PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG KỸ THUẬT REAL – TIME PCR (Phần chính)

91 881 2
  • Loading ...
1/91 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 19/03/2013, 09:40

Bệnh đốm trắng gây tác hại rất nghiêm trọng trên tôm sú. Đặc trưng của bệnh là gây nên tỷ lệ chết khá cao và có thể gây chết hàng loạt cho tôm sú nuôi trong thời gian ngắn trên các ao nuôi bị nhiễm bệnh 1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nuôi trồng thủy sản là ngành kinh tế quan trọng đóng góp một phần đáng kể trong thị phần xuất khẩu của một số quốc gia trên thế giới đặc biệt các nước Châu Á như Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan,Việt Nam, In-đô-nê-xi-a, Ấn Độ. Hiện nay để tăng sản lượng nuôi tôm, việc áp dụng kỹ thuật tiên tiến như nuôi thâm canh năng suất cao tăng diện tích nuôi đã có nhiều tác động đến môi trường sinh thái các vùng nuôi. Vấn đề ô nhiễm môi trường, sự bùng phát dịch bệnh cũng thường xuyên diễn ra. Trong đó bệnh đốm trắng chiếm tỷ lệ rất cao. Bệnh này đã gây thiệt hại không nhỏ cho nghề nuôi tôm từ những năm 1993 - 1994 đã tác động mạnh đến nghề nuôi tôm công nghiệp của thế giới. Bệnh đốm trắng gây tác hại rất nghiêm trọng trên tôm sú. Đặc trưng của bệnh gây nên tỷ lệ chết khá cao có thể gây chết hàng loạt cho tôm nuôi trong thời gian ngắn trên các ao nuôi bị nhiễm bệnh. Sự lan rộng của dịch bệnh đốm trắng đã làm sản lượng tôm nuôi ở Đài Loan từ 95.000 tấn vào năm 1987 giảm xuống chỉ còn 30.000 tấn vào năm 1988 (Liao ctv., 1992; trích bởi Thuy Thi Ngoc Phan, 2001); ở Việt Nam sản lượng tôm nuôi từ 50.000 tấn vào năm 1995 giảm xuống còn 30.000 tấn năm 1997 (World Shrimp Farming, 1997; trích bởi Trần Thị Hoàng Dung, 2000). Hiện nay, việc nghiên cứu để tìm phương pháp điều trị bệnh này vẫn còn nhiều khó khăn chưa có hiệu quả rõ ràng. Phương pháp để hạn chế thiệt hại do bệnh đốm trắng gây ra vẫn là các biện pháp phòng bệnh trong quá trình nuôi. Trong đó, việc chẩn đoán bệnh đốm trắng ở giai đoạn tôm giống trước khi thả nuôi việc chẩn đoán bệnh kịp thời trong giai đoạn nuôi để có biện pháp xử lý thích hợp là một điều vô cùng cần thiết. Kỹ thuật PCR từ lâu đã được xem là cách tiếp cận hứa hẹn nhất đối với việc phát hiện mầm bệnh. Trong những năm qua, kỹ thuật PCR đã phát triển không ngừng thông qua những cải tiến mới về nguyên lý, thiết bị hóa chất. Phương pháp Real - time PCR là một trong những cải tiến mới nhất của kỹ thuật PCR. Phương pháp Real - time PCR rút ngắn thời gian phân tích kết quả. Khả năng định lượng trong kỹ thuật Real - time PCR đảm bảo giảm thiểu xác suất dương tính giả đối với kết quả phân tích. Với ưu điểm như vậy, phương pháp Real - time PCR cho phép phát hiện định lượng virus gây bệnh tôm trước khi xuất hiện các biểu hiện sinh lý 2 (Tạp chí Thủy sản, số 3 2004). Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng giúp cho các chủ trại tôm có đủ thời gian đưa ra những giải pháp hợp lý để phòng ngừa ngăn chặn dịch bệnh trước khi bệnh bùng phát. Ở Việt Nam, kỹ thuật PCR đang được dùng phổ biến trong chẩn đoán virus gây bệnh đốm trắng trên tôm nuôi. Hiện nay, đối với Real time PCR, nước ta chưa có công trình nghiên cứu nào công bố về việc sử dụng kỹ thuật này trong phát hiện định lượng virus gây bệnh đốm trắng trên tôm nuôi. Do đó, được sự đồng ý bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nông Lâm, dưới sự hướng dẫn của ThS. Phan Thị Ngọc Thủy ThS. Nguyễn Thái Thủy, tôi thực hiện đề tài “Phát hiện định lƣợng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm (Penaeus monodon) bằng kỹ thuật Real - time PCR” nhằm phát hiện nhanh, chính xác định lượng virus gây bệnh đốm trắng; góp phần phòng ngừa sự lây lan bùng phát dịch bệnh này. 1.2. Mục đích yêu cầu 1.2.1. Mục đích - Thử nghiệm kỹ thuật Real - time PCR để phát hiện định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm nuôi. - So sánh kỹ thuật mới: Real - time PCR kỹ thuật đang được sử dụng: Nested PCR trong phát hiện WSSV trên tôm nuôi. - Ứng dụng kỹ thuật Real - time PCR để phát hiện định lượng WSSV ở các giai đoạn tôm nuôi từ thực tiễn. 1.2.2. Yêu cầu - Nắm vững hiểu rõ về kỹ thuật PCR Real - time PCR. - Sử dụng thành thạo hệ thống PCR Real - time PCR. - Bố trí thí nghiệm, xây dựng thành công quy trình phát hiện định lượng WSSV trên tôm nuôi bằng kỹ thuật Real - time PCR. - Phát hiện định lượng virus gây bệnh đốm trắng trên tôm ở các giai đoạn nuôi qua các mẫu thu từ thực tế. - Theo dõi, ghi nhận được tình trạng thu hoạch của các ao thả nuôi tôm đã thu mẫu để xét nghiệm WSSV. 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu khái quát về tôm (Penaeus monodon) Tôm là loài có kích thước lớn nhất của họ tôm he (Penaeidae). Kích thước lớn nhất có thể đạt đến 290 305 mm (200 250 gram), trung bình đạt từ 190 195 mm, nặng 150 gram. Chúng ưa sống ở những nơi có đáy bùn cát, độ trong, độ mặn cao ổn định. Tuy nhiên, tôm có khả năng thích ứng với độ mặn rộng ngay trong thời kỳ trưởng thành, vì vậy rất thuận lợi cho nghề nuôi tôm trong các đầm mặn, lợ ven biển. Mùa vụ sinh sản từ tháng 11 - 4 năm sau (Bộ Thủy Sản, 1996). 2.1.1. Phân loại Theo Phạm Văn Tình (2001), tôm được định loại như sau: Ngành: Arthropoda - Ngành chân khớp Lớp: Crustacea - Lớp giáp xác Bộ: Decapoda - Bộ mười chân Họ chung: Penaeidae Họ: Penaeidae - Họ tôm he Giống: Penaeus Loài: Penaeus monodon Tên địa phương: tôm sú, tôm cỏ, tôm he, tôm giang (Trần Minh Anh, 1989). Tiếng Anh: Black tiger shrimp, Tiger prawn, Giant tiger prawn, Grass shrimp, Tumbo prawn (Nguyễn Văn Chung, 2000). 2.1.2. Vùng phân bố Phạm vi phân bố của tôm khá rộng, từ Ấn Độ Dương qua hướng Nhật Bản, Đài Loan, phía Đông Tahiti, phía Nam Châu Úc phía Tây Châu Phi. Nhìn chung, tôm phân bố từ kinh độ 30 0 E đến 155 0 E từ vĩ độ 35 0 N tới 35 0 S xung quanh các nước vùng xích đạo, đặc biệt là In-đô-nê-xi-a, Mã Lai, Phi-líp-pin Việt Nam (Phạm Văn Tình, 2001). Tôm giống (PL) tôm gần trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển vùng rừng ngập mặn ven bờ. Khi tôm trưởng thành di chuyển xa bờ vì chúng thích sống vùng nước sâu hơn (Phạm Văn Tình, 2001). 4 2.1.3. Chu kỳ sống Trong thiên nhiên, ấu trùng tôm trải qua ba thời kỳ biến thái (Nauplius Protozoea Mysis). Ấu trùng sẽ theo sóng biển dạt vào cửa sông, đó là vùng nước lợ có độ mặn 15 - 30‰. Tại môi trường nước lợ, ấu trùng (larvae) phát triển sang thời kỳ hậu ấu trùng Postlarvae. Sau đó Postlarvae chuyển sang thời kỳ ấu niên Juvenile đồng thời bơi ra biển, tiếp tục tăng trưởng phát triển (Vũ Thế Trụ, 1993). Tôm cái đẻ trứng vào ban đêm (thường từ 22 giờ đến 2 giờ), trứng sau khi đẻ được 14 15 giờ, ở nhiệt độ 27 28 0 sẽ nở thành ấu trùng (Nauplius). Ấu trùng phát triển qua các giai đoạn sau: - Nauplius 6 giai đoạn: 36 51 giờ - Protozoea 3 giai đoạn: 105 120 giờ - Mysis 3 giai đoạn: 72 giờ Sau đó chuyển thành Postlarvae, Juvenile, Adult (giai đoạn trưởng thành). Tôm đẻ quanh năm, nhưng tập trung vào hai thời kỳ chính: tháng 3 4 tháng 7 10. Tuổi thọ tôm con đực khoảng 1,5 năm; con cái khoảng 2 năm (Phạm Văn Tình, 2001). Hình 2.1 Vòng đời tôm Penaeus monodon (Nguồn: FAO Multimedia Asia Co., Ltd., 1999) 5 2.2. Tình hình dịch bệnh WSSV trên thế giới Việt Nam 2.2.1. Trên thế giới Bệnh đốm trắng (WSSV White Spot Syndrome Virus) là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi hiện nay. Bệnh xảy ra ở tất cả các nước nuôi tôm ảnh hưởng phần lớn đến nghề nuôi tôm công nghiệp trên thế giới (Nguyễn Văn Hảo, 2000). Trong thời gian qua, bệnh đốm trắng đã bùng phát ở nhiều khu vực nuôi tôm trên thế giới, đặc biệt là các nước Châu Á. Bệnh đốm trắng đã gây tỷ lệ chết cao gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm công nghiệp ở Trung Quốc, Nhật Bản, In-đô-nê-xi-a Ấn Độ. Trong thời gian 1994 1995, virus gây bệnh đốm trắng đã gây chết hầu hết tôm nuôi (P. monodon; P. indicus) dọc theo bờ biển phía Đông Ấn Độ phía Tây Ấn Độ (Tạp chí thông tin KHCN Kinh Tế Thủy Sản, số 4 2004). Theo Nguyễn Văn Hảo (2004), bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên tại Bắc Á vào năm 1992 1993, đồng thời nhanh chóng lan rộng khắp khu vực Châu Á thế giới nhất là các nước có hình thức nuôi tôm công nghiệp thâm canh. Dịch bệnh đốm trắng được phát hiện lần đầu tiên tại Đài Loan năm 1992, Trung Quốc 1993, Nhật Bản 1994, sau đó là các nước In-đô-nê-xi-a, Thái Lan, Mã Lai, Ấn Độ, Băng-la-desh, bang Texas (Hoa Kỳ) 1995 gây tổn thất nghiêm trọng về sản lượng tôm nuôi. Thái Lan, dịch bệnh đốm trắng bùng nổ đã làm giảm sản lượng tôm nuôi từ 225.000 tấn năm 1995 xuống 160.000 tấn năm 1996 làm thiệt hại trên dưới 500 triệu USD. Ở các nước Châu Á bệnh gây thiệt hại khoảng 3 tỷ USD mỗi năm (Nguyễn Văn Hảo, 2000). Thực tế hiện nay ở các nước trong khu vực Đông Nam Á, bệnh đốm trắng được xem là phổ biến nguy hiểm nhất vì vậy hầu hết các nghiên cứu đều tập trung ngăn ngừa sự lan nhiễm bùng nổ bệnh đốm trắng ở các ao nuôi (Nguyễn Văn Hảo, 2000). 2.2.2. Ở Việt Nam Theo Bùi Quang Tề (2003), từ năm 1993 1994 đến nay bệnh đốm trắng trên tôm thường xuất hiện ở các vùng nuôi tôm ven biển từ nuôi quảng canh đến nuôi thâm canh, bệnh đã gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi tôm. 6 Ở các tỉnh ven biển phía Nam từ năm 1993 1994, hiện tượng tôm chết hàng loạt trên tôm nuôi được xác định do ba loại bệnh: bệnh MBV, bệnh đốm trắng bệnh đầu vàng (Tạp chí thông tin KHCN Kinh Tế Thủy Sản, số 4 2004). Từ năm 1996 đến nay, tôm nuôi thương phẩm Khánh Hòa các địa phương khác trong cả nước chịu tác hại rất lớn của bệnh đốm trắng. Bệnh này xảy ra hàng năm, trên diện rộng, có những vụ nuôi 80% diện tích nuôi tôm ở một địa phương bị thất thu hay thu hoạch sớm ngoài dự kiến (Bộ Thuỷ Sản, 2003). Năm 2001, Bùi Quang Tề cộng sự đã điều tra 483 hộ nuôi tôm thuộc 23 huyện của 8 tỉnh ven biển phía Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh) có 166 hộ (34,3%) có tôm nuôi tôm cua tự nhiên đã mang mầm bệnh đốm trắng có 169 hộ (34,99%) có tôm chết vì bệnh đốm trắng. Năm 2003, Bùi Quang Tề cộng sự phân tích bệnh WSSV bằng kỹ thuật PCR của 145 mẫu tôm tôm chân trắng nuôi ở các tỉnh ven biển miền Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Thanh Hoá Hà Tĩnh) tôm Postlarve (PL) đưa từ Quảng Nam Đà Nẵng chuyển ra Bắc. Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng của tôm (PL) đưa từ Đà Nẵng, Quảng Nam là 23,08%; tôm nuôi thương phẩm ở các tỉnh phía Bắc là 26,92%; tôm chân trắng là 13,33% (Tạp chí thông tin KHCN Kinh Tế Thủy Sản, số 4 2004). Theo báo cáo kết quả nuôi trồng thủy sản (NTTS) năm 2003, cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh chết là 30.083 ha. Các tỉnh, thành ven biển từ Đà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước. Bệnh xảy ra với tôm chủ yếu bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh MBV (Monodon Baculovirus), bệnh do vi khuẩn Vibrio. Kết quả kiểm tra bệnhtôm giống nhập về Hải Phòng Quảng Ninh trong năm 2003 do Trạm nghiên cứu NTTS nước lợ thực hiện cho thấy tỷ lệ nhiễm virus gây bệnh đốm trắng từ 25 - 46,6%, trung bình 38,9%. Theo số liệu từ Trung Tâm Môi Trường Dịch Bệnh (Viện nghiên cứu NTTS I), Thanh Hóa có hơn 40% diện tích nuôi tôm bị bệnh, trong đó phần lớn thường là bệnh đốm trắng. Bệnh này tập trung ở vùng nuôi tôm công nghiệp như khu công nghiệp Hoằng Phụ, với 70/ 110 ha nuôi tôm bị nhiễm bệnh. Ở Hà Tĩnh, trong số 150 ha nuôi tôm bị bệnh, có 67 ha bị bệnh đốm trắng, trong đó 27 ha có tôm nuôi bị chết. Theo kết quả nghiên cứu của Viện Nghiên Cứu NTTS II, tại các tỉnh Nam Bộ, tỷ lệ nhiễm bệnh đốm trắng trên mẫu tôm 7 có biểu hiện bệnh thu ở đầm nuôi quảng canh cải tiến là 56%. Những ngày đầu năm 2004, tại nhiều tỉnh ở Đồng Bằng Sông Cửu Long đã xảy ra tình trạng tôm nuôi bị chết do virus gây bệnh đốm trắng gây nên bệnh này lây lan nhanh ngay từ đầu vụ. Hiện nay, bệnh đốm trắng vẫn đang diễn ra đã gây nhiều tổn thất cho nhiều hộ dân tại các tỉnh này (Tạp chí Thủy sản, số 3 2004). Nhìn chung, tình hình dịch bệnh đốm trắng diễn ra ở Việt Nam rất nghiêm trọng đã ảnh hưởng mạnh đến ngành Thủy sản trong cả nước. 2.3. Bệnh đốm trắng trên tôm 2.3.1. Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) 2.3.1.1. Định danh phân loại Định danh - Giống: Non Occuluded Baculovirus - Họ: Baculoviridae - Họ phụ: NudiBaculoviridae Theo hội nghị virus học quốc tế lần thứ 12 (2002), các nhà khoa học đã phân loại virus gây bệnh đốm trắng là một giống mới Whisspovirus thuộc họ mới Nimaviridae (Tạp chí thông tin KHCN Kinh Tế Thủy Sản, số 4 2004). Tác nhân virus gây bệnh đốm trắng được gọi bởi nhiều tên do nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau (Wang Y. C et al., 1996): - WSSV: White Spot Syndrome Virus - WSBV: White Spot Baculovirus Virus - WSVD: White Spot Viral Disease - WSS: White Spot Syndrome - WSV: White Spot Virus - SEMBV: Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus Disease - HHNBV: Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Baculovirus Hiện nay, WSSV tên thông dụng của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm (Lightner D. V, 1996). Các chủng virus gây bệnh đốm trắng bao gồm: 8 2.3.1.2. Đặc điểm hình thái Virus dạng hình que, kích thước 120 x 275 mm, có một đuôi phụ ở một đầu, kích thước 70 x 300 mm. Virus có ít nhất 5 lớp protein, trọng lượng phân tử từ 15 28 kD. Vỏ bao có hai lớp protein VP28 VP29; Nucleocapsid có ba lớp VP26, VP24, VP15. Nhân cấu trúc ADN mạch đôi (Tạp chí thông tin KHCN Kinh Tế Thủy Sản, số 4 2004). 2.3.1.3. Đặc tính sinh học Virus đốm trắng sinh ở các tổ chức ngoại bì, trung bì, mang, cơ quan lymphoid biểu bì dưới vỏ kitin. Virus xâm nhập vào nhân tế bào gây hoại tử sưng to. Virus sống tồn tại trong nước có độ mặn từ 5 40‰, độ pH từ 4 10, có khả năng chịu đựng được nhiệt độ từ 0 80 0 C (Trần Thị Việt Ngân, 2002). Hình 2.2 Virus đốm trắng (WSSV) hình que dƣới kính hiển vi điện tử Hình 2.3 Virus nhuộm âm trong huyết tƣơng của tôm nhiễm bệnh WSSV, một số thể virus đuôi. (vạch kẻ a = 240 nm (theo Graindorge & Flegel, 1999)) (Nguồn: Bùi Quang Tề, 2003) Tên virus Kích thước virus Kích thước nhân Virus Trung Quốc (HHNBV) 120 x 360 nm Virus tôm Nhật 1 (RVPJ–1) 84 x 226 nm Virus tôm Nhật 2 (RV-PJ-2) 83 x 276 nm 89 x 201 nm Virus bệnh đốm trắng (WSBV) 70 150 x 350 380 nm 56 67 x 330 350 nm Bảng 2.1 Các chủng virus gây bệnh đốm trắng (Nguồn: Tạp chí thông tin KHCN Kinh Tế Thủy Sản, số 4 2004) 9 2.3.2. Vật chủ mang mầm bệnh WSSV Virus gây bệnh đốm trắng phân bố rất rộng ở nhiều vật chủ, virus không chỉ nhiễm ở một số loài tôm he (Penaeus) nuôi ở Tây bán cầu mà còn xuất hiện rất rộng ở bộ mười chân (Decapoda) gồm các loài cua giáp xác khác. Ở Việt Nam, mầm bệnh WSSV nhiễm trên nhiều loài tôm he nuôi hoặc sống tự nhiên: tôm (P. mondon); tôm thẻ (P. indicus); tôm rảo (Metapenaeus ensis); tôm đất (M. lysianassa); tôm chân trắng (L. vannamei) nhập vào nuôi ở Việt Nam (Tạp chí thông tin KHCN Kinh Tế Thủy Sản, số 4 2004). 2.3.3. Các con đƣờng lây truyền WSSV Bệnh đốm trắng do virus WSSV lây lan rất nhanh qua hai đường chính: - Lây lan theo chiều dọc (Vertical transmission): từ bố mẹ nhiễm bệnh lây lan cho con. - Lây lan theo chiều ngang (Horizontal transmission): bị nhiễm virus từ nguồn nước nuôi, từ cua, còng mang virus từ ao này sang ao kia, từ dùng cụ sản xuất còn mang mầm bệnh, từ tôm chết, do người hoặc chim, cò vô tình đưa vào ao,…(Trần Thị Việt Ngân, 2002). Trong đó, lây lan theo chiều ngang là đường lan truyền chủ yếu. Bệnh đốm trắng dễ bị bùng phát khi tôm bị sốc do môi trường biến đổi xấu (Tạp chí thông tin KHCN Kinh Tế Thủy Sản, số 4 2004). 10 2.3.4. Cơ chế xâm nhập Virus gây hội chứng đốm trắng khi xâm nhập vào tôm sẽ cư trú ở nhiều bộ phận của tôm như mô nội bì, mô dạ dày, mang, buồng trứng, tinh hoàn, hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi các bộ phận khác. Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, virus này tiến hành tự nhân bản dựa trên cơ sở vật chất năng lượng của tế bào. Thông qua quá trình này, số lượng thể virus tăng lên rất nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt động bình thường của tế bào. Khi quan sát dưới kính hiển vi, các tế bào bị nhiễm virus thường có nhân phình to. Virus phát triển đến giai đoạn phá vỡ nhân giết chết tế bào, virus lan truyền ra môi trường nước, đi tìm chủ khác lại tiếp tục xâm nhập tấn công (Trần Thị Việt Ngân, 2002). Ngoài ra, tôm ăn phải virus tự do tồn tại trong bùn ao trong nước cũng dẫn đến nhiễm mầm bệnh WSSV (Chou H. Y ctv., 1996; trích bởi Trần Thị Hoàng Dung, 2000). 2.3.5. Triệu chứng của bệnh Dấu hiệu bệnh lý đặc trưng: tôm bị bệnh giảm ăn rõ rệt, mệt mỏi, vỏ bì chùng lỏng với những đốm trắng từ 0,2 2 mm đường kính, biểu hiện ở bề mặt bên trong của vỏ. Trong nhiều trường hợp, tôm hấp hối do bệnh WSSV chuyển sang màu hồng đến màu (Nguồn: Trần Thị Việt Ngân, 2002) LÂY NHIỄM THEO CHIỀU DỌC LÂY NHIỄM THEO CHIỀU NGANG Hình 2.4 Hai vòng lây nhiễm của virus gây bệnh đốm trắng WSSV trong ao nuôi (theo Passano L. M., 1960) [...]... thut Real - time PCR Mt ci tin ni bt hn so vi Nested PCR ú l kh nng nh lng chớnh xỏc s bn sao ban u: Real - time PCR Phng phỏp ny cho phộp rỳt ngn thi gian phõn tớch Kh nng nh lng c kt hp trong k thut Real - time PCR m bo gim thiu xỏc sut dng tớnh gi i vi kt qu phõn tớch Real - time PCR cho phộp phỏt hin v nh lng mm bnh mc mt phõn t (copy) trờn mt mu Vi nhy cao nh vy phng phỏp Real - time PCR cho... dch ni phõn tớch Real - time PCR hay bo qun lnh - 20 oC trong vũng mt tun 30 3.4.3 Tin hnh thc hin Real - time PCR 3.4.3.1 Chun b hn hp thc hin phn ng Real - time PCR - Cho 2 àl dch ly trớch ADN cn phõn tớch vo cỏc ng eppendorf cú cha sn 48 àl hn hp Real - time PCR t th tớch phn ng sau cựng l 50 l - i chng õm: cho 2 àl i chng õm vo ng eppendorf cú cha sn 48 àl hn hp Real - time PCR - i chng dng:... - Kim tra phỏt hin virus gõy bnh m trng trờn 15 mu ó xỏc nh dng tớnh, õm tớnh vi WSSV thụng qua th nghim bng phng phỏp Real - time PCR - Kho sỏt tớnh nh lng ca phng phỏp Real - time PCR - Kho sỏt nhy gia phng phỏp Real time PCR v Non Stop Nested PCR - ng dng phng phỏp Real - time PCR kim tra mm bnh WSSV trờn 30 mu tụm thu t thc t - Theo dừi tỡnh trng thu hoch ca cỏc ao nuụi tụm ó c thu mu kim tra... ra theo tng chu k khi phn ng Real - time PCR xy ra (Bio Rad, 2004) Ngoi ra, Real - time PCR cũn th hin mt s u im ni bt (Nguyn Thỏi Thy, 2003): - Khụng cn in di sau khi thc hin phn ng Real - time PCR - Quy trỡnh n gin, tin trỡnh thc hin nhanh, rỳt ngn thi gian cho kt qu - nhy cao - c hiu cao - ng phn ng PCR luụn luụn úng, trỏnh nguy c ngoi nhim Tuy nhiờn Real - time PCR ũi hi phũng thớ nghim phi... Matrix Chun b hn hp Real - time PCR Chy Real - time PCR iQ Phõn tớch kt qu th biu din mi quan h gia nng hunh quang v s chu k S 3.1 Quy trỡnh thc hin Real - time PCR 33 3.4.4 Thc hin Non Stop Nested PCR 3.4.4.1 Chun b hn hp thc hin phn ng Non Stop PCR - S dng micropipette hỳt 2 àl dung dch tỏch chit ADN ca mu cn phõn tớch cho vo ng eppendorf cú cha sn 48 àl hn hp Non Stop Nested PCR t th tớch phn... thut PCR phỏt hin nhanh vi nhy cao nhng vn cn 18 36 gi cho mt xột nghim K thut ny khụng cú kh nng nh lng chớnh xỏc s bn sao ca tỏc nhõn cn kim tra trong mu bnh phm Trong nhng nm qua, k thut PCR ó phỏt trin khụng ngng thụng qua nhng ci tin mi v nguyờn lý, thit b v húa cht Nested v Real - time PCR l hai ci tin mi ca k thut PCR Nested PCR l phng phỏp ci thin nhy ca k thut PCR Trong khi ú Real - time PCR. .. ú k thut PCR l k thut chn oỏn nhanh, nhy, v cú tớnh c hiu cao K thut ny ó c nhiu nh nghiờn cu quan tõm v phỏt trin, ng thi a ra cỏc ci tin mi nh: Nested PCR, Semi Nested PCR, Real - time PCR, Vi nhy, c hiu rt cao kt hp vi kh nng phỏt hin v nh lng ng thi, Real - time PCR c xem nh mt phng phỏp rt cú ý ngha trong vic xỏc nh chớnh xỏc mc nhim mm bnh, c bit l bnh m trng trờn tụm 2.4 Phng phỏp PCR v cỏc... sỏng Kớnh lc ny s chn lc cỏc ỏnh sỏng cú bc súng thớch hp Sau ú, ỏnh sỏng ny s qua b phn khuch i tớn hiu (intensifier), cui cựng phỏt hin nh u c CCD camera KNH LOẽC PHAT SANG KNH LOẽC KCH THCH TIA SANG LECH Hỡnh 2.9 Nguyờn tc hot ng ca h thng Real - time PCR (Ngun: Nguyn Thỏi Thy, 2003) 2.4.3.5 Phng phỏp phỏt hin tớn hiu Real - time PCR Tớnh c hiu ca Real - time PCR tựy thuc húa cht dựng theo dừi phn... 3.4.5.2) Quy trỡnh thc hin Non Stop Nested PCR c túm tt qua S 3.2 35 Mu tụm Ly trớch bng SDS, NaOH v sc nhit Tinh sch bng Instagene Matrix Chun b hn hp Non Stop Nested PCR Chy Non Stop Nested PCR Chy in di Phõn tớch kt qu 633bp 221bp S 3.2 Quy trỡnh thc hin Non Stop Nested PCR 36 3.4.5 Cỏch c kt qu 3.4.5.1 Real - time PCR Kt qu sau khi thc hin Real - time PCR c x lý trờn phn mm iQ version 3.1 ca mỏy... (genotyping) - ng dng hiu qu trong tr liu thuc i vi tỏc nhõn gõy bnh l virus, Real - time PCR úng vai trũ rt quan trng trong phỏt hin v nh lng tỏc nhõn gõy bnh ny Virus gõy bnh m trng trờn tụm nuụi ang l mi quan tõm chung ca ngnh Thy sn Mt trong nhng ng dng ỏng c quan tõm hin nay ú l s dng k thut Real - time PCR trong phỏt hin v nh lng virus gõy bnh m trng trờn tụm sỳ nuụi 25 Phn 3 VT LIU V PHNG PHP NGHIấN . kỹ thuật Real - time PCR để phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú nuôi. - So sánh kỹ thuật mới: Real - time PCR và kỹ thuật. trình phát hiện và định lượng WSSV trên tôm sú nuôi bằng kỹ thuật Real - time PCR. - Phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú ở các
- Xem thêm -

Xem thêm: PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG KỸ THUẬT REAL – TIME PCR (Phần chính), PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG KỸ THUẬT REAL – TIME PCR (Phần chính), PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG KỸ THUẬT REAL – TIME PCR (Phần chính), Đặt vấn đề 1. MỞ ĐẦU, Phân loại Vùng phân bố Chu kỳ sống, Ở Việt Nam Tình hình dịch bệnh WSSV trên thế giới và Việt Nam 1. Trên thế giới, Vật chủ mang mầm bệnh WSSV Các con đƣờng lây truyền WSSV Cơ chế xâm nhập, Triệu chứng của bệnh Phƣơng pháp chẩn đoán, Lịch sử phát triển Khái niệm Nguyên tắc, Hệ thống Real - time PCR Phƣơng pháp phát hiện tín hiệu Real - time PCR, Nguyên lý định lƣợng của kỹ thuật Real - time PCR Ƣu và nhƣợc điểm, Ứng dụng Kỹ thuật Real - time PCR, Hoá chất Trang thiết bị, dụng cụ và hoá chất 1. Trang thiết bị và dụng cụ, Tiến hành ly trích, Chạy Real - time PCR Phân tích kết quả trên màn hình máy vi tính Chạy Non Stop Nested PCR, Non Stop Nested PCR, Kết quả khảo sát tính định lƣợng của phƣơng pháp Real - time PCR

Từ khóa liên quan

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn