Đang tải... (xem toàn văn)
Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất.
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau [4]. Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20-30% [6]. Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết. Để tách và tinh chế enzyme nói riêng và protein nói chung thường có một loạt phương pháp hóa-lý và hóa học khác nhau. Có thể chia làm ba nhóm phương pháp sau: - Phương pháp kết tủa - Phương pháp sắc ký SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 1 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô - Phương pháp phân tách hệ hai pha nước Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 2 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Chương 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYM PROTEASE 1.1. Tình hình nghiên cứu enzyme. 1.1.1. Vấn đề nghiên cứu enzyme ở nước ta Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme - chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế. Nghiên cứu về công nghệ enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, trypsin . sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase. Đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, bột protein thịt bằng bromelain từ đọt dứa, lên men rượu bằng enzyme cố định trên cột. Cũng đã có những nghiên cứu sử dụng peroxydase, cyt-P 450 trong chế tạo biosensor và thuốc phát hiện chất độc . Trong lĩnh vực y dược, việc nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của một số enzyme nhằm mục đích kiến tạo nên một số thuốc dùng điều trị một số bệnh đặc biệt là tạo ra một số chế phẩm thuốc chống suy dinh dưỡng ở trẻ em, đồng thời đã tiến hành sản xuất đại trà. Đây là một đóng góp rất thiết thực và kịp thời trong việc phòng chống suy dinh dưỡng ở nước ta. 1.1.2. Công nghệ sản xuất enzyme trên thế giới. Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%) [4]. 1.2. Tổng quan về enzyme Protease. SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 3 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô 1.2.1. Giới thiệu chung. Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-) n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin. Hình 1.1. Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa .) và động vật (gan, dạ dày bê .). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 4 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme Protease. 1.2.2. Phân loại Protease Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) . SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 5 Peptidase (Protease) (E.C.3.4) Exopeptidase (E.C. 3.4.11-17) Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) Aminopeptidase Carboxypeptidase Serine proteinase Cystein proteinase Aspartic proteinase Metallo proteinase Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Hình 1.3. Sơ đồ phân loại protease Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase. * Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại: + Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide. + Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide. * Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: + Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. + Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. + Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 6 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. + Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: - Protease acid: pH 2-4 - Protease trung tính: pH 7-8 - Protease kiềm: pH 9-11 SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 7 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Chương 2: NGUỒN THU NHẬN ENZYM PROTEASE 2.1. Nguồn động vật: - Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều enzyme nhất. - Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm Protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat. Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca 2+. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiểm pepxin (trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì. Khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi. Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus. 2.2. Nguồn thực vật: Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein. Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hoá. Ficin thu được từ nhựa cây cọ (Ficus carica). Enzyme được sử dụng thuỷ phân protein tự nhiên. SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 8 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Hình 2.1. Nguồn thu enzyme Protease từ thực vật 2.3. Nguồn vi sinh vật: Enzyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số và một số loại nấm men. Vi khuẩn Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng [6]. Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein [6]. Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998). Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 9 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Hình 2.2. Clostridium Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12 . SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 10 [...]... loại enzyme nhất định cần thiết nào đó SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 13 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Chương 3: THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH ENZYM PROTEASE TỪ VI SINH VẬT VÀ THỰC VẬT 3.1 Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh vật Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn Quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm các giai đoạn chủ yếu Tuyển chọn và. .. thịt và tăng hương vị thịt (ngâm thịt vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định- phương pháp này phổ biến và thu n lợi nhất; Tẩm hỗn hợp làm mềm thịt (enzyme, muối, bột ngọt) Tiêm dung dịch enzyme vào thịt; tiêm dung dịch enzyme vào con vật trước khi giết mổ) Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces fradiae tách được chế phẩm keratineza thu phân được keratin rất có giá trị để sản... Xô Chương 4: ỨNG DỤNG ENZYM PROTEASE Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp… Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương... cao, hiệu suất cao, dễ dàng sử dụng ở quy mô lớn và đặc biệt polymer được tái sử dụng SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 32 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Sự phân tách đạt hiệu quả cao tùy thu c vào các thông số như khối lượng phân tử và điện tích của đối tượng nghiên cứu, nồng độ và khối lượng phân tử của các polymer, nhiệt độ, pH, thời gian, lực ion của hỗn hợp và sự hiện diện của các loại muối đa... enzyme được tiếp tục làm sạch bằng phương pháp sắc ký cột - Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - gel filtration) Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng và phân tử lượng của enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra Để đảm bảo cho việc tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein enzyme Chất này cũng không hòa tan và. .. vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng Vì nếu như trong... nitơ hữu cơ hoạt lực protease và amylaza cũng thấp hơn trong môi trường đối chứng (NH4)2HPO4 và nước chiết đậu tương Đối với xạ khuẩn ưa nhiệt Actynomyces Vulgaris U2 thì pepton là chất cảm ứng để sinh tổng hợp enzyme protease là tốt nhất Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme bằng vi sinh vật Glyxin, alanin, metionin và lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của chủng đột... tổng hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bao điều kiện vệ sinh, vô trùng Tuy nhiên do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp nên khi tách thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thương lớn 3.1.6 Tách và làm sạch chế phẩm enzyme. .. Nếu dùng axit để thu phân sẽ mất đi hoàn toàn các axit amin chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm để thu phân sẽ bị raxemic hoá (chuyển dạng L sang D làm giảm giá trị sinh học của axit amin) Để thu phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng, muốn vậy người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài:... Thu nhận, xử lý, làm sạch, phân loại và bảo quản hạt Rửa, sát trùng và ngâm hạt Ươm mầm ta sẽ thu được malt tươi Sấy malt tươi Xử lý và bảo quản malt khô SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 33 Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô Hoạt tính proteaza trong hạt ban đầu không đáng kể nhưng khi nảy mầm đã tăng lên 4÷8 lần, tăng nhanh hơn hoạt tinh amylaza và đạt cực đại vào khoảng ngày nảy mầm thứ 5 Sự thu . Chương 3: THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH ENZYM PROTEASE TỪ VI SINH VẬT VÀ THỰC VẬT 3.1. Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh vật. Nguồn thu protease. nhiều protease cũng có khả năng thu phân liên kết este và vận chuyển axit amin. Hình 1.1. Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein. Protease