cDNA sợi đôi Sửa chữa cách xử lý với đoạn Klenow Bổ sung linker thứ Cắt nuclease S1 Sửa chữa cách xử lý với đoạn Klenow DNA polymerase bacteriophage T4 Bổ sung linker thứ hai Cắt enzyme hạn chế Gắn với plasmid vector Biến nạp vào tế bào khả biến E coli 6.8 Đoạn Klenow tạo đầu cho cDNA sợi đơi enzyme nuclease S1 cắt vịng cặp tóc Các linker thứ thứ hai gắn vào hai đầu cDNA, sau đoạn cDNA cắt enzyme hạn chế với vector tạo dịng có vị trí nhận biết hai linker nhân tạo Cuối cùng, đoạn cDNA có hai đầu tương đồng gắn với vector biến nạp vào E coli Cơng nghệ DNA tái tổ hợp 142 Cấu trúc chóp 5’ mRNA Tổng hợp cDNA sợi thứ primer-adapter sợi đơn cDNA sợi thứ Thủy phân RNA bổ sung đuôi đồng trùng hợp vào đầu 3’ sợi cDNA thứ cách dùng terminal transferase Tổng hợp cDNA sợi thứ hai primer-adapter sợi đơn.Tạo nhiều vị trí cắt hạn chế đầu tận cDNA AAAAAAAAAA A A TTTTTTTTTTT T CCCCCCCCCC 3’ AA (A) A n T TT CA GC TG AG G (T)nCAGCTGAGG 5’ 3’ 5’ GGAGTCGACGGGGGGGGGG (A)nGTCGACTCC CCTCAGCTGCCCCCCCCCCC 3’ (T)nCAGCTGAGG 5’ SalI SalI 3’ 5’ GGAGTCGACGGGGGGGGGG (A)nGTCGACTCC CCTCAGCTGCCCCCCCCCCC 3’ (T)nCAGCTGAGG 5’ SalI SalI Cắt sợi cDNA RE thích hợp gắn vào vector pTCGAC(G)n (A)nG G(C)n (T)nCAGCTp 6.9 -adapter tổng hợp theo phương pháp gắn lacZ đư vector vector biểu bacteriophage gt11 Vector Công nghệ DNA tái tổ hợp 143 , vector 1.1 Vector gt10 cI2 bacteriophage coli c DNA E c Eco c c 1.2 Vector gt11 lac E coli Eco lac -ga yếu tố định B (epitopes) yếu tố định mẫu dò o 42 C E coli cI repressor: gen ức chế có sản phẩm protein liên kết với vùng operator promoter gen, kìm hãm phiên mã cách ngăn chặn liên kết RNA polymerase Công nghệ DNA tái tổ hợp 144 37o - - lac o 37 xét (radiochemistry (histochemistry) vector c 2.1 Vector gt18 gt19 vùng (polycloning sites Eco hai (Sal 100 Sal Sal (methylation) K gt19 2.2 Vector gt20 gt21 Các vector gt19 N gt19 sau: - loại bỏ chi chi - Sac Xba Xba 500 bp DNA bacteriophage lac vector gt19 2.3 Vector gt22 gt23 chi Công nghệ DNA tái tổ hợp 3’ 145 lacZ Các vector SacI mang năm là: NotI, XbaI, SacI, Sal Eco Xba chế LacZ Các vector Sal Sal Not phương pháp primer-linker Not lacZ tor theo 2.4 Vector ZAP Vector E coli lac Vector : - sáu EcoRI tương t gt11 - - in vivo Bluescript plasmid thực plasmid DNA DNA Vector nhằm Công nghệ DNA tái tổ hợp 146 cho Vector ZAP ba : - Lai nucleic acid - - lai nucleic acid phát kháng nguyên miễn dịch đặc hiệu 1.1 Lai nucleic acid hồn mẫu dị - mẫu dị mẫu dị hồn in vitro mẫu dị (stringency) - mẫu dị hồn Cơng nghệ DNA tái tổ hợp mẫu dị mẫu dò mẫu 147 dò d (5-10 ic lai n Mục đích hai mẫu dị cho cDNA quan tâm - mẫu dò đoạn nucleotide mẫu dò mẫu dò in vitro biến (degene : + biến Công nghệ DNA tái tổ hợp 148 + - nghiêm ngặt (non-stringency) + biến bốn Inosine sản , ẵ c gt11, gt18-23, Staphylococcus aureus yếu tố định kháng nguyên thứ 125 (v : alkaline phosphatase) hóa ( chương -xem yếu tố định kháng nguyên Công nghệ DNA tái tổ hợp 149 trình mẫu dị yếu tố định kháng ngun , mẫu dò mẫu dò mẫu dò thu n cần lưu ý để đảm bảo dịng cDNA thu được: acid hồn - hồn chuỗi in vitro - in vitro in vivo yếu tố định kháng nguyên Công nghệ DNA tái tổ hợp 150 trình tự vector : thân mRNA (pre-mRNA) hồn phiên mã ngược hóa hồn - mRNA Các bước q trình xây dựng thư viện cDNA sau: bỏ 27 Công nghệ DNA tái tổ hợp 151 bacteriophage 106 hóa bacte u , gt11, - ZAP dephosphoryl hóa E coli - chèn cDNA mười hai hồn hồn hóa Cơng nghệ DNA tái tổ hợp 152 hóa 0,5 - Vector gt10 E coli - Vector vector ZAP, ZAPII gt11, gt18, E coli Y1090hsdR - 4, vector hoàn Eco E coli - Tài liệu tham khảo/đọc thêm Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K 2002 Short Protocol in Molecular Biology Vol and 5th ed John Wiley & Sons, Inc USA Công nghệ DNA tái tổ hợp 153 Brown TA 2001 Gene Cloning-An Introduction 4th ed Blackwell Science, Oxford, UK Calladine CR and Drew HR 1997 Understanding DNA: The Molecule and How It Works 2nd ed Academic Press, London, UK Glick BR and Pasternak JJ 2003 Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA 3rd ed ASM Press, USA Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J 1989 Molecular Cloning-A Laboratory Manual Cold Spring Habor Laboratory Press, USA Ohman DE 1989 Experiments in Gene Manipulation Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, USA Primrose SB, Twyman R and Old RW 2001 Principles of Gene Manipulation 6th ed Blackwell Science, Oxford, UK Rapley R and Walker JM 1998 Molecular Biomethods Handbook Humana Press Inc New Jersey, USA Surzycki S 2000 Basic Techniques in Molecular Biology SpringerVerlag, Berlin, Heidelberg, Germany Công nghệ DNA tái tổ hợp 154 Chương gen tái tổ hợp Escherichia coli V Escherichia coli E coli tăng hiệu s Mặc dù E coli vật chủ lý tưởng để biểu gen eukaryote chúng khơng có khả sửa đổi hậu dịch mã (post-translation modification) cho chuỗi polypeptide protein có cấu trúc phức tạp Tuy nhiên, số trường hợp người ta sử dụng vi khuẩn E coli cho protein có cấu trúc đơn giản Đối với protein có cấu trúc phức tạp, vật chủ thường sử dụng thể eukaryote (ví dụ: nấm men Saccharomyces cerevisiae, nấm mốc Aspergillus niger…) chúng hậu dịch mã Để biểu tất gen ngoại lai E coli phải bắt đầu việc gắn đoạn gen ngoại lai vào vector biểu (thường plasmid) Vector phải có đủ cấu trúc cần thiết sau: -T tế bào vật chủ (ori) ạo nhiều - Các trình tự mã hóa gen thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo trì vector tế bào - Một promoter kiểm sốt phiên mã (ví dụ: lac, trp tac) cho phép sản xuất lượng lớn mRNA từ gen tạo dòng - Các trình tự kiểm sốt dịch mã trình tự liên kết ribosome bố trí thích hợp codon khởi đầu AUG - Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào hướng xác với promoter Chỉ cấu trúc đầy đủ thế, vector biểu mang gen ngoại lai biến nạp vào chủng E coli thích hợp Cơng nghệ DNA tái tổ hợp 155 Chương mô tả phương pháp plasmid vector sử dụng để sản xuất protein dung hợp (fusion protein) protein nguyên thể (native protein) vi khuẩn Các protein dung hợp sản xuất với lượng lớn, dễ dàng tinh dùng để gây đáp ứng miễn dịch Các protein nguyên thể sản xuất vi khuẩn cách gắn promoter mạnh trình tự liên kết ribosome hiệu ngược hướng với gen tạo dòng (vùng 5’ không dịch mã) Thông thường, protein biểu mức độ cao thể vùi không hòa tan I Sản xuất protein dung hợp Protein dung hợp Protein dung hợp (protein lai) mã hóa gen lai dung hợp in vitro hai đoạn gen khác Vì vậy, protein dung hợp mang trình tự amino acid hai protein khác biệt (Hình 7.1) Gen dung hợp Promoter ATG Gen B Gen A DNA SD ATG mRNA SD Met Protein dung hợp N C Hình 7.1 Protein dung hợp Bao gồm gen tạo dòng (gen A) gen khác vi khuẩn (gen B), protein dung hợp có chứa phần protein vi khuẩn SD: đoạn Shine-Dalgarno Sự dung hợp gen thực cách gắn phần mã hóa gen tạo dịng gần đầu cuối 3’ gen vi khuẩn (ví dụ: gen lacZ) Protein dung hợp có ưu điểm sau: Công nghệ DNA tái tổ hợp 156 - Protein dung hợp thường sản xuất với hàm lượng lớn khởi đầu phiên mã dịch mã điều khiển trình tự tiêu chuẩn E coli - Dung hợp trình tự ngoại lai với gen E coli thường cho kết sản phẩm ổn định protein ngoại lai nguyên thể - Protein dung hợp có khối lượng phân tử lớn so với hầu hết protein E coli dễ dàng nhận biết điện di polyacrylamide gel protein Băng protein dung hợp cắt khỏi gel, đông khô (lyophilize) sau nghiền thành bột dùng kháng nguyên - T Các hệ thống vector biểu gen dung hợp với gen lacZ Một số hệ thống vector phát triển để biểu gen dung hợp với gen lacZ Chẳng hạn, vector họ pUR có vị trí tạo dịng BamHI, SalI, PstI, XbaI, HindIII ClaI đầu 3’ gen lacZ (Hình 7.2) Bằng cách chọn lựa vector vị trí cắt hạn chế thích hợp người ta tiến hành dung hợp cho hầu hết gen tạo dịng Trong số trường hợp, dung hợp thực cách loại bỏ đầu tận lồi làm đầy đầu tận bị khuyết trước gắn Một hệ thống vector tương tự khác phát triển để sản xuất protein dung hợp, vector biểu pEX1-3 Promoter PR điều hòa cảm ứng kiểu promoter PL bacteriophage Các vector pEX1-3 có vị trí tạo dịng mang điểm nhận biết EcoRI, SmaI, BamHI, SalI PstI nằm đầu 3’ gen lacZ Các codon kết thúc dịch mã tín hiệu kết thúc phiên mã đặt hướng (downstream) với vị trí tạo dịng (Hình 7.3) Cơng nghệ DNA tái tổ hợp 157 EcoRI Vùng tạo dòng 5000 Pst I Amp r 1000 4000 pUR278 (5,2 kb) lacZ ori Plac 3000 lac UV5 2000 Vùng tạo dòng lacZ pUR278 TGT CAA AAA GGG GAT CCG TCG ACT CTA GAA AGC TTA TCG ATG BamHI Sal I XbaI HindIII ClaI pUR288 TGT CGG GGA TCC GTC GAC TCT AGA AAG CTT ATC GAT GAT BamHI SalI XbaI HindIII ClaI pUR289 TGT CAG GGG ATC CGT CGA CTC TAG AAA GCT TAT CGA TGA BamHI SalI XbaI HindIII ClaI pUR290 TGT CAA AAA GGG GAT CCG TCG ACC TGC AGC CAA GCT TAT CGA TGA BamHI SalI PstI HindIII ClaI pUR291 TGT CGG GGA TCC GTC GAC CTG CAG CCA AGC TTA TCG ATG BamHI SalI PstI HindIII Cla I pUR292 TGT CAG GGG ATC CGT CGA CCT GCA GCC AAG CTT ATC GAT BamHI SalI PstI HindIII ClaI Hình 7.2 Các vector họ pUR Đây vector dung hợp với gen lacZ, có vị trí tạo dịng BamHI, SalI, PstI, XbaI, HindIII ClaI đầu 3’ gen lacZ Chèn đoạn DNA ngoại lai (cDNA) vào vị trí tạo dịng thích hợp cho phép sản xuất protein dung hợp -galactosidase hoạt động với chuỗi peptide mã hóa DNA ngoại lai Các vector pUR278, pUR288 pUR289 chứa vị trí PstI gen Ampr Các vector pUR290, pUR291 pUR292 chứa vị trí PstI vùng tạo dịng vị trí PstI gen Ampr bị loại bỏ Sử dụng plasmid vector tiện lợi đoạn DNA ngoại lai quan tâm tạo dòng vị trí PstI phương pháp GC Cơng nghệ DNA tái tổ hợp 158 PR 5000 PR Amp cro lacI r 1000 pEX2 lacZ (5,8 kb) ori 4000 2000 Term Stop Vùng tạo dòng 3000 Vùng tạo dòng PR cro lacZ EcoRI BamHI SmaI PstI SalI Hình 7.3 Vector pEX2 Plasmid vector dài khoảng 5,8 kb thiết kế để biểu đoạn DNA ngoại lai (cDNA) dung hợp đầu 3’ gen lacZ Phần tận amino gen lacZ thay số trình tự gen cro bacteriophage gen lacI E coli Promoter PR bacteriophage (dùng để biểu protein dung hợp) điều hòa gen ức chế cIts857 bacteriophage Vùng tạo dòng diện đầu 3’ gen lacZ, codon kết thúc dịch mã (Stop) tín hiệu kết thúc phiên mã (Term) bacteriophage fd Xây dựng plasmid biểu phát protein dung hợp Gắn plasmid vector (pUR pEX) thích hợp với đoạn DNA ngoại lai để tạo dung hợp khung đọc Biến nạp vector vào E coli (chủng K12 71/18 JM 103 cho vector pUR, chủng M5219 cho vector pEX) Kiểm tra khuẩn lạc đơn mang đoạn DNA ngoại lai mong muốn cách tách chiết DNA (DNA miniprep) plasmid vector, Công nghệ DNA tái tổ hợp 159 ... Công nghệ DNA tái tổ hợp 150 trình tự vector : thân mRNA (pre-mRNA) hồn phiên mã ngược hóa hồn - mRNA Các bước trình xây dựng thư viện cDNA sau: bỏ 27 Công nghệ DNA tái tổ hợp 151 bacteriophage... Protein dung hợp có ưu điểm sau: Công nghệ DNA tái tổ hợp 156 - Protein dung hợp thường sản xuất với hàm lượng lớn khởi đầu phiên mã dịch mã điều khiển trình tự tiêu chuẩn E coli - Dung hợp trình tự... cDNA RE thích hợp gắn vào vector pTCGAC(G)n (A)nG G(C)n (T)nCAGCTp 6 .9 -adapter tổng hợp theo phương pháp gắn lacZ đư vector vector biểu bacteriophage gt11 Vector Công nghệ DNA tái tổ hợp 143 ,