BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN THÚY HỒNG SO SÁNH HIỆU QUẢ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CHỐNG LẠI ĐỘC TỐ UỐN VÁN CỦA NGỰA KHI PHA KHÁNG NGUYÊN VỚI TÁ CHẤT MONTANIDE ISA 50 V2 VÀ MONTANIDE GEL PET A ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÁN BỘ HƯƠNG DẪN: TS. VŨ NGỌC BỘI TS. LÊ VĂN BÉ Nha Trang 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN THÚY HỒNG SO SÁNH HIỆU QUẢ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CHỐNG LẠI ĐỘC TỐ UỐN VÁN CỦA NGỰA KHI PHA KHÁNG NGUYÊN VỚI TÁ CHẤT MONTANIDE ISA 50 V2 VÀ MONTANIDE GEL PET A ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số sinh viên : 4913044026 Lớp : 49SH Cán bộ hướng dẫn : TS. Vũ Ngọc Bội TS. Lê Văn Bé Nha Trang – 2011 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Đồ án này Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, TS. Lê Văn Bé - Giám đốc Viện Vaccine Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Xin cám ơn: ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Viện Vaccine Nha Trang đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc Số: QĐ/ĐHNT Nha Trang, ngày 12 tháng 03 năm 2011 HIỆU TRƯỞNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG - Căn cứ Quy chế về tổ chức đào tạo, kiểm tra, thi và công nhận tốt nghiệp Đại học và Cao đẳng hệ Chính quy ban hành theo Quyết định số 04/1999/QĐ-BGD&ĐT ngày 11/02/1999 của Bộ trưởng Bộ Giáo dục & Đào tạo; - Căn cứ Quy định của Trường Đại học Nha Trang về công tác tốt nghiệp. QUYẾT ĐỊNH Điều 1: Nay giao cho sinh viên: Trần Thúy Hồng MSSV: 4913044026 Khoá: 49 Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Đồ án tốt nghiệp: So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch chống lại độc tố uốn ván của ngựa khi pha kháng nguyên với tá chất Montanide ISA 50 V2 và Montanide GEL PET A Nội dung thực hiện: 1) So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch ở ngựa đối với hai loại tá chất pha kháng nguyên là Montanide ISA 50V2 và Montanide Gel Pet A. 2) Đề xuất quy trình gây miễn dịch ngựa bằng kháng nguyên giải độc tố uốn ván tinh chế với loại tá chất cho hiệu giá kháng thể cao. Nơi thực hiện: Viện Vaccine Nha Trang Thời gian thực hiện: Từ ngày 02 /03 /2011 đến ngày 16 / 06/ 2011. Hoàn thành và nộp Báo cáo trước ngày: 10 / 07/ 2011 cho Cán bộ hướng dẫn. Điều 2: Ông: TS. Vũ Ngọc Bội và TS. Lê Văn Bé Có trách nhiệm hướng dẫn sinh viên thực hiện Đồ án Tốt nghiệp theo Quy chế của Bộ và theo Quy định số 120 TB/ĐT ngày 15/3/2001 của Hiệu trưởng về việc thực hiện công tác tốt nghiệp. Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học có trách nhiệm theo dõi, kiểm tra việc thực hiện công tác tốt nghiệp của SV do Khoa giao cho Bộ môn quản lý và định kỳ báo cáo về Trưởng Khoa. Điều 3: Sinh viên Trần Thúy Hồng phải nghiêm chỉnh chấp hành Nội quy, Quy định của Trường và nơi thực tập, khắc phục khó khăn để hoàn thành Đồ án tốt nghiệp được giao. TL.HIỆU TRƯỞNG Phó Giám đốc Viện i Mục lục Trang PHẦN I. MỞ ĐẦU 6 PHẦN II. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 8 2.1. Bệnh uốn ván 8 2.1.1. Lịch sử phát hiện nguyên nhân gây bệnh uốn ván 8 2.1.2. Vi khuẩn uốn ván 8 2.1.3 Đặc điểm bệnh học: 11 2.1.4 Đặc điểm dịch tễ học 14 2.2.1. Miễn dịch tự nhiên 15 2.2.2. Miễn dịch chủ động 15 2.2.3. Miễn dịch thụ động 17 2.3. Huyết thanh 17 2.3.2. Thành phần hoá học của huyết thanh 18 2.3.3. Kháng thể 21 2.3.4. Huyết thanh phòng và chữa bệnh 23 2.4. Tá chất gây miễn dịch 24 2.4.1. Khái niệm tá chất 24 2.4.2. Cơ chế hoạt động của tá chất 25 2.4.3. Vai trò của tá chất 25 2.4.4. Tính an toàn của tá chất 26 2.4.5. Các loại tá chất thông dụng 26 2.5. Tá chất Montanide ISA 50 V2 29 2.5.2. Những tính chất của MONTANIDE TM ISA 50V2 30 ii 2.5.3. Tính chất tạo nhũ dịch 31 2.5.4. Các thử nghiệm về độc tính 31 2.5.5. Số liệu về công hiệu 32 2.5.6. Cơ chế và tính ưu việt của Montanide ISA 33 2.6. Tá chất Montanide Gel Pet A 35 2.6.2. Đáp ứng miễn dịch 36 2.6.3. Montanide Gel Pet A tá chất trùng hợp mới để sản xuất vacxin ngựa 37 2.6.4. Tính ưu việt của Montanide Gel Pet A 37 2.7. Sản xuất huyết thanh kháng độc tố uốn ván có nguồn gốc súc vật 37 2.7.1. Sản xuất kháng nguyên để gây miễn dịch 38 2.7.2. Miễn dịch súc vật sản xuất huyết thanh kháng độc tố uốn ván 40 2.7.2.1. Cơ chế miễn dịch của cơ thể súc vật 40 2.7.2.2. Súc vật để gây miễn dịch 42 2.7.2.3. Tiêu chuẩn ngựa sản xuất huyết thanh 43 2.7.2.4. Chăm sóc ngựa 44 2.7.2.5. Miễn dịch 44 PHẦN III. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49 3.1. Vật liệu 49 3.1.2. Nguyên vật liệu 50 3.2. Phương pháp nghiên cứu 51 3.2.1. Bố trí thí nghiệm 51 Bảng 3.1. Phác đồ tiêm miễn dịch cho lô thí nghiệm A 52 Bảng 3.2. Phác đồ tiêm miễn dịch cho lô ngựa thí nghiệm B 54 3.2.3. Kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phương pháp lên bông 56 3.2.3.1. Nguyên tắc 56 iii 3.2.3.2. Tiến hành 56 3.2.4. Xử lý số liệu kết quả 57 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58 4.1 Kết quả hiệu giá kháng thể kháng uốn ván đối với nhóm ngựa A sử dụng tá chất Montanide ISA 50V2. 58 4.2 Kết quả hiệu giá kháng thể kháng uốn ván đối với nhóm ngựa B sử dụng tá chất Montanide GEL PET A 59 4.3. So sánh đáp ứng miễn dịch kỳ cao độ hai nhóm A và B 60 4.4. So sánh đáp ứng miễn dịch ở chu kỳ 2 của hai nhóm ngựa 63 4.5. So sánh đáp ứng miễn dịch chu kỳ 3 của hai nhóm ngựa 66 4.6. So sánh hiệu giá hai nhóm ngựa A và B qua các chu kỳ khai thác 68 4.7. Sức khỏe ngựa sau 3 chu kỳ khai thác 72 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 75 5.1. Kết luận 75 5.2. Đề nghị 75 Tài liệu tham khảo 77 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1.Tính chất vật lý của MONTANIDE ISA 50V2 30 Bảng 2.2.Tính chất hoá học của MONTANIDE ISA 50V2 31 Bảng 2.3. Tính chất tạo nhũ dịch của Montanide ISA 50 V2 31 Bảng 2.4. Các thử nghiệm độc tính của Montanide ISA 50 V2 32 Bảng 2.5 Những tính chất của Montanide Gel Pet A 36 Bảng 3.1. Phác đồ tiêm miễn dịch cho lô thí nghiệm A 52 Bảng 3.2. Phác đồ tiêm miễn dịch cho lô ngựa thí nghiệm B 54 Bảng 4.1. Kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ cao độ 61 Bảng 4.2. Kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ 2 63 Bảng 4.3. Kết quả đáp ứng miễn dịch chu kỳ 3 67 Bảng 4.4. Hiệu giá trung bình của ba lần khai thác huyết thanh thô 69 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Trực khuẩn uốn ván 9 Hình 2.2 Sơ đồ cấu tạo phân tử IgG và vị trí cắt của enzym Papain và Pepsin 22 Hình 2.3. Thành phần và các dạng nhũ dịch của tá chất Montanide ISA 50V2 21 Hình 2.4 Quá trình giải phóng kháng nguyên của một số tá chất khác nhau theo thời gian 34 Hình 3. Sơ đồ tiêm miễn dịch và khai thác dùng cho hai lô ngựa A và B52 Hình 4.1 Biến động hiệu giá kháng thể chống độc tố uốn ván trong máu ngựa được tối miễn dịch bằng vacxin với tá chất Montanide ISA 50V2 (lô A).58 Hình 4.2 Biến động hiệu giá kháng thể chống độc tố uốn ván trong máu ngựa được tối miễn dịch bằng vacxin với tá chất Montanide Gel Pet A (lô B).60 Hình 4.3. Đồ thị diễn biến đáp ứng miễn dịch cao độ của hai lô ngựa 62 Hình 4.4. Đồ thị diễn biến đáp ứng miễn dịch nhắc lại ở chu kỳ 2 của lô ngựa 65 Hình 4.5. Đồ thị diễn biến đáp ứng miễn dịch nhắc lại chu kỳ 3 ở hai lô ngựa 68 Hình 4.6. Diễn biến đáp ứng miễn dịch của 2 lô ISA 50 V2 (lô A) và Gel Pet A (lô B) ở 3 chu kỳ 72 Hình 4.7.1 Ngựa lô thí nghiệm A 73 Hình 4.7.2 Ngựa lô thí nghiệm B 60 6 MỞ ĐẦU Ngày nay uốn ván vẫn còn là bệnh gây tử vong không ít đối với các nước kém phát triển và các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam. Trên thế giới, tỷ lệ mắc bệnh uốn ván dẫn đến tử vong còn cao. Nhờ những công trình nghiên cứu phòng và điều trị uốn ván, nhất là chương trình tiêm phòng uốn ván cho trẻ em và phụ nữ mang thai được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) phát động đã làm giảm tỷ lệ tử vong bệnh uốn ván xuống 30 - 48%. Tuy nhiên các đối tượng khác như người già và người trung niên chưa được tiêm phòng uốn ván, hay có tiêm phòng nhưng chưa tiêm nhắc lại rất lớn, đã làm cho hiệu quả của việc miễn dịch chủ động bằng cách tiêm phòng vacxin uốn ván còn hạn chế. Vì vậy tiêm huyết thanh kháng độc tố uốn ván (SAT) vẫn là cách điều trị dự phòng hữu hiệu. Tiêm kháng huyết thanh là biện pháp miễn dịch thụ động được dùng để trung hoà lại độc tố của vi khuẩn uốn ván nhằm điều trị bệnh này. Ngày nay nhu cầu về huyết thanh uốn ván tăng lên do sự chủ quan trong phòng bệnh và tình trạng tai nạn giao thông tăng lên rất nhiều nên số lượng người có nguy cơ mắc uốn ván cũng tăng theo. Vì vậy nghiên cứu ra quy trình gây miễn dịch để sản xuất huyết thanh có hiệu giá cao là vấn đề rất cần thiết. Bên cạnh đó vấn đề an toàn cho sức khoẻ của ngựa sản xuất huyết thanh cũng được quan tâm. Viện Vacxin và Sinh phẩm y tế Nha Trang đã và đang áp dụng quy trình miễn dịch ngựa, cải tiến phương pháp sản xuất huyết thanh kháng uốn ván, tiến tới nâng cao sản lượng và chất lượng kháng huyết thanh miễn dịch, đồng thời giảm giá thành sản phẩm. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch chống lại độc tố uốn ván của ngựa khi pha kháng nguyên với tá chất Montanide ISA 50 V2 và Montanide GEL PET A’’. [...]... dung c a đồ án 3) So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch ở ng a đối với hai loại tá chất pha kháng nguyên là Montanide ISA 5 0V2 và Montanide Gel Pet A 4) Đề xuất quy trình gây miễn dịch ng a bằng kháng nguyên giải độc tố uốn ván tinh chế với loại tá chất cho hiệu giá kháng thể cao Do thời gian và kinh phí có hạn nên báo cáo này chắc hẳn sẽ còn c ó các hạn chế, em kính mong nhận được các ý kiến góp ý c a quý... trong tá chất Freund được phát triển như Montanide 80, Montanide ISA 51, ISA 720 và ISA 724… 1.5 TÁ CHẤT MONTANIDE ISA 50 V2 Montanide ISA là loại tá chất dạng nước trong dầu (W/O – 50 thể tích nước /50 thể tích đầu) Thành phần c a nó bao gồm dầu khoáng, mannitol và acid oleic tinh chế có nguồn gốc thực vật Dạng nhũ dịch W/O c a Montanide ISA 50 V2 được thể hiện qua hình vẽ sau: 30 Hình 1.3 Thành phần và. .. Thành phần và các dạng nhũ dịch c a tá chất Montanide ISA 50 V2 * Những tính chất c a MONTANIDE TM ISA 5 0V2 Các tính chất vật lý và h a học c a MONTANIDE ISA 5 0V2 được trình bày ở bảng 1.1 và 1.2 dưới đây Bảng 1.1 Tính chất vật lý c a MONTANIDE ISA 5 0V2 Hình thái Dịch màu vàng sáng Nhận dạng Tương ứng với vùng dưới phổ đỏ Độ nhớt (Brookfield LVF, S2) Xấp xỉ 18 mPa/s (tại 250C) Trọng lượng riêng (tại... Ramon tá chất là những chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu c a cơ thể, làm tăng khả năng tổng hợp kháng thể c a cơ thể chống lại một số mầm gây bệnh Tá chất khi phối hợp với kháng nguyên đặc hiệu tiêm cho cơ thể thì tá chất sẽ làm tăng mức độ miễn dịch c a cơ thể cao hơn khi chỉ tiêm kháng nguyên đơn độc Người ta ứng dụng tá chất trong lĩnh vực sản xuất vacxin để tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh và. .. công hiệu Montanide ISA 5 0V2 đã được sử dụng thành công trong một số công thức như là vacxin FMD, vacxin Pasteurella multocida, vacxin ký sinh trùng Tick, vacxin cowdriosis, - Đáp ứng trên chuột: Các nhóm chuột gồm 10 con cho một nhóm được tiêm miễn dịch với BSA (10 µg) hỗn hợp với Montanide ISA 50V, Al(OH)3, hay không có tá chất Montanide ISA 50V làm tăng đáp ứng kháng thể IgG1 cao và thời gian đáp ứng. .. người ta phân biệt: - Huyết thanh kháng độc tố: huyết thanh động vật đã được tiêm độc tố vi khuẩn như huyết thanh chống bạch hầu (SAD), chống uốn ván (SAT) - Huyết thanh kháng virus: huyết thanh động vật đã được miễn dịch đối với virus dại dùng để chống bệnh dại (SAR), huyết thanh kháng virus viêm gan B… - Huyết thanh kháng nọc độc: huyết thanh c a động vật đã được tiêm nọc độc đã làm giảm độc c a những... năm 1992 nên hiện nay tỷ lệ mắc uốn ván đã giảm rõ rệt Khi xâm nhập vào cơ thể chúng sinh ra độc tố mạnh và độc tố này xâm nhập vào các phần khác trên cơ thể Khi xâm nhập vào đường tiêu h a, trực khuẩn bị phá hủy bởi acide dạ dày do đó không gây bệnh theo đường tiêu h a * Tính chất sinh h a c a độc tố uốn ván: Tác nhân dẫn đến tử vong chính là độc tố uốn ván Độc tố uốn ván có tính độc rất mạnh, liều... là kháng nguyên c a chúng (kể cả các loại độc tố) và giải độc tố (toxoid),… được gọi là miễn dịch chủ động Miễn dịch chủ động có được sau khi bị cảm nhiễm gọi là miễn dịch chủ động tự nhiên, các trường hợp tạo miễn dịch do con người đ a kháng nguyên hay mầm bệnh vào cơ thể (tiêm vacxin) gọi là miễn dịch chủ động nhân tạo Tế bào ký chủ có được miễn dịch chủ động sau khi tiếp cận với kháng nguyên và. .. hơn phosphate nhôm Do đó, một dạng pha chế đặc biệt c a hydroxyt nhôm (Alhydrogel) đã được khuyến cáo dùng như một tá chất chuẩn  Ưu điểm c a tá chất nhôm: - Ưu điểm chính c a việc sử dụng tá chất nhôm là tính an toàn đã được ghi nhận qua hàng tỷ liều vacxin và sự hình thành kháng thể sớm hơn, cao hơn và kéo dài hơn sau khi miễn dịch sơ cấp so với các dạng vacxin không sử dụng tá chất tương ứng đặc... độc c a những loài có nọc độc, chẳng hạn như nọc rắn (SAV) - Huyết thanh c a người mới lành bệnh: hiện nay ít dùng Ở Việt Nam, huyết thanh kháng độc tố uốn ván tinh chế được sản xuất duy nhất tại Viện vacxin Nha Trang theo phương pháp c a Pope và quy trình c a Lavergne - Pháp (Paris): quy trình IVAC2 -1995 Huyết thanh kháng độc tố uốn ván do Viện vacxin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang sản xuất là một sinh . án tốt nghiệp: So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch chống lại độc tố uốn ván c a ng a khi pha kháng nguyên với tá chất Montanide ISA 50 V2 và Montanide GEL PET A Nội dung thực hiện: 1) So sánh. HỌC NHA TRANG TRẦN THÚY HỒNG SO SÁNH HIỆU QUẢ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CHỐNG LẠI ĐỘC TỐ UỐN VÁN C A NG A KHI PHA KHÁNG NGUYÊN VỚI TÁ CHẤT MONTANIDE ISA 50 V2 VÀ MONTANIDE GEL PET A . Montanide ISA 50 V2 và Montanide GEL PET A ’. 7 Nội dung c a đồ án 3) So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch ở ng a đối với hai loại tá chất pha kháng nguyên là Montanide ISA 5 0V2 và Montanide