Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi a. Phương pháp cấy truyền: Phương pháp này thường được ứng dụng với các sợi nấm có bào tử. Các chủng nấm sợi được nuôi trên môi trường thạch thích hợp và để cho sợi nấm phát triển đến mức độ cực đại, sau đó là quá trình hình thành bào tử, các ống giống này sẽ được bảo quản theo các cách khác nhau: - Các ống thạch được để trong tủ lạnh (4-7 O C). - Bảo quản trong thạch dưới lớp dầu: Các ống thạch được bảo quản dưới lớp dầu parafin có tỷ trọng tương đối là 0.83- 0.89 đã được khử trùng ở nhiệt độ 121 O C trong 15 phút. Lớp dầu cách bề mặt thạch khoảng 1 cm. Nhiệt độ bảo quản là 15-20 O C. - Bảo quản trong nước, nấm sợi được nuôi trên môi trường thạch đĩa. Sau khi sợi phát triển cực đại thì cắt thành từng miếng nhỏ kích thước khoảng 6 mm 2 và cho vào lọ nước đã thanh trùng. Bảo quản tại nhiệt độ phòng. b. Bảo quản nấm sợi có bào tử trong silicagel: Chuẩn bị: 1, Lọ đựng silicagel (10-15ml) có nắp chịu nhiệt (sắt hay nhựa) thanh trùng ở nhiệt độ 170 O C trong 3 giờ. 2, Silicagel: Loại trong suốt, không có màu, kích thước và số lượng hạt silicagel đưa vào không quá 1/3 thể tích của lọ, thanh trùng ở nhiệt độ 170 ° C trong 3 giờ. 3, Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115 O C/20 phút). 4, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng, môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày). Cách tiến hành: 1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau). 2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào lọ đựng silicagel. Chú ý silicagel hút nước và sinh nhiệt do đó việc đưa dịch bào tử vào phải được thực hiện trong chậu nước đá. Lượng dịch bào tử đưa vào không vượt quá 1/3 thể tích hạt silicagel trong lọ. Sau đó dùng tay lắc đều đảm bảo các hạt silicagel đều dính dịch bào tử nấm sợi. Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp 3, Lọ silicagel được đậy nắp cẩn thận nhưng không vặn chặt (nới 1,5 vòng) sau đó giữ trong bình hút ẩm (độ ẩm 35-40%), 25 O C trong 1 tuần. Vặn chặt nút và quấn giấy parafil giữ trong 4 O C. Kiểm tra độ sống sót sau khi bảo quản: Mẫu silicagel ở 4 ° C, dùng que cấy vô trùng lấy ra 3 hạt silicagel để trên mặt thạch môi trường mầm thóc (Maltagar), lắc đều cho hạt silicagel tiếp xúc lên mặt môi trường. Để ở nhiệt độ thích hợp, kiểm tra tra khuẩn lạc nấm theo thời gian thích hợp. c. Bảo quản nấm sợi có bào tử theo phương pháp đông khô (freez- drying): Chuẩn bị: 1, Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng 170 O C trong 3 giờ. 2, Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115 O C/20 phút). 3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày). Cách tiến hành: 1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa thanh trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau). 2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 - 0,3 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng. Dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như mã số chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp. Sau đó đậy bằng nút bông hay giấy bạc. 3, Giữ ở -80 ° C trong 3 giờ trước khi tiến hành đông khô, đồng thời bật máy Dura-Stop, khi nhiệt độ đạt -40 O C, đưa mẫu vào tủ đông khô của Dura-Stop, bật máy Dura-Dry, khi mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -55 O C, tăng nhiệt độ Dura-Stop lên -5 O C, để qua đêm. 4, Tăng nhiệt độ Dura-Stop lên 25 ° C, khi đạt nhiệt độ cần thiết, tắt máy hút chân không nhưng không tắt Dura-Dry. 5, Tắt Dura-Stop, lần lượt nối tube mẫu vào hệ thống manifold, bật máy Dura-Dry, tiến hành hàn ống khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55 O C. Chú ý: Trong trường hợp chỉ dùng Dura-Dry có thể được thực hiện như sau: - Tiến hành các bước 1,2,3,4 như trên. - Mẫu được để tiền đông khô ở -80 ° C trong 3 giờ. Bật máy Dura-Dry, khi đạt nhiệt độ -60 o C đến -55 o C, độ chân không 45 minitor, gắn ống mẫu với hệ thống manifold tiến hành hàn ống khi độ chân không đạt 45- 48 minitor, nhiệt độ -55 o C. Kiểm tra độ sống sót sau khi đông khô: 1, Mở ống đông khô bằng cách đốt nóng đầu hàn trên đèn cồn và làm lạnh đột ngột bằng cồn đốt. 2, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 1ml nước cất vô trùng từ ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất vô trùng làm tan đều mẫu đông khô. Hút toàn bộ dịch huyền phù sang ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất. Trộn đều và nhỏ vào 3 vị trí khác nhau (mỗi vị trí 3 giọt) trên môi trường thạch đĩa thích hợp và nghiêng cho dịch chảy đều dọc theo một hướng như hình vẽ: 3, Sau đó đậy nắp đĩa, bao quanh bằng parafil và để ở nhiệt độ thích hợp. 4, Cách đánh giá: Rất tốt: ≥ 100 khuẩn lạc. Khá: 50 – 100 khuẩn lạc. Trung bình: 10-50 khuẩn lạc. Kém: < 10 khuẩn lạc. Không mọc. Bảo quản được thực hiện với các mẫu từ khá trở lên. Tuy nhiên, có một số nấm sợi mà khuẩn lạc mọc tràn lan thì có thể đánh giá như sau: Nếu các khuẩn lạc mọc đều khắp trên bề mặt đĩa là tốt. Mẻ đông khô là thành công nếu như số khuẩn lạc mọc chiếm ít nhất là nửa bề mặt môi trường trong đĩa petri. Các mẫu có số lượng khuẩn lạc mọc dưới mức trên phải làm tăng mật độ bào tử trước khi đông khô như thay đổi môi trường sinh bào tử, hoặc chuẩn bị dịch huyền phù bào tử từ 3-4 ống nghiệm bào tử nấm sợi. d. Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp đông khô trực tiếp: Phương pháp đông khô trực tiếp thực hiện tương tự như phương pháp đông khô đã trình bày ở trên và được thực hiện như sau: Chuẩn bị: 1, Ống đông khô rửa sạch (sonic cleaner) trong 15 phút sau đó khử trùng 170 o C trong 3 giờ. 2, Môi trường L-drying chuẩn có thành phần như sau: Đệm phosphat: 0.1M : 100 ml. Monosodium glutamat: 3 g Adonitol: 1.5 g. (Khử trùng ở 115 o C/20 phút). 3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo từng chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác nhau (10-15 ngày). Cách tiến hành: 1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml môi trường đã thanh trùng ở trên cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử nấm có mật độ cao nhất (đối với một số chủng có số lượng bào tử thấp thì có thể tạo dịch bào tử từ một vài ống thạch bào tử khác nhau). 2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho mỗi chủng, dán nhãn, ghi các thông tin cần thiết như số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường và nhiệt độ thích hợp. Sau đó đậy bằng nút bông hay giấy bạc. 3, Đồng thời bật máy Dura-Dry, khi mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -75 o C, lần lượt nối ampoule mẫu vào hệ thống manifold (chú ý khoá van chân không khi nối ampoule mẫu với tube manifold sau đó lại mở ra, để đảm bảo độ chân không cần thiết khi làm đông khô phải lần lượt đưa mẫu vào khi tín hiệu đèn chỉ thị cho phép). Khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55 o C tiến hành quá trình làm khô trong 3 giờ. 4, Hàn kín ampoule mẫu: Khi máy cô Dura-Dry đang chạy để đảm bảo độ chân không cần thiết, lần lượt khoá van cho từng ampoule mẫu và tiến hành hàn với các mẫu này tại vị trí ống bị thắt. Dùng ngọn lửa gas để đốt nóng phần ống thắt cho đều các phía và xoay đều cho thuỷ tinh chảy bịt kín ống. Sau đó dùng ngọn lửa gas để cắt rời phần trên (nối với manifold) và phần dưới chứa mẫu. Hết đợt lại khoá các van của các ampoule mẫu tiếp theo và hàn lần lượt như trên. Kiểm tra chất lượng ngay sau khi bảo quản: - Để kiểm tra độ sống sót của mẫu nấm sợi bảo quản, có thể thực hiện theo cách đã được mô tả ở phần đông khô. - Kiểm tra độ thuần chủng: các mẫu được cấy trên môi trường thích hợp và quan sát hình thái và các đặc điểm sinh học đặc trưng cần thiết để đánh giá khả năng tạp nhiễm và đặc tính sinh học. - Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: các mẫu sau đông khô trực tiếp được giữ ở 37 o C trong 2 tuần. Độ sống sót của mẫu bảo quản giảm trong 2 tuần ở 37 o C tương đương với bảo quản 10 năm ở 4 o C. e. Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp lạnh sâu -80 o C và nitơ lỏng (-196 o C): Chuẩn bị: 1, Chuẩn bị dung dịch glycerol 10% (3 ml trong ống nghiệm) khử trùng ở 121 o C trong 15 phút. Ống nhựa nút xoáy (2 ml), rửa sạch trong sonic cleaner, khử trùng ở 170 o C trong 3 giờ. 2, Chuẩn bị mẫu nấm sợi trên môi trường thạch đĩa có lượng bào tử lớn. Cách tiến hành: 1, Dùng pipet pasteur hút khoảng 0,3 ml glycerol đã thanh trùng vào ống nhựa đựng mẫu. Sau đó dùng dao vô trùng cắt lấy 1 miếng nhỏ môi trường chứa cả sợi và bào tử nấm sợi cho vào ống nhựa. Lượng glycerol đủ để phủ lên miếng thạch mẫu, đậy nút và bao băng parafil sau đó dán nhãn. 2, Mẫu trước tiên phải để ở 5 o C (tạo điều kiện cho glycerol đi vào tế bào), sau đó được làm lạnh sâu tử 25 o C xuống -55 o C với tốc độ -1 o C/phút. Trong trường hợp không có thiết bị làm lạnh thì có thể để -20 o C trong 3 giờ, sau đó chuyển sang -80 o C hay nitơ lỏng (-196 o C). Chú ý: Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu thích hợp với hầu hết các nấm sợi sinh bào tử và tế bào có vách ngăn. Nhưng phương pháp này tỏ ra không thích hợp với các nấm sợi không sinh bào tử và không có vách ngăn. Trong trường hợp này cần nuôi cấy nấm sợi trên môi trường thích hợp để tạo bào tử. Nếu không khắc phục được thì phải tiến hành nuôi trên môi trường dịch thể để thu lấy sinh khối và giữ trong glycerol 10% như trên. [...]... 5.4 Phương pháp bảo quản nấm men: Tương tự như nấm sợi, có nhiều phương pháp bảo quản nấm men Chúng tôi chỉ đề cập đến các phương pháp thông dụng nhất đang được sử dụng tại các bộ sưu tập nấm men lớn trên thế giới a Phương pháp cấy truyền: Cấy truyền là phương pháp đơn giản, nhanh và rẻ tiền cũng như thông dụng nhất, tuy nhiên những hạn chế của phương pháp này là dễ tạp nhiễm cũng như những thay đổi các. .. pháp này giống có thời gian sống lâu hơn phương pháp cấy truyền dịch thể, thông thường giống được bảo quản từ 3-6 tháng Thời gian bảo quản có thể được kéo dài từ 2-3 năm nếu như các ống giống được bảo quản trong dầu parafil đã thanh trùng và được đổ lên trên môi trường thạch sao cho tạo một lớp dày khoảng 1cm b Phương pháp bảo quản trong lạnh sâu và đông khô (xem phần các phương pháp dùng cho bảo quản. .. trạng di truyền sẽ là bất lợi khi bảo quản theo phương pháp này Cấy truyền trên môi trường dịch thể: - Cách tiến hành rất đơn giản là chuẩn bị 10 ml môi trường nuôi cấy nấm men (thông thường là môi trường YM Yeast extract – Maltose) trong lọ McCartney khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút Thường làm 2 lọ cho mỗi chủng bảo quản - Một vòng que cấy chủng nấm men bảo quản được đưa vào môi trường bằng... Nói chung các môi trường có thành phần dinh dưỡng nghèo thì thường cho lượng bào tử lớn - Tránh nhiễm tạp các con mạt (mite), các chủng nấm sợi lưu giữ thường bị mạt phá hoại Đầu tiên chúng ăn chủng giống và làm hỏng, sau đó gây tạp nhiễm do mang bào tử và vi khuẩn trên cơ thể từ ống này sang ống khác Vì lý do trên mà cần có biện pháp hạn chế mạt, thông thường các chủng giống phải được bảo quản ở nơi... cần lấy cả sợi nấm để đưa vào môi trường thạch đĩa Một số điều chú ý đối với bảo quản nấm sợi: - Ảnh hưởng của ánh sáng với quá trình hình thành bào tử: Phần lớn trường hợp thì sự thành công của phương pháp bảo quản phụ thuộc vào số lượng bào tử Ánh sáng là một tác nhân quan trọng đối với quá trình hình thành bào tử của nấm sợi, ánh sáng có bước sóng ngắn có tác dụng kích thích quá trình hình thành bào... chủng bảo quản - Sau đó các mẫu được giữ ở 4oC - Thông thường theo cách này thời gian bảo quản các chủng thường thay đổi từ 2- 6 tháng Cấy truyền trên môi trường thạch: Cấy truyền trên môi trường thạch tương tự như môi trường dịch thể nhưng ở đây môi trường được bổ sung thạch (1.6%) Giống sau khi cấy được giữ trong 72 giờ ở nhiệt độ thích hợp để đạt độ phát triển cần thiết, sau đó được để ở 4-8oC Theo phương. .. mẫu bảo quản: 1, Làm tan mẫu (mẫu lấy từ tủ lạnh sâu -80oC hoặc nitơ lỏng -196oC) trong bể ổn nhiệt 37oC trong 2 phút 2, Dùng que cấy lấy các miếng môi trường thạch đặt vào 3 vị trí khác nhau trên môi trường thạch đĩa thích hợp Để ở nhiệt độ thích hợp và xem khả năng mọc sau thời gian thích hợp (2-4 ngày) Chú ý khi lấy mẫu cần lấy cả sợi nấm để đưa vào môi trường thạch đĩa Một số điều chú ý đối với bảo . Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi a. Phương pháp cấy truyền: Phương pháp này thường được ứng dụng với các sợi nấm có bào tử. Các chủng nấm sợi được nuôi trên. biện pháp hạn chế mạt, thông thường các chủng giống phải được bảo quản ở nơi sạch, nhiệt độ 4-8 o C. 5.4. Phương pháp bảo quản nấm men: Tương tự như nấm sợi, có nhiều phương pháp bảo quản nấm. Chú ý: Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu thích hợp với hầu hết các nấm sợi sinh bào tử và tế bào có vách ngăn. Nhưng phương pháp này tỏ ra không thích hợp với các nấm sợi không sinh