sau cắt enzyme hạn chế thích hợp điện di kiểm tra agarose gel Sàng lọc khuẩn lạc sản xuất protein dung hợp Phương pháp sàng lọc khuẩn lạc để phát protein dung hợp tiến hành sau: Nuôi cấy qua đêm 37oC (một lượng nhỏ) từ 5-10 khuẩn lạc môi trường LB có chứa ampicillin Sau đó, cảm ứng ni cấy cách bổ sung thêm isopropylthio-β-galactoside (IPTG) cho vector pUR tiếp tục nuôi 37 oC, vector pEX chuyển ni cấy 37oC lên nhiệt độ 40oC tiếp tục ni cấy (có sục khí) Sau khoảng thời gian nuôi cấy khác (1, 2, giờ…), lấy mL dịch nuôi cấy ly tâm nhanh để thu tiểu thể, tái huyền phù chúng đệm SDS, biến tính 100oC phút, ly tâm 12.000 g phút nhiệt độ phòng Tiến hành điện di SDS polyacrylamide gel 6% Dùng dịch huyền phù tế bào mang vector làm đối chứng Protein dung hợp xuất băng dịch chuyển chậm băng β-galactosidase đối chứng Tách chiết protein dung hợp để sản xuất kháng thể Protein dung hợp tách chiết theo số cách: dùng dịch chiết urea, sắc ký lực aminophenylthiogalactoside, điện di SDSpolyacrylamide gel phối hợp cách Phương pháp đơn giản điện di SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), trình trình bày mục (ni cấy lượng lớn 200 mL) Nhuộm gel phát băng protein mới, sau cắt băng khỏi gel, đông khô khoảng ngày nghiền thành bột mịn Bột dùng tiêm vào thỏ để sản xuất kháng thể II Sản xuất protein nguyên thể Các protein nguyên thể sản xuất E coli cách sử dụng promoter điều hịa mạnh trình tự liên kết ribosome hiệu Để biểu gen prokaryote có trình tự liên kết ribosome mạnh cần cung cấp promoter đủ Trong đó, để biểu gen eukaryote (hoặc gen prokaryote với trình tự liên kết ribosome yếu) cần phải cung cấp promoter lẫn trình tự liên kết ribosome (Hình 7.4) Các mức độ biểu khác từ 1% 30% protein hòa tan tổng số (total soluble protein) tế bào Công nghệ DNA tái tổ hợp 160 Promoter Gen A ATG DNA SD ATG mRNA SD Met Protein nguyên thể N C Hình 7.4 Protein nguyên thể Gen tạo dòng (gen A) đặt sau promoter trình tự SD vi khuẩn mRNA mã hóa amino acid đặc hiệu đoạn chèn để tạo loại protein nguyên thể  Biểu gen prokaryote: Promoter Bước biểu protein eukaryote vi khuẩn chọn vector biểu mang promoter mạnh (strong promoter) trình tự DNA h (cịn gọi vùng 5’ khơng dịch mã-5’ untranslation region) t E coli hòa (toxin) E coli plasmid Phần giới thiệu vector biểu mang promoter PL bacteriophage , promoter (lai) trp-lac promoter bacteriophage T7 Promoter PL Promoter PL (31oC), promoter PL Công nghệ DNA tái tổ hợp 161 gen c L L như: pPLa 2311, pPLa pKC30 EcoRI HindIII 6000 1000 Amp r PL PL nutL N pKC30 HpaI (6,4 kb) 5000 ori 2000 tL BamHI 4000 3000 Hình 7.5 Vector pKC30 pKC30 plasmid có kích thước xấp xỉ 6,4 kb, mang promoter PL bacteriophage vị trí nhận biết HpaI nằm vùng hướng (có 321 nucleotides) với vị trí khởi đầu phiên mã P L Plasmid dạng phân chia vector pBR322 chứa đoạn HindIII-BamHI có nguồn gốc từ bacteriophage chèn vào vị trí HindIII BamHI vector Đoạn chèn cDNA mang tín hiệu promoter (P L), vị trí nhận biết sản phẩm gen N (nutL), thân gen N, tín hiệu kết thúc phiên mã phụ thuộc rho (tL) Vị trí nhận biết HpaI nằm với vùng mã hóa gen N Các trình tự DNA chèn vào vị trí HpaI điều chỉnh cách chuyển plasmid tái tổ hợp vào thể tiềm tan bacteriophage mẫn cảm với nhiệt độ (cIts857) Các tế bào sinh trưởng đến pha log 30 oC sau thay đổi tới 40oC để bất hoạt sản phẩm gen cI mở promoter PL Vector dùng để biểu protein cII bacteriophage với mức độ khoảng 4% protein hịa tan tổng số tế bào Cơng nghệ DNA tái tổ hợp 162 Promoter trp-lac E coli tac (một dạng promoter lai promoter trp promoter lac) sử dụng thành công để sản xuất lượng lớn protein E coli (Hình 7.6) - Promoter trp trp - Promoter lac lac trp-lac trplaclac 1982, promoter lai trp-lac lac (lac repressor) Vùng tạo dòng tac promoter 5S T1 Ptac T2 pKK177-3 (2,9 kb) Amp ori r 2000 1000 Vùng tạo dòng Ptac EcoRI SmaI SalI HindIII PstI Hình 7.6 Vector pKK177-3 pKK177-3 tac vector chứa vị trí tạo dịng gen ngoại lai hướng với promoter tac Cùng hướng với vị trí tạo dịng rrnB mang gen 5S E coli hai nhân tố kết thúc phiên mã T1 T2 Công nghệ DNA tái tổ hợp 163 Promoter bacteriophage T7 Một hệ thống biểu khác phát triển Tabor Richardson (1985), Studier Moffatt (1986) hệ thống bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter (Hình 7.7) Hệ thống thiết kế cho biểu có chọn lọc gen tạo dòng Chúng cho phép mức độ biểu cao vài gen không biểu hiệu hệ thống khác EcoRV EcoRI ClaI NheI EcoRV BamHI NheI NdeI 4000 T PstI Amp S10 P 10 BglII r P 10 1000 pET-3a (4,6 kb) ori 3000 2000 Hình 7.7 Vector pET-3 mang promoter (PФ10) bacteriophage T7 Ф10 yếu tố kết thúc phiên mã Ф (TФ) Yếu tố kết thúc phiên mã tạo thể phiên mã có sức đề kháng mạnh hoạt tính exonuclease Vector pET-3a dạng phân chia vector pET-3 vùng khởi đầu dịch mã (S10) bacteriophage T7 Ф10 (protein vỏ bacteriophage T7) có mang vị trí BamHI codon 11 chèn vào Vị trí NdeI (CATATG) đặt vùng khởi đầu dịch mã sử dụng để xây dựng plasmid biểu protein nguyên thể Công nghệ DNA tái tổ hợp 164 EcoRI HindIII 1000 5000 Amp r PL pAS1 (5,8 kb) ori PL nuL nuR tR cII RBS BamHI 2000 4000 3000 cII RBS (ribosome-binding sites: vùng liên kết ribosome) PL cII Met AAGGAAATACTTACAT ATG GAT CC cII SD BamHI Hình 7.8 Vector pAS1 Vector pAS1 plasmid dài khoảng 5,8 kb mang promoter PL bacteriohage vị trí cắt hạn chế BamHI định vị codon khởi đầu ATG gen cII bacteriophage Plasmid có nguồn gốc từ pKC30, gen cII bacteriophage chèn vào vị trí HpaI Gen cII sau cắt bỏ enzyme exonuclease lại codon khởi đầu ATG (G ATG nucleotide vị trí BamHI) Để biểu gen bị codon khởi đầu, pAS1 cắt BamHI sau xử lý với enzyme mung-bean nuclease nuclease S1 để loại bỏ đầu lồi (đầu tận sợi đơn) Gắn DNA đầu với đoạn DNA đầu bắt đầu với codon thứ hai gen biểu đặt gen khung với ATG Các gen chèn vào theo kiểu điều hòa cách chuyển plasmid tái tổ hợp vào thể tiềm tan mẫn cảm nhiệt độ bacteriophage (cIts857) Các tế bào sinh trưởng tới pha log muộn 30 oC sau nâng lên 40oC để bất hoạt gen ức chế (repressor) mở promoter PL Gen chèn vào điều hịa hoạt động protein N nutL nutR để ngăn cản kết thúc tR Công nghệ DNA tái tổ hợp 165 : - 16S rRNA eukaryote định vị - (Hình 7.8) Vector pAS1 mang promoter PL RBS gen cII bacteriophage E coli thích hợp Sàng lọc thể biến nạp để thu khuẩn lạc có mức độ phiên mã cao III Xác định mức độ biểu gen tạo dịng Nói chung có ba cách thường dùng để đánh giá mức độ biểu protein ngoại lai gen tạo dòng: - Điện di polyacrylamide gel để xác định protein có kích thước thích hợp sản xuất mức độ cao tế bào mang vector biểu Thông thường, protein quan tâm quan sát cách nhuộm gel với Coomassie Brilliant Blue thuốc nhuộm bạc Nếu khơng thấy có băng protein dùng thuốc nhuộm này, đánh dấu trao đổi chất với 100 µCi [35S]Met [35S]Cys mL dịch nuôi cấy phút Điện di SDS-polyacrylamide gel thực phóng xạ tự ghi cho phép phát protein quan tâm - Phân tích Western blot cách dùng kháng thể liên kết đặc hiệu với protein quan tâm thẩm tích lên màng nitrocellulose sau thực diện di SDS-PAGE (xem chương 2) - Nếu mức độ biểu thấp nên đặt gen lacZ hướng với gen biểu Như vậy, phiên mã dịch mã hạn chế biểu gen thay đổi hệ thống biểu kiểm sốt thay đổi hoạt tính β-galactosidase Cơng nghệ DNA tái tổ hợp 166 Western blot Phản ứng liên kết kháng ngun-kháng thể có tính đặc hiệu cao Vì vậy, áp dụng phản ứng để phát có mặt tinh protein Kháng thể (antibody) sản xuất đưa kháng nguyên vào thỏ tinh từ máu thỏ sau gây nhiễm Những kháng thể tạo cách kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies-do tế bào lympho khác tiết ra), chúng có khả nhận biết số kháng nguyên Ngược lại, kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies) tương tác với kháng nguyên định Protein gel (điện di SDS) Thẩm tích protein lên màng nitrocellulose Kháng thể đặc hiệu Gắn kháng thể với protein kháng nguyên Kháng thể có đánh dấu enzyme Gắn kháng thể với kháng thể Bổ sung chất Phát triển màu Hình 7.9 Sơ đồ kỹ thuật Western blot Kháng thể đánh dấu bằng enzyme (hoặc chất phát huỳnh quang) để phát protein đặc hiệu (thường thẩm tích lên màng nitrocellulose sau chạy điện di SDS-PAGE, cố định đó) thơng Công nghệ DNA tái tổ hợp 167 qua kỹ thuật Western blot (hoặc immunoblot) (Hình 7.9) Cơ chế phản ứng liên kết kháng nguyên-kháng thể trình bày hình 7.10 Sau protein màng lai gắn với kháng thể thứ đặc hiệu tiếp đến kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme (alkaline phosphatase, horse-radish peroxidase…) phức hợp liên kết với chất để tạo màu Sự diện protein ngoại lai (sản phẩm dịch mã gen ngoại lai chuyển vào tế bào vật chủ) phát nhờ xuất màu phản ứng lai Kháng thể (thỏ/chuột) liên AP kết alkaline phosphatase AP Kháng thể (thỏ/chuột) AP Protein kháng nguyên Hình 7.10 Sơ đồ mô tả liên kết protein (kháng nguyên) với kháng thể thứ đặc hiệu kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme Western blot Sự phân bố protein đặc hiệu tế bào tổ chức mơ phát kỹ thuật lai in situ (in situ hybridization) với nguyên tắc tương tự Western blot Ngoài ra, kháng thể sử dụng để tinh protein đặc hiệu kết tủa miễn dịch sắc ký lực (affinity chromatography) Kháng thể đánh dấu dùng để định lượng kháng nguyên kỹ thuật xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay) gọi tắt ELISA ELISA ELISA kỹ thuật hóa sinh, dựa phản ứng liên kết kháng nguyên-kháng thể, dùng chủ yếu miễn dịch học để phát có mặt kháng thể kháng nguyên mẫu Tương tự kỹ thuật Western blot, ELISA người thường dùng hai loại kháng thể Một Công nghệ DNA tái tổ hợp 168 kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên protein (kháng thể thứ nhất) Một kháng thể khác, phản ứng với phức hợp kháng thể-kháng nguyên, kết hợp với enzyme (kháng thể thứ hai) Kháng thể thứ hai nhờ có liên kết với enzyme (như tên kỹ thuật xét nghiệm) nên bắt màu với chất để tạo tín hiệu (Hình 7.11) Kháng nguyên gắn lên giếng Kháng thể Kháng thể liên két enzyme Enzyme phức hợp kháng nguyênkháng thể bắt màu với chất Một giếng đĩa ELISA Đĩa ELISA (microtiter plate) có 96 giếng Hình 7.11 Sơ đồ kỹ thuật ELISA Công nghệ DNA tái tổ hợp 169 Do ELISA thực để đánh giá có mặt kháng nguyên kháng thể mẫu phương pháp quang phổ (đo độ hấp thụ quang), cơng cụ hữu ích để xác định nồng độ (định lượng) kháng nguyên kháng thể IV Tăng mức độ biểu gen tạo dòng E coli Tuy nhiên, lac Plasmid dùng phương pháp pLG mang gen lac -galactosidase Tuy nhiên, - - Mức độ biểu thấp gen tạo dịng RNA không ổn định, kết thúc chưa hồn chỉnh, dịch mã khơng hiệu quả, protein không ổn định V Tinh protein Thể vùi phương pháp hòa tan thể vùi 1.1 Thể vùi Protein có mức độ biểu cao E coli thường tạo hạt nhỏ khơng hịa tan tế bào chất (thể vùi), quan sát kính hiển ngược pha tách khỏi dịch tan tế bào sống phương pháp ly Công nghệ DNA tái tổ hợp 170 tâm Các tế bào biểu mức độ cao protein ngoại lai cô lại ly tâm phá vỡ kỹ thuật học, siêu âm, dùng lysozyme kết hợp với chất tẩy Các thể vùi (inclusion) tạo tiểu thể ly tâm rửa với Triston X-100 EDTA urea Để thu chất hòa tan, protein hoạt động, thể vùi rửa phải hòa tan sau phải tái cuộn xoắn Mỗi protein cần phương pháp hịa tan khác thường xác định theo kinh nghiệm Các điều kiện khác (ví dụ: guanidine HCl [5-8 M], urea [6-8 M], SDS, alkaline pH, acetonitrile/propanol) sử dụng để hòa tan thể vùi Trong nhiều trường hợp, cần pha loãng đơn giản dịch chiết hịa tan đệm thích hợp đủ Nếu protein chứa cầu nối disulfide, người ta cần phải tiến hành oxy hóa khử glutathione Một đơi cần bổ sung đồng dung môi (co-solvent) PEG, chất tẩy rửa Triton X-100, Tween 20 Zwittergent 3-16 Sau hịa tan thành cơng, thử nghiệm phương pháp tái cuộn xoắn khác bao gồm pha loãng thẩm tách Hiệu suất tạo protein hoạt động protein có liên kết disulfite giống protein gốc phụ thuộc vào nồng độ, độ tinh kích thước chuỗi polypeptide; độ pH cường lực ion dung môi; tỷ lệ tái cuộn xoắn chúng Các nhân tố khác bao gồm số lượng liên kết disulfite chất protein Trong số trường hợp, protein hịa tan khó tái cuộn xoắn người ta thấy việc bổ sung chaperonins giúp ích cho q trình Chaperonins protein cần để đảm bảo cuộn xoắn xác in vivo protein, với khả thuận lợi chaperonin tái tổ hợp chúng dùng để xúc tác cho q trình tái cuộn xoắn xác in vitro protein Nguyên nhân tạo thành thể vùi chưa biết đầy đủ, khơng phải tất protein biểu mức độ cao tạo thành thể vùi Tế bào vật chủ thể vai trị quan trọng Cấu trúc xác protein tái tổ hợp ảnh hưởng tạo thành thể vùi Một nghiên cứu thực với -interferon người tái tổ hợp cho thấy vài thay đổi amino acid ảnh hưởng đến chuyển hóa biểu protein hịa tan khơng hịa tan E coli Công nghệ DNA tái tổ hợp 171 1.2 Phương pháp hòa tan thể vùi 1.2.1 Làm tan tế bào Ly tâm thu tiểu thể tế bào E coli, tái huyền phù tiểu thể phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) lysozyme, đặt nhiệt độ phòng (RT) khoảng 20 phút (thỉnh thoảng khuấy) Sau đó, bổ sung deoxycholic acid, đặt 37oC khuấy dịch tan trở nên sền sệt, bổ sung DNase I để 30 phút RT 1.2.2 Tinh rửa thể vùi - Phương pháp Ly tâm dịch tan thu bước trên, tái huyền phù tiểu thể Triston X-100 EDTA, giữ RT phút Ly tâm 15 phút lấy tiểu thể tái huyền phù nước Trộn dung dịch với đệm SDS gel-loading dye phân tích điện di polyacrylamide gel để xác định protein quan tâm có tiểu thể khơng - Phương pháp Ly tâm dịch tan, tái huyền phù tiểu thể nước Sau đó, ly tâm lại tái huyền phù tiểu thể Tris.HCl có bổ sung urea Ly tâm tái huyền phù tiểu thể nước Trộn dung dịch với đệm SDS gel-loading dye phân tích điện di polyacrylamide gel để xác định điều kiện rửa thích hợp cho protein 1.2.3 Hịa tan thể vùi Treo tiểu thể rửa đệm dung ly chứa PMSF urea, để RT Bổ sung dung dịch có KH2PO4, EDTA NaCl để 30 phút RT, trì pH 10,7 KOH Điều chỉnh pH tới 8,0 HCl để 30 RT Ly tâm thu tiểu thể tái huyền phù đệm SDS gel-loading dye Phân tích điện di để xác định mức độ hịa tan Các đuôi lực Khái niệm đuôi lực xuất thiết kế di truyền với mục đích giúp cho tinh protein enzyme hiệu Gen protein quan tâm dung hợp với chuỗi DNA mã hóa cho số trình tự amino acid đơn giản hóa q trình tinh protein, cách biến đổi tính chất kiểu dự đốn Một trường hợp dung hợp di truyền số gốc arginine với C-terminus Công nghệ DNA tái tổ hợp 172 urogastrone Gen sản xuất protein liên kết mạnh với khuôn trao đổi ion cho cation Đi polyarginine sau loại bỏ cách dùng enzyme bất động carboxypeptidase A Sắc ký lực Liên kết Rửa Các thành phần khác hỗn hợp cácprotein Protein đích Muối Loại muối Phối tử Resin lực Hình 7.12 Tinh protein đích sắc ký lực Cho hỗn hợp protein tái tổ hợp qua cột sắc ký có chứa phối tử liên kết đặc hiệu với protein mang đuôi lực (ví dụ: His, Histidine GST, glutathione-S-transferase) Các chất bẩn rửa trôi khỏi cột, protein liên kết cột sau rửa giải dạng tinh Đi lực có nhiều ưu điểm tinh protein Trong IMAC (immobilized metal ion affinity chromatography), His liên kết chọn lọc cao với Ni2+ kim loại chuyển tiếp khác bất động phối tử, protein có gắn lực rửa giải chọn lọc imidazole Protein gắn đuôi GST liên kết với glutathione phối tử, rửa giải với dung dịch glutathione Các protein có dung hợp GST mang hoạt tính enzyme tinh điều kiện tự nhiên Ngược lại, protein gắn His tinh điều kiện tự nhiên biến tính Cơng nghệ DNA tái tổ hợp 173 Protein dung hợp (protein đích + GST) GST Protein đích Hình 7.13 Phân tích SDS-PAGE nhuộm Coomassie Blue sản phẩm protein sau tinh sắc ký lực 1: Chuẩn khối lượng phân tử protein 2: Protein hòa tan tổng số 3: Protein dung hợp (protein đích GST) rửa giải khỏi cột glutathione sepharose 4: Protein dung hợp cắt PresCission Protease cho băng GST protein đích 5: Protein đích tinh sau cho qua IMAC Khó khăn chủ yếu dung hợp lực để tinh protein phải loại bỏ thành công đuôi lực tác nhân sử dụng Vấn đề giải phần biến nạp di truyền điểm đặc hiệu cao cho protease cho cắt bỏ liên kết acid không bền chỗ nối protein tái tổ hợp đuôi lực Nhiều phương pháp phân cắt gợi ý Sử dụng protease đặc hiệu thích hợp cả, ứng dụng điều kiện “nhẹ nhàng”, chủ yếu thrombin, enterokinase Factor Xa Tất protein hoạt động 37oC phân cắt vị trí bên protein quan tâm, tính đặc hiệu từ nhiễm bẩn protease Cuối cùng, bước sắc ký yêu cầu để loại bỏ đuôi lực phân cắt protease Trong phát triển gần lĩnh vực này, người ta sử dụng dạng tái tổ hợp protease 3C từ rhinovirus người Protease có kích thước nhỏ (20 kDa) có tính đặc hiệu hạn chế Nó biểu protein tái tổ hợp dung hợp với glutathione-Stransferase Điều có vài ưu điểm, thân protease tinh Cơng nghệ DNA tái tổ hợp 174 sắc ký lực glutathione-Sepharose Nếu protein đích biểu dung hợp với glutathione-S-transferase tinh cột glutathione-Sepharose Sau xử lý với protease, protein đích phân tách khỏi đuôi glutathione-S-transferase protease cách chuyển qua cột glutathione-Sepharose thứ hai Một cách khác, phản ứng phân cắt đặt cột glutathione-Sepharose thứ cách bổ sung protease vào đệm cột, tránh cần thiết cho cột thứ hai Protease có sẵn dạng thương mại tên PreCission Protease Amersham Pharmacia Biotech sản xuất (Hình 7.12 7.13) tham khảo/đọc thêm Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K 2002 Short Protocol in Molecular Biology Vol and 5th ed John Wiley & Sons, Inc USA Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J 1989 Molecular Cloning-A Laboratory Manual Cold Spring Habor Laboratory Press, USA Ohman DE 1989 Experiments in Gene Manipulation Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, USA Primrose SB, Twyman R and Old RW 2001 Principles of Gene Manipulation 6th ed Blackwell Science, Oxford, UK Rapley R and Walker JM 1998 Molecular Biomethods Handbook Humana Press Inc New Jersey, USA Rosenberg IM 1996 Protein Analysis and Purification-Benchtop Techniques Birkhäuser, Boston, USA Surzycki S 2000 Basic Techniques in Molecular Biology SpringerVerlag, Berlin, Heidelberg, Germany Walker JM 2002 The Protein Protocols Handbook 2nd ed Humana Press Inc Totowa, New Jersey, USA Công nghệ DNA tái tổ hợp 175 ... này, người ta sử dụng dạng tái tổ hợp protease 3C từ rhinovirus người Protease có kích thước nhỏ (20 kDa) có tính đặc hiệu hạn chế Nó biểu protein tái tổ hợp dung hợp với glutathione-Stransferase... cố định đó) thơng Cơng nghệ DNA tái tổ hợp 167 qua kỹ thuật Western blot (hoặc immunoblot) (Hình 7.9) Cơ chế phản ứng liên kết kháng nguyên-kháng thể trình bày hình 7 .10 Sau protein màng lai gắn... thể Một Công nghệ DNA tái tổ hợp 168 kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên protein (kháng thể thứ nhất) Một kháng thể khác, phản ứng với phức hợp kháng thể-kháng nguyên, kết hợp với enzyme (kháng