Đang tải... (xem toàn văn)
Ở Việt Nam, phương pháp Southern blot bước đầu được thử nghiệm tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới, trường Đại Học Quốc Gia Hà Nội và trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, còn ở trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM, kĩ thuật này vẫn chưa được phát triển và hoàn thiện phương pháp.
Phụ lục 2 CÁCH PHA HÓA CHẤT 1. Dung dịch chuyển: 20X SSC (NaCl 3M; Natri citrate 0,3 M; pH 7,0) Hòa tan 175,3 g NaCl và 88,2 g Na citrate trong 800 ml nước cất. Điều chỉnh pH đến 7,0 bằng NaOH 10 N. Thêm nước lên đến 1000 ml. Vô trùng bằng autoclave. Với những nồng độ SSC khác nhau, hòa tan SSC 20X với lượng nước thích hợp. 2. Dung dịch biến tính: NaCl 1,5 M; NaOH 0,5 N. Hòa tan hoàn toàn 20 g NaOH và 87,7 g NaCl trong 800 ml nước cất. Thêm nước lên đến 1000 ml. 3. Dung dịch trung tính: Tris-HCl 1 M; NaCl 1,5 M; pH 7,0. Hòa tan hoàn toàn 121,1 g Tris - HCl và 87,7 g NaCl trong 800 ml nước cất. Điều chỉnh pH đến 7,5 bằng HCl. Thêm nước lên đến 1000 ml. 4. Dung dịch lai (hybridization buffer) Thêm 14,5 g NaCl và 20 g blocking reagent vào 500 ml đệm lai. Thêm blocking reagent một cách từ từ. Khuấy dung dịch ở nhiệt độ phòng khoảng 1 – 2 giờ trên máy khuấy từ. Dung dịch có thể sử dụng ngay hoặc bảo quản ở khoảng - 15 o C đến - 30 o C. 5. Dung dịch rửa 1 Thành phần Nồng độ cuối Urea 120 g 2 M SDS 1 g 0,1 % (g/v) Na phosphate 0,5M; pH 7,0 100 ml 50 mM NaCl 8,7 g 150 mM MgCl 2 1M 1 ml 1 mM Blocking reagent 2 g 0,2 % (g/v) Các thành phần trên được hòa tan trong 1000 ml nước cất. Dung dịch này có thể bảo quản 1 tuần ở 2 o C – 8 o C. 79 6. Dung dịch rửa 2 Thành phần nồng độ cuối Tris base 121 g 1 M NaCl 112 g 2 M Pha dung dịch 20X Hòa tan 121 g Tris base và 112 g NaCl trong 800 ml nước cất. Điều chỉnh pH đến 10,0. Thêm nước lên đến 1000 ml. Dung dịch này có thể giữ trong 4 tháng ở nhiệt độ 2 o C – 8 O C. Pha loãng dung dịch rửa 2 đến nồng độ sử dụng Pha loãng dung dịch 20X xuống 20 lần và thêm 2 ml MgCl 2 1 M vào dung dịch. Dung dịch này sử dụng ngay không được bảo quản. 7. Dung dịch rửa phim Dung dịch developer Thành phần: dung dịch A (5 lít), dung dịch B (1 lít), dung dịch C (475 ml) Cách pha: cho 12 lít nước vào thùng chứa lớn, thêm từ từ dung dịch A vào, vừa cho vừa khuấy đều khoảng 5 phút, cho tiếp dung dịch B và dung dịch C vào (thực hiện tương tự như dung dịch A). Thêm nước vào hỗn hợp trên để đạt thể tích 20 lít. Dung dịch fixer Thành phần: dung dịch A (5 lít), dung dịch B (950 ml) Cách pha: cho 12 lít nước vào thùng chứa lớn, thêm từ từ dung dịch A vào, vừa cho vừa khuấy đều khoảng 5 phút, cho tiếp dung dịch B. Thêm nước vào hỗn hợp trên để đạt thể tích 20 lit. 8. Pha Natri phosphate 0,5 M Cân 13,8 g NaH 2 PO 4 .H 2 O trong 200 ml nước. Điều chỉnh pH đến 7,0 bằng NaOH. 9. Pha MgCl 2 1 M Hòa tan 1,9 g MgCl 2 trong 10 ml nước cất 10. Tris – HCl 1,0 M stock solution Hòa tan 6,055 g Tris - HCl trong 40 ml nước. Điều chỉnh pH 7,5 bằng HCl. Điều chỉnh thể tích lên 50 ml. 11. EDTA 0,5 M stock solution 80 Thêm vào 9,305 g Na 2 EDTA .2H 2 O trong 40 ml nước. Khuấy trộn mạnh. Điều chỉnh pH 8,0 bằng NaOH (khoảng 1 g). Điều chỉnh thể tích lên 50 ml. 12. TE: Tris 10 mM, EDTA 1 mM , pH 8,0 Trộn 10 ml của Tris – HCl 1 M stock solution (pH 8,0), 2 ml của EDTA 0,5 M stock solution, và 988 ml nước. 13. NaOH 5 M Hòa tan 2 g NaOH trong 10 ml nước, khuấy cho tan hết. 14. HCl 5 M Hòa tan 1,875 g HCl trong 10 ml nước, khuấy cho tan hết. 15. TAE 0,5 X Cần sử dụng 5 lít, cần 50 ml TAE 50X 16. Ethidium Bromide Hút 7.5 µl ethidium hòa tan trong 300 ml TAE 0,5X . 17. NaOH 50 mM, NaCl 0,1 M Thêm vào 5 ml NaOH 10 N trong 800 ml nước. Sau đó thêm vào 5,85 g NaCl. Điều chỉnh thể tích lên 1 lít. 18. NaOH 0,4 N, SDS 0,1 % Trộn 40 ml NaOH stock solution 10 N, 10 ml SDS 10 %, và 950 ml nước. 19. Tris 0,2 M, SSC 0,1X Trộn 200 ml Tris – HCl (pH 7,5) stock solution 1M, 5 ml SSC 20X, và 795 ml nước. 20. EDTA 2 mM, SDS 0,1 % Trộn 4 ml EDTA 0,5 M, 10 ml SDS 10 %, và 986 ml nước. 81 . Phụ lục 2 CÁCH PHA HÓA CHẤT 1. Dung dịch chuyển: 20X SSC (NaCl 3M; Natri citrate