chồi từ nhu mơ • Auxin nồng độ cao kích thích tạo sơ khởi rễ, cản trở tăng trưởng sơ khởi • IAA, IBA, NAA, 2,4-D, 2,4,5-T, phenoxyacetic acid Cytokinin • Kích thích tế bào phân chia (với điều kiện có auxin) • Cytokinin tác động hai bước phân chia tế bào: phân nhân phân bào • Kinetin, zeatin, BA, TDZ 2/28/2011 Ảnh hƣởng môi trƣờng Ảnh hƣởng môi trƣờng  Các chất hữu khơng xác định:  Nguồn cung cấp nitrogen: • Bổ sung nhiều chất trích hữu khác vào môi trường nuôi cấy thường mang lại kết thuận lợi cho tăng trưởng mơ • Mặc dù tế bào có khả tổng hợp tất amino acid cần thiết bổ sung amino acid vào mơi trường ni cấy để kích thích tăng trưởng tế bào • Các chất bổ sung là: protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nước cam, nước cà chua Ảnh hƣởng mơi trƣờng • Các nguồn nitơ hữu thường sử dụng hỗn hợp amino acid casein hydrolysate, Lglutamine, L-asparine adenine Ảnh hƣởng mơi trƣờng  Than hoạt tính:  Yếu tố làm đặc mơi trường: • Việc bổ sung than hoạt tính vào mơi trường ni cấy có tác dụng khử độc • Agar chất thường sử dụng để tạo môi trường đặc hay môi trường bán rắn ni cấy mơ thực vật • Ảnh hưởng than hoạt tính: kích thích tăng trưởng mơ thực vật than hoạt tính kết hợp với hợp chất phenol độc mô tiết suốt thời gian ni cấy • Agar khơng phản ứng với chất môi trường Độ cứng agar định nồng độ agar sử dụng pH môi trường Ảnh hƣởng môi trƣờng  Khoáng đa lượng  Khoáng vi lượng  Carbon nguồn lượng  Vitamin  Chất điều hòa tăng trưởng thực vật  Các chất hữu không xác định, nguồn cung cấp nitrogen, than hoạt tính, yếu tố làm đặc môi trường Một số công thức môi trường thường sử dụng chủ yếu để nuôi cấy mô tế bào thực vật môi trường MS (Murashige Skoog), B5 (Gamborg cộng sự), SH (Schenk Hilderbrandt) có hàm lượng khống đa lượng cao số môi trường khác mô tả White, Gautheret, Nitsch, Loyd Mc Cown có hàm lượng khống đa lượng thấp 2/28/2011 Khoáng đa lƣợng 1650 KNO3 1900 KH2PO4 170 MgSO4.7H2O 370 CaCl2.2H2O Thành phần môi trường MS mg l-1 NH4NO3 440 Khoáng vi lƣợng KI Stock x 50 (20ml/l) Khoáng đa lƣợng NH4NO3 1650 mg/l KNO3 1900 mg/l KH2PO4 170 mg/l CaCl2.2H2O 440 mg/l MgSO4.7H2O 370 mg/l mg l-1 0.83 H3BO3 6.2 MnSO4.4H2O 22.3 ZnSO4.7H2O 8.6 Na2MoO4.2H2O 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 Na2.EDTA 37.3 FeSO4.7H2O Vitamin chất hữu khác NH4NO3 82,5 g/l KNO3 95 g/l KH2PO4 8,5 g/l Stock x 100 (10ml/l) CaCl2.2H2O 44 g/l Stock x 100 (10ml/l) 27.8 MgSO4.7H2O mg l-1 Myo-Inositol 0.5 Pyridoxine HCl 0.5 Thiamine HCl 0.1 Glycine 37 g/l 100 Nicotinic acid 2.0 Khoáng vi lƣợng KI 0,83 mg/l H3BO3 6,2 mg/l MnSO4.4H2O 22,3 mg/l ZnSO4.7H2O 8,6 mg/l Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/l CuSO4.5H2O 0,025 mg/l CoCl2.6H2O 0,025 mg/l Na2.EDTA 37,3 mg/l FeSO4.7H2O 27,8 mg/l Stock x 50 (20ml/l) KI H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O 41,5 mg/l 310 mg/l 1115 mg/l 430 mg/l 12,5 mg/l 1,25 mg/l 1,25 mg/l Stock x 100 (10ml/l) Na2.EDTA FeSO4.7H2O Mẫu cấy Stock x 200 (5ml/l) Myo-Inositol 100 mg/l Nicotinic acid 0,5 mg/l Pyridoxine HCl 0,5 mg/l Thiamine HCl 0,1 mg/l Glycine 2,0 mg/l Myo-Inositol Nicotinic acid Pyridoxine HCl Thiamine HCl Glycine 20 g/l 100 mg/l 100 mg/l 20 mg/l 400 mg/l 3,73 g/l 2,78 g/l Các yếu tố ảnh hƣởng đến q trình ni cấy mơ thực vật Ánh sáng Vitamin Độ thống khí Ni cấy nốt đơn thân  Phương pháp nuôi cấy sử dụng mẫu cấy chồi chồi bên có mang đoạn thân ngắn Chồi kích thích cho tăng trưởng, rễ để tạo thành nguyên vẹn Mơi trường ni cấy  Một số mơ hình hệ thống nuôi cấy 2/28/2011 Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng  Virus thực vật tác nhân gây thiệt hại nặng nề cho nông nghiệp  Virus lây lan nhờ côn trùng, tuyến trung, ve rận thông qua đường học  Virus lan truyền thể thực vật qua bó mạch Đa số lồi virus khơng truyền nhiễm qua hạt Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng  Năm 1949, Limasset Cornuet nhận thấy bị nhiễm, mật độ virus giảm dần đến gần điểm phát triển sinh dưỡng  Năm 1952, Morel Martin khẳng định tách mơ phân sinh chồi đỉnh trồng bị nhiễm virus in vitro để thu bệnh  Xử lý nhiệt, hóa chất,… Ni cấy đỉnh sinh trƣởng  Mô phân sinh đỉnh trịn gồm tế bào phân chia tích cực, có đường kính khoảng 0,1 mm dài khoảng 0,25 mm  Sử dụng khối mô bao gồm đỉnh sinh trưởng sơ khởi có kích thước 0,5-1 mm Ni cấy đỉnh sinh trƣởng  Để có nhiều đỉnh sinh trưởng bệnh virus làm nguồn mẫu cho nuôi cấy in vitro, trước tiên phải tiến hành tạo chồi bất định, sau thu đỉnh sinh trưởng từ chồi bất định Nuôi cấy bao phấn Quy trình ni cấy đỉnh sinh trƣởng • Nuôi cấy bao phấn hạt phấn  đơn bội đơn bội kép  biểu tất tính trạng  ứng dụng việc chọn giống • Được áp dụng thành cơng 250 loài thực vật, gồm thuộc họ Liliaceae 2/28/2011 Nuôi cấy bao phấn Nuôi cấy bao phấn • Vật liệu Nụ hoa 3,5 – cm chứa hạt phấn giai đoạn đơn nhân muộn • Phƣơng pháp • Khử trùng với etanol 70 phút hypoclorid calcium 8% 15 phút • Ni cấy MS có picloram 2mg/l, zeatin 2mg/l sacaroz 6% • Trong tối, 25°C  mơ sẹo • Sau tháng, mơ sẹo  MS có picloram 0,1mg/l, BA 0,01mg/l sacaroz 3%  cụm chồi • Cây  mơi trường MS  tăng trưởng tạo rễ (ở 25oC, 1600  100 lux) Các yếu tố ảnh hƣởng đến q trình ni cấy mơ thực vật Sau 14 ngày GĐ tế bào Ánh sáng Hạt phấn Quy trình nuôi cấy bao phấn Cây GĐ tế bào Mẫu cấy GĐ tế bào Cụm chồi Độ thoáng khí Mơi trường ni cấy  Một số mơ hình hệ thống nuôi cấy Mô sẹo (sau tháng) Hệ thống nuôi cấy Bioreactor Môi trƣờng rắn: - Lãng phí - Tích tụ phenol gây độc cho mẫu cấy Mơi trƣờng lỏng: - Trao đổi khí hạn chế - Dễ xảy tượng thủy tinh thể 2/28/2011 Môi trƣờng lỏng lắc: - Gây tổn thương cho mẫu cấy Mơi trƣờng lỏng có sục khí: (Bioreactor) Hệ thống ni cấy Bioreactor tự tạo • • • • Bioreactor = bình phản ứng có tính chất: Điều kiện vơ trùng Mơi trường lỏng có sục khí Số lượng mẫu cấy nhiều Có khả tự động hóa Hệ thống nuôi cấy Bioreactor tự động 10 2/28/2011 Quy trình nhân sinh khối thực vật hệ thống Bioreactor: • B1 Thiết lập môi trường nuôi cấy vô trùng • B2 Nhân sinh khối • B3 Tạo rễ cho trước vườn ươm Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời Các thơng số ảnh hƣởng đến hiệu hệ thống Bioreactor • Sự vận chuyển khí oxy khả hịa tan oxy vào mơi trường • Mơi trường dinh dưỡng Hệ thống ngập chìm tạm thời 11 2/28/2011 Hệ thống ngập chìm tạm thời Các thông số ảnh hƣởng đến hiệu hệ thống ngập chìm tạm thời • Thời gian ngập chìm, tần số ngập chìm • Thể tích mơi trường dinh dưỡng, thể tích bình ni cấy • Sự thống khí tự nhiên thống khí cưỡng Hệ thống ni cấy quang tự dƣỡng Vai trị ánh sáng thực vật Ánh sáng khả kiến Bƣớc sóng ánh sáng quang hợp 12 2/28/2011 Những nguồn sáng sử dụng nuôi cấy mô thực vật Nuôi cấy quang tự dƣỡng • Chú trọng đến tác nhân vật lý môi trường nuôi cấy ion, cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng, thành phần không khí, ẩm độ,… thay nghiên cứu thành phần hóa học mơi trường ni cấy nồng độ đường, vitamin hay chất điều hòa sinh trưởng thực vật Ni cấy quang tự dƣỡng • Khơng sử dụng đường chất hữu cơ, tạo điều kiện tối đa cho bình ni cấy sử dụng khí CO2 có sẵn khơng khí làm nguồn carbon cho trình tăng trưởng phát triển  Giảm chi phí, giảm tỉ lệ nhiễm Ni cấy quang tự dƣỡng • Hộp ni cấy quang tự dưỡng = nhà kính thu nhỏ  tạo điều kiện cho in vitro thích nghi dần với điều kiện ex vitro trước chuyển vườn ươm 13 2/28/2011 14 ... trưởng thực vật  Các chất hữu không xác định, nguồn cung cấp nitrogen, than hoạt tính, yếu tố làm đặc môi trường Một số công thức môi trường thường sử dụng chủ yếu để nuôi cấy mô tế bào thực vật môi... thường sử dụng nhiều nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic, pyridoxine (B6) myo-inositol • Tỉ lệ auxin/cytokinin (A/C) xác định dạng phân hoá quan tế bào thực vật nuôi cấy: A/C cao giúp...2/28/2011 Tầm quan trọng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật • Về mặt lý luận sinh học Các bƣớc nhân giống in vitro B1 B2 • Về mặt thực tiễn sản xuất Chọn lựa khử trùng mẫu cấy Tạo thể nhân giống Nhân