PHÁT HIỆN MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY Ô NHIỄM THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR TÓM TẮT Đặt vấn đề: Ứng dụng kỹ thuật PCR để phân tích vi sinh vật thực phẩm hiện nay chưa được áp dụng nhiều trong các labo vi sinh. Mục tiêu: so sánh phương pháp PCR và nuôi cấy trong kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 270 loại mẫu thực phẩm thuộc các nhóm thịt, thủy hải sản, sữa, và các loại bánh đã được thu thập và phân tích so sánh bằng phương pháp nuôi cấy và phương pháp PCR với các bộ kit do Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TP. HCM cung cấp. Kết quả: 100 mẫu thực phẩm kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật theo phương pháp nuôi cấy và PCR cho thấy tỷ lệ mẫu dương tính đối với Salmonella là 8% và 20%; đối với E. coli là 44 và 88%; đối với S. aureus là 32 và 46%; đối với Listeria monocytogenes là 8 và 13%. 70 mẫu thủy hải sản kiểm tra V. parahaemolyticus cho kết quả nuôi cấy là 11,4% và PCR 17,1%. So sánh về độ nhạy cho thấy phương pháp PCR cho kết quả tốt hơn (100%). Kết luận: Sử dụng PCR giám sát mẫu thực phẩm nhằm phát hiện và chọn nhanh các mẫu đạt yêu cầu (cho kết quả âm tính) khi kiểm tra chất lượng vệ sinh thực phẩm sẽ tiết kiệm được thời gian trả lời kết quả so vớI phương pháp nuôi cấy. SUMMARY Background: Nowadays, Applying PCR method to analyse bacterial contamination in food is not popular in Viet Nam. Objectives: Comparing of PCR method and traditional culture-based method for control of food microbiology. Method: 270 food samples including meats, sea products, milks, and cakes were collected and comparatively analyzed by traditional culture- based technique and PCR technique with kits supplied by the University of Natural Sciences in HCMC. Results: The survey results showed that: 100 samples were analyzed by traditional culture-based technique and PCR technique for Salmonella is 8% and 20%; for E. coli is 44 and 88%; for S. aureus is 32 and 46%; for Listeria monocytogenes is 8 and 13%, respectively. 70 samples were analyzed by traditional culture-based technique and PCR technique for Vibrio parahaemolyticus is 11.4% and 17.1%, respectively. A comparation the sensity of two methods between PCR and culture method showed that: PCR have the sensity higher (100%). Conclusion: PCR method can use in monitoring food hygiene-safety to detect and eliminate rapidly the foods of bacterial contamination and time-saving. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay trong công tác kiểm tra chất lượng vệ sinh thực phẩm về mặt vi sinh vật tại các phòng thí nghiệm trong cả nước chủ yếu vẫn sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống(5,7,8,9). Để đáp ứng cho nhu cầu giám sát mẫu thực phẩm với số lượng nhiều cùng một lúc thì công tác nuôi cấy sẽ tốn nhiều thời gian, môi trường nuôi cấy, hơn nữa để góp phần trong chẩn đoán nhanh các vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra với quy mô ngày càng lớn, trong đó, phần lớn có nguyên nhân là do vi sinh vật thì kỹ thuật PCR sẽ đáp ứng kịp thời cho những nhu cầu đó. Các tác nhân vi khuẩn thường gây ngộ độc thực phẩm là Salmonella spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus và Listeria monocytogenes(2,3,5,7,9). Để đánh giá khả năng ứng dụng của bộ kit PCR do trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh sản xuất chúng tôi đã tiến hành phân tích mức độ ô nhiễm vi sinh vật một số nhóm mẫu thực phẩm như thịt, thủy hải sản, sữa và các loại bánh được bày bán tại các chợ và các hàng quán trên địa bàn thành phố bằng kỹ thuật PCR và so sánh độ nhạy phát hiện của hai phương pháp. Từ những kết quả nghiên cứu, chúng tôi đưa ra một số khuyến cáo khi sử dụng bộ kit PCR chẩn đoán nhanh các vi sinh vật gây ô nhiễm thực phẩm. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu - 270 mẫu thực phẩm: thịt, thủy hải sản, sữa và các loại bánh được thu thập từ các chợ và các hàng quán trên đường phố tại TP. Hồ Chí Minh. - Hóa chất và môi trường để phát hiện các vi sinh vật bằng phương pháp nuôi cấy. - Hóa chất dùng để phát hiện vi sinh vật bằng kỹ thuật PCR: hóa chất tách chiết DNA, điện di và các bộ kit PCR để phát hiện cho các chỉ tiêu: Salmonella spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus và Listeria monocytogenes được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử Trường ĐH Khoa học Tự nhiên (thuộc ĐH Quốc gia TP. HCM). Phương pháp - Mẫu thực phẩm được phân tích các chỉ tiêu vi sinh dựa trên qui định của Bộ Y tế (QĐ 867/1998)(9) bằng cả hai phương pháp PCR và nuôi cấy. - Phân tích mẫu bằng phương pháp nuôi cấy được thực hiện theo các tiêu chuẩn như sau: Salmonella (TCVN 4829:2001), E. coli (TCVN 5155:90), S. aureus (TCVN 5156:1990), V. parahaemolyticus (QĐ 3349/QĐ-BYT) và Listeria monocytogenes (AOAC 2000 - 993.12) - Phân tích mẫu bằng kỹ thuật PCR(7,8): + Xử lý mẫu: đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh thích hợp, ủ từ 16 - 22h. Hút 1ml mẫu sau khi tăng sinh, xử lý . + Thu nhận DNA bản mẫu từ 1ml dịch sau tăng sinh, ly tâm 800vòng/phút, loại bỏ mảnh vụn thực phẩm, thu dịch nổi. Ly tâm 5000vòng/5phút, lấy cặn. Rửa cặn 2 lần bằng nước cất vô trùng. Ly tâm và huyền phù cặn trong 200ml TE, đun ở 100oC/10phút. Ly tâm 12.000 vòng/5 phút. Hút 3ml dịch nổi là DNA khuôn cho vào tube chứa 21,5ml PCR mix và 0,5ml Taq DNA polymerase (tổng thể tích là 25ml). + Thực hiện phản ứng PCR trên máy luân nhiệt (thermal cycler) của hãng Bio-Rad theo chương trình đã cài đặt, gồm các bước sau: Chu kỳ 1: (x1) Bước 1: 940C x 5 phút Chu kỳ 2: (x35) Bước 1: 940C x 30 giây Bước 2: 550C x 40 giây Bước 3: 720C x 45 giây Chu kỳ 1: (x1) Bước 1: 940C x 5 phút + Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% nhuộm ethidium bromide và chụp hình ảnh điện di bằng máy Gel.doc với kích thước vạch: Salmonella: 520 bp, E. coli: 299bp, S. aureus: 276bp, V. parahaemolyticus: 450bp, Listeria monocytogenes: 220bp. - Phương pháp PCR-ELISA theo bộ kit của hãng Bio-Rad: để phát hiện Salmonella. - Thống kê, đối chiếu kết quả ghi nhận bằng phương pháp PCR và nuôi cấy dựa trên độ nhạy của hai phương pháp theo tiêu chuẩn của HC (Health Canada) and CFIA (the Canadian Food Inspection Agency). KẾT QUẢ Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện Salmonella Bảng 1: Kết quả nuôi cấy, PCR-ELISA và PCR phát hiện Salmonella (n=100) Mẫu thực phẩm Nuôi cấy PCR - ELISA PCR + - + - + - Tần suất 8 92 19 81 20 80 Tỉ lệ % 8,00 92,00 19,00 81,00 20,00 80,00 Hình 1: Hình ảnh PCR phát hiện Salmonella Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện E. coli Bảng 2: Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện E. coli (n=100) Mẫu thực phẩm Nuôi cấy PCR + - + - Tần suất 44 56 88 12 Tỉ lệ % [...]... monocytogenes trong thực phẩm phương pháp nuôi cấy và PCR: nuôi cấy cho 8 mẫu dương tính (8%), PCR (bộ kit của trường Ðại học KHTN) cho số mẫu dương tính là 13 (13%) Như vậy, phương pháp PCR có độ nhạy cao hơn phương pháp nuôi cấy (p . PHÁT HIỆN MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY Ô NHIỄM THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR TÓM TẮT Đặt vấn đề: Ứng dụng kỹ thuật PCR để phân tích vi sinh vật thực phẩm hiện nay chưa được áp. ra, phương pháp PCR có độ nhạy cao hơn phương pháp nuôi cấy nên cho kết quả phát hiện cao hơn. Bảng 2 thể hiện kết quả kiểm tra vi khuẩn E. coli trong thực phẩm bằng 2 phương pháp nuôi cấy. hơn phương pháp nuôi cấy (p<0,05). Ngoài ta, có thể do mẫu ban đầu nhiễm, qua xử lý vi khuẩn bị chết và không thể phát hiện được bằng phương pháp nuôi cấy nhưng vẫn phát hiện được bằng PCR.