Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc Lời cảm ơn Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới thầy hướng dẫn PGS.TS Cao Văn Thu, người đã hướng tận tình và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Đồng cảm ơn các thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ Sinh học - Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập. Xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè và những người đã giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian qua. Với khát vọng thì nhiều nhưng thời gian và kiến thức của bản thân có hạn nên đề tài khó tránh khỏi những sai sót. Tôi rất mong sự chỉ bảo của thầy cô và sự góp ý của các bạn. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2006 Sinh viên Phạm Thị Ngọc Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02 Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc Chú giải chữ viết tắt ADN : axit Deoxyribonucleic B.cereus : Bacillus cereus ATCC 9946 B.pumilus : Bacillus pumilus ATCC 10441 B.subtilis : Bacillus subtilis ATCC 6633 D : Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Dmhc : Dung môi hữu cơ E.Coli : Escheriachia Coli ATCC 25922 P.aeruginosa: Pseudomonas Nhiễm sắc thể aeruginosa VM 201 P.mirabilis : Proteus mirabilis BV 108 S(Spiral) : Xoắn lò xo s : độ lệch chuẩn đã hiệu chỉnh S.typhi : Salmonella typhi DT220 S.flexneri : Shigella flexneri DT 122 S.lutea : Sarcina lutea ATCC 9314 Sm(smooth) : Nhẵn S.aureus : Staphylococus aureus ATCC 1228 VSV : Vi sinh vật ISP : Chương trình Streptomyces Quốc tế MT : Môi trường dd : Dung dịch VK : Vi khuẩn Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02 Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc Đặt vấn đề Hiện nay cùng với sự phát triển của công nghệ thông tin thì công nghệ sinh học cũng được coi là một trong những ngành công nghệ hàng đầu của thế giới. Trong đó phải kể đến công nghệ sinh học vi sinh vật sản xuất kháng sinh, vitamin và các hoạt chất ứng dụng trong y học cũng như các lĩnh vực khác phục vụ đời sống con người đang có những phát triển vượt bậc. Từ những phương pháp sinh tổng hợp và bán tổng hợp thì công nghệ vi sinh sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò của mình. Trong số hơn 10.000 chất kháng sinh được tìm ra thì có khoảng 2.000 chất do thực vật tạo ra còn khoảng 8.000 chất là kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp, trong đó xạ khuẩn tổng hợp hơn 60%. Các công trình nghiên cứu đã chứng minh Streptomyces là một chi xạ khuẩn gồm nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc và đặc điểm kháng khuẩn. Đặc biệt một số loài trong chi này có khả năng tổng hợp các chất chống ung thư và điều trị HIV- AIDS. Tuy nhiên có một vấn đề gây lo âu lớn đối với các nhà nghiên cứu, đó là sự xuất hiện của các vi sinh vật kháng kháng sinh và các chất hóa trị liệu khác. Do đó các nhà khoa học và các chuyên gia y tế đã không ngừng tìm kiếm những phương sách để chống lại hiện tượng này. Tại bộ môn Vi sinh và Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội, chúng tôi tiến hành phân lập và nghiên cứu về chủng Streptomyces 40.16 với các mục đích sau: + Từ chủng Streptomyces đã được phân lập, chọn giống sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất bằng chọn lọc ngẫu nhiên và đột biến, + Nghiên cứu môi trường nuôi cấy và điều kiện lên men tối ưu, + Nghiên cứu đặc điểm, hình thái và sinh lý nhằm xác định tên khoa học của chủng Streptomyces 40.16 theo khóa phân loại ISP, Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02 Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc + Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết, tách sản phẩm và các đặc tính của kháng sinh do xạ khuẩn Streptomyces 40.16 tổng hợp lên. PHần 1 TổNG QUAN 1.1. VÀI NẫT VỀ KHÁNG SINH [5][6][8][11] 1.1.1.Lịch sử Năm 1928, nhà vi khuẩn học người Anh Alexander Fleming trong khi nghiên cứu tụ cầu khuẩn ông nhận thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễm vào hộp peptri nuôi tụ cầu tạo thành vũng vụ khuẩn. Hiện tượng kỡ lạ này đó được Fleming nghiên cứu và phân lập thuần khiết và xác định được mốc xanh đó là Penicillium notatum một chủng tạo ra penixilin. Năm 1941 penixilin được nghiên cứu sản xuất phục vụ điều trị cho thương binh trong đại chiến thế giới thứ II và kỷ nguyên của chất kháng sinh được thừa nhận. Cho đến nay người ta đó phỏt hiện và mụ tả khoảng hơn 8000 chất kháng sinh khác nhau có nguồn gốc từ nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn. Thuật ngữ kháng sinh (antibiotic) được Waksman N.A gọi từ 1944 khi ụng phỏt minh ra streptomycin từ mụi trường nuôi cấy Streptomyces griseus 1.1.2 Định nghĩa Kháng sinh là những hợp chất hóa học do vi sinh vật tiết ra có tác dụng ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chọn lọc một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, protozoa, virus) hay cả tế bào ung thư ở nồng độ thấp. 1.1.3.Cơ chế tác dụng của kháng sinh. Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp rất khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh. Chúng liên kết vào các vị trí chính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứng trao đổi chất. Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02 Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc trong nhiều trường hợp người ta vẫn chưa biết được chính xác hết. Có 6 mức tác dụng khác nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: Tác dụng lên thành tế bào, tác dụng lên màng nguyên sinh chất, tác dụng lên quá trình tổng hợp ADN, tác dụng lên quá trình tổng hợp protein, tác dụng lên sự trao đổi chất hô hấp và cuối cùng là tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian. 1.1.4.Phân loại kháng sinh Phân loại kháng sinh có thể theo nhiều cách, nhưng theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất.Bảng 1 giới thiệu một số nhóm kháng sinh quan trọng. Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02 Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc Bảng 1: Các chất kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hoá học Phân loại Nhóm kháng sinh Kháng sinh cụ thể 1. Các kháng sinh có chứa đường trong phân tử Aminoglycosid Orrthsomycin N-glycosid C-glycosid Glycolipid Streptomycin, neomycin Everninomycin Streptothricin Vancomycin Moenomycin 2. kháng sinh chứa vũng lacton lớn (macrocyclic lacton) Kháng sinh macrolid Kháng sinh polyen Ansamycin Macrotetrolid Erythromycin Candicidin, nistatin Rifamicin Tetranactin 3. Quinon và các kháng sinh cựng họ Anthracyclin Naphthoquinon Benzoquinon Cỏc tetracyclin Adriamycin Actinorhodin Mitomycin Tetracyclin, teramycin 4. Các kháng sinh aminoacid và peptid Dẫn xuất aminoacid Khỏng sinh betalactam Khỏng sinh peptid Chromopeptid Depsipeptid Cycloserin Penicilin, Cephalosporin Bacitraxin, polymycin Actinomycin Valinomycin 5. Khỏng sinh dị vũng chứa nitơ Cỏc Khỏng sinh nucleosid Polyoxin 6.Khỏng sinh dị vũng chứa oxy Cỏc Khỏng sinh polyether Monensin 7. Các Kháng sinh nhân thơm Dẫn xuất benzen, các ête thơm Cloramfenicol Novobiocin 1.1.5 Khỏi niệm về khỏng khỏng sinh Kháng kháng sinh là hiện tượng VSV mất đi tính nhậy cảm ban đầu của nó trong một thời gian vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hoá trị liệu. Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02 Kho lun tt nghip Phm Th Ngc Khỏng sinh ch yu mt tỏc dng theo 3 c ch: Thay i v trớ ớch, gim tớnh thm ca thuc hoc do tỏc ng ca enzym lm mt hot tnh ca khng sinh. Tớnh khỏng khỏng sinh c di truyn cho cỏc th h tip theo. Bn cht di truyn tớnh khỏng thuc c khng nh nh tỏc nhõn gõy t bin v plasmid. Cỏc quỏ trỡnh ny lan truyn tớnh khỏng thuc ngoi nhim sc th xy ra mc phõn t, ti np nh bacteriophage v bin np vo vi khun v tip hp. 1.1.6 S mụ t quy trỡnh sn xut khỏng sinh T i n h c h ế G i ố n g t r u y ề n ủ t r o n g p h ò n g t h í n g h i ệ m S i n h k h ố i S i n h k h ố i k h ô D ị c h c h i ế t s i n h k h ố i S ả n p h ẩ m T i n h c h ế B ì n h n h â n g i ố n g C 1 , C 2 , C 3 B ì n h l ê n m e n t ạ o k h á n g s i n h T i n h c h ế D ị c h l ọ c D ị c h c h i ế t K S đ ậ m đ ặ c S ả n p h ẩ m đ ã k i ể m n g h i ệ m n g h i ệ m S ả n p h ẩ m đ ó n g g ó i S ả n p h ẩ m T i n h c h ế L ọ c D ị c h s a u l ê n m e n Khoa Cng Ngh Sinh Hc Lp 02-02 Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc Hình 1. Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02 Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc 1.1.7 Ứng dụng của khỏng sinh Kháng sinh được sử dụng trong y học từ 1940 (penixilin) sau đó một loạt các chất kháng sinh khác từ xạ khuẩn được phát minh ra và nhanh chóng được sử dụng để diều trị bệnh nhiễm trùng hiểm nghèo. Bảng 2 :Một vài khỏng sinh quan trọng cú giỏ trị kinh tế cao Tờn khỏng sinh Vi sinh vật sản xuất khỏng sinh Hoạt phổ Penicilin G Penicillium chrysogenum Khỏng khuẩn Streptomycin S. griseus Khỏng lao Tetracyclin S. aureofaciens Khỏng khuẩn Chloramfenicol S. venezuela Khỏng khuẩn Oxytetracyclin Str. Rimosus Khỏng khuẩn Cephalosporin C Cephalosporium acremonium Khỏng khuẩn Actinomycin D S. antibioticus Kháng ung thư Bleomycin S. verticillum Kháng ung thư Daunorubicin S. peucetius Kháng ung thư Mitomycin C Streptomyces sp Kháng ung thư Kanamycin S. kanamyceticus Khỏng khuẩn Nistatin S. noursei Khỏng nấm Fumagillin Aspergillus fumigatus Khỏng protozoa Griseofulvin Penicillium griseofulvum Khỏng nấm Nisin Streptococcus sp. Bảo quản thực phẩm Natamycin Streptococcus sp. Bảo quản thực phẩm Rifamycin Nocardia mediteranei. Khỏng lao Polymyxin B Bacillus polymyxa Khỏng khuẩn Gentamycin Micromonospora purpurea. Khỏng khuẩn Khỏng sinh cũn được sử dụng trong thú y để điều trị các bệnh nhiễm trùng của động vật như viêm phổi ở trâu bũ, tụ huyết trựng ở lợn, v.v…Trong chăn nuôi kháng sinh được sử dụng làm chất bổ sung vào thức ăn nhằm kích Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02 Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc thích tăng trọng. Rất nhiều chẩt kháng sinh được ứng dụng với mục đích này (các kháng sinh nhóm tetracyclin, monenzin,…). Khỏng sinh cũn được ứng dụng trong nông nghiệp trước hết để tiêu diệt các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng như các bệnh khô vằn, vàng lụi ở lúa (validamyin, blasticidin S, kasugamyxin, v.v…), bệnh thối cổ rễ ở các cây có củ,v.v…Kháng sinh cũn kớch thớch nẩy mầm của hạt. Thường ngâm hạt trong dung dịch kháng sinh trước khi gieo vừa để kích thích nẩy mầm, vừa tiêu diệt mầm bệnh trong đất. Khỏng sinh cũn được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để bảo quản thực phẩm đóng hộp.Nếu dùng kháng sinh thực phẩm đóng hộp sẽ bảo quản được lâu hơn, khử trùng ở nhiệt độ thấp hơn nên chất lượng thực phẩm giữ được tốt hơn(ví dụ nizin). 1.2.ĐẠI CƯƠNG VỀ XẠ KHUẨN [1][9][11][14][15] 1.2.1 Đặc điểm của xạ khuẩn * Đặc điểm chung của xạ khuẩn: (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) có cấu tạo sợi như nấm (nấm tia) nhưng lại có khích thước và cấu tạo tế bào gần giống vi khuẩn, chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nước và trong các chất hữu cơ. - Những đặc điểm đặc trưng của xạ khuẩn : + Kích thước của xạ khuẩn nhỏ bé tương tự như vi kích thước vi khuẩn + Nhân của xạ khuẩn là nhân không điển hình + Màng tế bào xạ khuẩn khụng chứa xenlulo và kitin + Sự phân chia tế bào của xạ khuẩn theo kiểu của vi khuẩn + Xạ khuẩn không có giới tớnh - Tuy vậy xạ khuẩn lại có hình thái, cấu tạo sợi, phát triển bằng phân nháh thành những sợi nhỏ, dài gọi là khuẩn ti (hipha), mỗi khuẩn ti do một tế bào hình thành, tập hợp của các khuẩn ti này gọi là hệ khuẩn ti. * Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn : Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02 [...]... chiết tách để lấy kháng sinh Việc lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào bản chất của kháng sinh Một số phương pháp tách chiết hay được sử dụng: - Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ, - Phương pháp kết tủa, - Phương pháp dùng nhựa trao đổi ion Dù lựa chọn phương pháp nào thì mục đích cuối cùng vẫn là thu được một sản phẩm kháng sinh có độ tinh khiết cao Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh thường áp dụng. .. 4,5-Epoxy-8demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung thư vú từ Streptomyces hygroscopicus Geldanamycin thuộc họ kháng sinh benzoquinon gần đây đã được sự thu hút bởi những đặc tính dược lý học của nó như: ức chế tạo thành tiểu cầu, ức chế enzym sao mã ngược, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ung thư… với nồng độ ức chế tối thiểu (IC50) là 13nM khi tiến hành test với dòng tế bào NCI Đặc tính kháng ung thư của geldanamycin... dịch lên men đem lọc được dịch lọc và sinh khối - Xác định kháng sinh ngoại bào: Lấy dịch lọc đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch, có hoạt tính thì đó là kháng sinh ngoại bào Chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng phương pháp chiết tách - Xác định kháng sinh nội bào: Sinh khối được rửa 3 lần bằng nước cất, sấy khô ở 45-500C trong 24 giờ Nghiền vỡ sinh khối trong cối sứ với dung môi thích... + Khả năng sử dụng các nguồn đường của xạ khuẩn 1.2.4 Khả năng sinh tổng hợp khỏng sinh của Streptomyces Một số khỏ lớn khỏng sinh do các loài Streptomyces sinh tổng hợp, rất đa dạng, có trong hầu hết các nhóm phân loại kháng sinh 1.3 CẢI TẠO GIỐNG VI SINH VẬT [1][5][8][10][11][15] 1.3.1.Mục đích Trong thực tế không thể phân lập được từ tự nhiên một chủng VSV có khả năng tạo chất kháng sinh mong muốn... hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định Kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02 Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc Tiến hành: + Chuẩn bị môi trường cấy vi sinh vật kiểm định: Vi sinh vật... trên cơ sở độ tan của các chất thường giảm theo nhiệt độ * Sấy khô: Có nhiều phương pháp sấy trên cơ sở dùng nhiệt độ cao, độ thoáng khí hoặc hút * Nghiền vỡ tế bào VSV: Trường hợp kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất nội bào, để thu được kháng sinh cần phá vỡ tế bào VSV, có thể dùng phương pháp vật lý, hóa học hoặc sinh học 1.7 Một số nghiên cứu mới trong sản xuất kháng sinh [12][13][16][17] 1.7.1 Kháng. .. xác định 1.6 Tách chiết và tinh chế [4][7] Trong hầu hết các trường hợp thì sản phẩm đích (kháng sinh) chỉ là một lượng rất nhỏ trong tổng số dịch lên men (0,2-30g/l) Kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, do đó kết thúc quá trình lên men kháng sinh có thể nằm trong sinh khối (ví dụ: gramicidin, nystatin) hoặc trong dịch lọc (ví dụ: penixilin, streptomycin) tùy thuộc vào đặc điểm của loài Vì... phương pháp làm giàu đất, phương pháp thêm kháng sinh vào môi trường phân lập, phân lập VSV sinh kháng sinh chống ung thư 1.3.3 Các phương pháp cải tạo giống A Phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn lọc tự nhiên hay còn gọi là sàng lọc ngẫu nhiên là tuyển chọn lấy những dạng chủng có những đặc tính sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất, xuất hiện ngẫu nhiên do sự tác động của các điều kiện ngoại cảnh B.Đột biến... hoạch thực nghiệm Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02 Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh [2][5][8] 1.5.1 Bản chất của quá trình lên men Lên men thực chất là phản ứng ôxi hóa khử sinh học xảy ra nhờ xúc tác của các enzim do VSV tự tổng hợp với mục đích cung cấp năng lượng và tạo ra các sản phẩm trao đổi chất trong dịch lên men 1.5.2 Giống vi sinh vật Trong lên men công... 4,5-Epoxy-8-demethylgeldanamycin là những kháng sinh có khả năng ứng dụng cao đối với mô hình bệnh tật hiện nay được sinh tổng hợp từ Streptomyces sp 1.7.4 Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase từ Streptomyces sp Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp 02-02 Khoỏ luận tốt nghiệp Phạm Thị Ngọc Nhóm các hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase gồm tetrapetalone B (2, C28H35NO9), C (3, C26H34NO8), . ung thư ở nồng độ thấp. 1.1.3 .Cơ chế tác dụng của kháng sinh. Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp rất khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh. Chúng liên kết. xác hết. Có 6 mức tác dụng khác nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: Tác dụng lên thành tế bào, tác dụng lên màng nguyên sinh chất, tác dụng lên quá trình tổng hợp ADN, tác dụng lên quá trình. khỏng khỏng sinh Kháng kháng sinh là hiện tượng VSV mất đi tính nhậy cảm ban đầu của nó trong một thời gian vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hoá trị liệu. Khoa Cụng Nghệ Sinh Học Lớp