i LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô Bộ môn Bệnh học Thủy sản trường Đại học Nha Trang và các bạn đồng nghiệp để tôi thực hiện đề tài. Trước hết tôi xin bài tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô PGS. TS Đỗ Thị Hòa đã tạo điều kiện và cho tôi thực hiện một nội dung nhỏ trong đề tài cấp Bộ của cô. Xin chân thành cảm ơn cô Hứa Thị Ngọc Dung đã hướng dẫn tận tình giúp tôi hoàn thành tốt luận văn. Xin chân thành cảm ơn thầy ThS Trần Vĩ Hích, thầy ThS Phan Văn Út, cô ThS Phạm Thị Hạnh, đã cho tôi lời khuyên quý báo để thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên, giúp đỡ về tinh thần và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành đợt thực tập tốt nghiệp này. Xin gửi lời cảm ơn, chúc sức khỏe và thành công đến tất cả mọi người. Nha Trang, tháng 6 năm 2011 Sinh viên thực hiện LÂM QUANG TUYẾN ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii GIẢI THÍCH CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi LỜI MỞ ĐẦU 1 PHẦN I: TỔNG QUAN 3 1.1. Nuôi tôm thương phẩm ở Việt Nam và thế giới. 3 1.1.1. Nuôi tôm trên Thế giới. 3 1.2. Hội chứng đốm trắng do virus (WSS) ở tôm he. 5 1.2.1. Những nghiên cứu của thế giới về WSS ở tôm chân trắng. 6 1.2.2. Nghiên cứu về hội chứng đốm trắng (WSS) ở tôm biển tại Việt Nam 10 1.3. Dùng các sản phẩm có nguồn gốc thảo dược để phòng bệnh virus và vi khuẩn ở tôm 11 1.3.1. Các công trình nghiên cứu của thế giới 11 1.3.2. Một số công trình nghiên cứu ở Việt Nam 15 1.4. Một số thông tin liên quan tới 2 sản phẩm Fucoidan và diệp Hạ châu 16 1.4.1. Fucoidan. 16 1.4.2. Diệp Hạ Châu 19 Phần 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Địa điểm, thời gian nghiên cứu 22 2.2. Vật liệu nghiên cứu. 22 2.2.1. Mẫu tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei). 23 2.2.2. Các sản phẩm có nguồn gốc thảo dược đã được dùng trong thí nghiệm. 23 2.2.3. Chuẩn bị thức ăn của tôm thí nghiệm. 24 2.2.4. Dụng cụ và thiết bị dùng trong thí nghiệm 24 2.3. Phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm 24 2.4. Phương pháp phân tích mẫu tôm. 27 iii 2.4.1. Phân tích mẫu bằng kỹ thuật PCR. 27 2.4.2. Phương pháp mô học 27 2.4.3. Phương pháp xác định một số yếu tố môi trường 28 2.4.4. Phương pháp xác định sinh trưởng của tôm trong thí nghiệm. 28 2.5. Phương pháp xử lý số liệu. 28 PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 3.1. Kết quả dùng 2 sản phẩm Fucoidan và Diệp Hạ Châu để ngăn chặn sự bùng phát hội chứng chết đỏ do WSSV gây ra ở tôm chân trắng (Litopennaeus vennamei). 30 3.1.1. Kết quả đợt thí nghiệm thứ nhất 30 3.1.1.1. Tỷ lệ chết tích lũy (%) của tôm sau 14 ngày thí nghiệm của đợt I 31 3.1.1.2. Mô tả các dấu hiệu và trạng thái bệnh lý của tôm sau cảm nhiễm. 35 3.1.1.3. Kiểm tra PCR và mô bệnh học các mẫu tôm trước và sau đợt thí nghiệm I 36 3.1.2. Kết quả thí nghiệm đợt thứ II 39 3.1.2.1. Tỷ lệ (%) chết tích lũy trung bình của tôm thí nghiệm trong đợt II. 40 3.1.2.2. Kiểm tra PCR và mô bệnh học các mẫu tôm trước và sau đợt thí nghiệm II. 43 3.2. Kết quả kiểm tra sự ảnh hưởng của Fucoidan và Diệp Hạ Châu lên sự sinh trưởng và tỷ lệ sống của tôm chân trắng trong điều kiện thí nghiệm. 44 3.3. Thảo luận kết quả 46 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 49 4.1 Kết luận 49 4.2. Đề xuất ý kiến. 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 60 iv GIẢI THÍCH CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Ctv: cộng tác viên Cs: cộng sự NT: nghiệm thức ĐC: đối chứng F: Fucoidan D: Diệp Hạ Châu NTTS: Nuôi trồng thủy sản PCR: Nested Polymerase Chain Reaction (PCR) SDS: Sodium Dodecyl Sulphate PBS: Phosphate Buffer Saline S.E: sai số chuẩn TB: trung bình v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Thống kê sản lượng tôm nuôi ở Việt Nam qua các năm (…X 1000 tấn/năm) 5 Bảng 3.1: Tỉ lệ (%) chết tích lũy trung bình của tôm ở các nghiệm thức theo ngày của đợt thí nghiệm I 33 Bảng 3.2. So sánh thống kê về tỷ lệ chết trung bình của tôm ở các nghiệm thức sau khi đã bị cảm nhiễm đợt I (cảm nhiễm vào ngày thứ 8 của thí nghiệm) 34 Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra các mẫu tôm trước và sau thí nghiệm phòng bệnh đợt I 37 Bảng 3.4: Tỉ lệ (%) tôm chết tích lũy trung bình theo ngày ở thí nghiệm đợt II 40 Bảng 3.5. So sánh thống kê về tỷ lệ chết trung bình của tôm ở các nghiệm thức sau khi đã bị cảm nhiễm đợt II. (cảm nhiễm vào ngày thứ 5 của thí nghiệm) 42 Bảng 3.6. Kết quả kiểm tra mẫu tôm đợt thí nghiệm thứ II bằng PCR và mô bệnh học. 43 Bảng 3.7. Khối lượng và chiều dài của tôm trước và sau thí nghiệm 45 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Tổng hợp và ước tính sản lượng tôm nuôi toàn cầu từ 1991-2012. (Anderson J, 2010) [23], [24]. 4 Hình 1.2: Tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) nuôi ở Thái Lan bị nhiễm hội chứng đốm trắng (WSS). 7 Hình 1.3: Dấu hiệu chuyển màu đỏ bầm ở tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) bị hội chứng chết đỏ ở Khánh Hòa 11 Hình 1.4: Một số loài rong mơ ở Việt Nam 18 Hình 1.5: Cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria) 20 Hình 1.6: Sản phẩm Diệp Hạ Châu dạng viên dùng trong y học, để hổ trợ điều trị bệnh viêm gan siêu vi B 21 Hình 2.1: Fucoidan và Diệp Hạ Châu dùng trong thí nghiệm 23 Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm phòng hội chứng chết đỏ ở tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) trong điều kiện thí nghiệm bằng các chế phẩm đã chiết rút từ thảo dược. 25 Hình 3.1. Hình ảnh chụp cơ sở thí nghiệm 30 Hình 3.2. Diễn biến nhiệt độ nước ở đợt thí nghiệm thứ I. 32 Hình 3.3. Diễn biến về tỷ lệ chết tích lũy của tôm ở các nghiệm thức TN đợt I 32 Hình 3.4. Hình ảnh tôm khỏe và tôm sau thí nghiệm phòng bệnh bằng Fucoidan và Diệp hạ Châu: 35 Hình 3.5. Hình ảnh về bệnh lý ở mô và tế bào của tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) 38 Hình 3.7. Tỉ lệ (%) tôm chết tích lũy trung bình theo ngày ở thí nghiệm đợt II 41 Hình 3.8. Các dấu hiệu bệnh lý đã quan sát được ở các con tôm chân trắng hấp hối và chết trong thí nghiệm phòng bệnh đợt II. 42 1 LỜI MỞ ĐẦU Tôm biển là những đối tượng nuôi có gía trị kinh tế rất cao và 75% sản lượng tôm nuôi của thế giới tập trung ở các quốc gia thuộc châu Á. Tôm chân trắng có tên khoa học Litopenaeus vannamei (tên tiếng Anh là pacific white shrimp) là loài tôm có nguồn gốc từ Nam Mỹ, trước năm 2000, được nuôi chủ yếu ở các nước Nam và Trung Mỹ. Những năm gần đây, tôm chân trắng đã được di nhập và nuôi phổ biến ở các nước Nam và Đông Á, như Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam và Indonessia. Đến năm 2008, sản lượng nuôi loài tôm he này đã chạm mức 2.300.000 tấn, chiếm khoảng 65-66% tổng sản lượng tôm nuôi trên toàn thế giới. (FAO, 2007, 2008, 2010). Ở Việt Nam, tôm chân trắng đã được đưa vào nuôi từ năm 2002 và loài tôm này đang có tỷ lệ % ngày một tăng trong sản lượng tôm biển được nuôi của cả nước. Tuy nhiên, cũng như tôm sú, tôm chân trắng nuôi thương phẩm ở Việt Nam đã và đang gặp những khó khăn do bệnh. Theo thông báo của FAO, 2010, sản lượng tôm nuôi ở Việt Nam cũng đã giảm hơn 20% vào năm 2009 so với năm trước đó (2008) do tác hại của bệnh [23], [24]. Trong vài năm gần đây, tôm chân trắng nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa, Phú Yên, Bình Định, Quảng Ngải và Ninh thuận đã chết hàng loạt với dấu hiệu đỏ thân gây thiệt hại không nhỏ cho người nuôi và các địa phương này. Sau hơn 1 năm thực hiện đề tài cấp Bộ với mã số B2010-13-52, nhóm nghiên cứu đã xác định rằng, các mẫu tôm bệnh thu được từ các ao nuôi tôm chân trắng bị hội chứng chết đỏ đã thể hiện dương tính với virus gây bệnh đốm trắng WSSV ở tỷ lệ rất cao (>90% với n = 30 ao) và hoàn toàn âm tính với virus Taura (TSV) bằng kỹ thuật PCR. Kết quả cảm nhiễm dịch lọc 0,2 µm cũng đã chứng minh rằng, khi bị cảm nhiễm WSSV bằng phương pháp tiêm hoặc cho ăn, tôm chân trắng đã bộc lộ dấu hiệu thân tôm chuyển màu đỏ tối rõ ràng, trước khi tôm bệnh xuất hiện dấu hiệu đốm trắng và chết hàng loạt. Một số mẫu tôm bị chết đỏ thu ở ngoài ao nuôi và từ thí nghiệm cảm nhiễm đã được quan sát mô và tế bào dưới kính hiển vi điện tử (TEM) và đã chỉ ra rằng các mẫu tôm này đều đã bị nhiễm một loại virus có hình 2 dạng, cấu tạo và kích thước vi thể tương tự như WSSV: có dạng hình que, có vỏ bao, sao chép trong nhân tế bào [số liệu chưa công bố] Thực tế và kết quả đã nghiên cứu của đề tài mã số B2010-13-52 đã cho ta thấy rằng, hội chứng chết đỏ là một bệnh nguy hiểm ở tôm chân trắng nuôi thương phẩm. Do vậy, đặt vấn đề nghiên cứu các biện pháp khác nhau nhằm ngăn chặn bệnh này bùng phát là cần thiết để giảm thiểu tác hại đối với tôm chân trắng nuôi thương phẩm. Để hoàn thành chương trình đào tạo cử nhân bệnh học học thủy sản, tôi đã được Khoa Nuôi trồng Thủy sản, bộ môn Bệnh học Thủy sản và chủ nhiệm đề tài có mã số B2010-13-52 cho phép thực hiện một nội dung nhỏ trong hướng nghiên cứu này, đó là dùng các sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược để thử nghiệm phòng bệnh chết đỏ ở tôm chân trắng trong điều kiện thí nghiệm. Tên đề tài của luận văn: “ THỬ NGHIỆM PHÒNG HỘI CHỨNG CHẾT ĐỎ Ở TÔM HE CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) BẰNG CÁC SẢN PHẨM ĐÃ CHIẾT RÚT TỪ THẢO DƯỢC TRONG ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM ’’ Các nội dung chính: 1. Đánh giá hiệu quả phòng bệnh chết đỏ ở tôm chân trắng của 2 loại sản phẩm: Fucoidan chiết suất từ rong mơ và Diệp Hạ Châu (dạng cao) được chiết rút từ cây Diệp hạ châu (hay cây Chó đẻ răng cưa) trong điều kiện thí nghiệm. 2. Đánh giá ảnh hưởng của các sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược lên sinh trưởng và tỷ lệ sống của tôm chân trắng trong điều kiện thí nghiệm. Dù bản thân đã rất cố gắng để thực hiện thí nghiệm, xử lý số liệu và viết luận văn, nhưng do lần đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, thời gian nghiên cứu ngắn và kiến thức bản thân còn hạn chế nên luận văn không tránh khỏi các thiếu sót. Rất mong sự giúp đỡ của quý thầy cô cùng các bạn đồng nghiệp để luận văn được hoàn thiện hơn. 3 PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1. Nuôi tôm thương phẩm ở Việt Nam và thế giới. 1.1.1. Nuôi tôm trên Thế giới. Tôm biển là những đối tượng nuôi có gia trị kinh tế rất cao, có thể mang lại hiệu quả kinh tế và xã hội lớn lao ở các quốc gia có nuôi các đối tượng này. Đến năm 2007, 75% sản lượng tôm được nuôi từ các quốc gia châu Á, 25% còn lại được nuôi ở các quốc gia ở bán cầu Tây. Trong đó, Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam và Indonesia là là những nước có sản lượng tôm đứng hàng đầu thế giới. (FAO databases, 2007). Đến năm 2005, sản lượng nuôi tôm thế giới đã đạt tới 2.565.000 tấn và chiếm hơn 11% tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản của thế giới. Trong đó chiếm phần lớn là tôm he chân trắng (Litopenaeus vannamei) với 57% và tôm sú (Penaeus monodon) có sản lượng chiếm 29% tổng sản lượng nuôi tôm trên thế giới. (Fao, 2005). Tổng sản lượng các loại tôm nuôi trên thế giới đã tăng liên tục, mặc dù cũng có năm giảm sút chút ít do tác hại của bệnh. Dựa trên số liệu tổng hợp của FAO, 2010, Anderson. J đã phân tích và dự báo rằng, mặc dù sản lượng tôm nuôi của thế giới vào năm 2010 đã giảm đi 5,1% so với năm 2009, nhưng sẽ tiếp tục tăng lên vào các năm 2011 và 2012. 4 Hình 1.1: Tổng hợp và ước tính sản lượng tôm nuôi toàn cầu từ 1991-2012. (Anderson J, 2010) [23], [24]. Trước năm 2000, tôm sú (Penaeus monodon), tôm he Trung Quốc (P. chinensis), tôm he Ấn Độ (P.indicus) là các loài tôm được nuôi phổ biến ở châu Á, nhưng đến những năm gần đây, loài tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) đã và đang được phát triển nuôi ở nhiều quốc gia châu Á. Theo Wyban.J (2007), khoảng 10 năm gần đây, sản lượng tôm chân trắng nuôi trên toàn thế giới đã tăng lên rất nhanh và đã đạt 2 triệu tấn vào năm 2006. Nếu sản lượng loài tôm này chỉ đạt 25% so với tổng sản lượng tôm nuôi biển vào năm 2000 thì đến năm 2006 đã đạt 75% tổng sản lượng tôm nuôi nước mặn. [65]. Theo phân tích của GAA (Global Aquaculture Alliance) dựa trên số liệu công bố của FAO (2010), sản lượng tôm chân trắng nuôi bắt đầu gia tăng mạnh từ năm 2002 đến 2010, sản lượng nuôi của loài tôm này đã chiếm từ 65-66% tổng sản lượng tôm nuôi trên toàn thế giới (bao gồm cả tôm càng xanh-Macrobranchium [...]... ng trong thí nghi m này là: 1, 2 và 3 g/kg th c ăn tôm -Các s n ph m th o dư c này ư c gi nhi t 4-6oC cho n khi s d ng Hình 2.1: Fucoidan và Di p H Châu dùng trong thí nghi m 24 2.2.3 Chu n b th c ăn c a tôm thí nghi m - Kh u ph n th c ăn c a tôm dùng trong thí nghi m này là 6-8% kh i lư ng thân - Lo i thưc ăn t ng h p A4 c a hãng CP ã ư c s d ng cho thí nghi m này - Các li u thu c dùng trong thí. .. mang tôm chân tr ng nhi m WSSV (Wongmaneeprateep & ctv, 2010), [63], [64] b m 8 Nunan & ctv (1998), ã dùng d ch chi t rút t các con tôm he c p ông ã b c l các d u hi u c a b nh WSSV, ã ư c nh p vào qu c gia này t châu Á, l c qua màng 0,45 µm, r i c m nhi m vào các loài tôm he châu M , k t qu WSS ã xu t hi n và gây tác h i các loài tôm he này [43] Wang & ctv (1999), ã t ch c nghiên c u v thu ư c t các. .. i t l 70-100% trong vòng 7 – 30 ngày, trong khi ó khi b nh này x y ra tôm he n (Penaeus indicus) ã gây ch t d d i hơn, tôm b nh ã ch t 100% trong vòng 3-7 ngày Do v y, các tác gi này cho r ng tôm chân tr ng nuôi m c mãn tính ho c tôm chân tr ng có s c ch u tôm he n Iran ã b b nh ch ng v i WSSV t t hơn so v i [12] M t hư ng nghiên c u khác v h i ch ng m tr ng là xác nh cl cc a WSSV v i các ch ng virus... nghiên c u - Phòng thí nghi m B nh h c th y s n, Trư ng i h c Nha Trang - Tr i th c nghi m ư c thuê khu v c Ba Làng, Nha Trang - Th i gian th c t p t 1/3/2011 – 25/6/2011 Th nghi m phòng h i ch ng ch t tôm chân tr ng (Litopenaeus vannamei) b ng các s n ph m ã chi t rút t th o dư c trong i u ki n thí nghi m Thu m u và ki m tra m u tôm b nh PCR dương tính v i WSSV (+) Tuy n ch n tôm kh e cho thí nghi m... tôm he thành 3 cao hơn c p tính, tôm b nh có màu h ng c a tôm ã b c m nhi m virus nhi m virus t trung bình tôm chân tr ng b , các mô r t cao và tôm b nh có th ch t r t nhanh m c c p tính, các mô c a v t ch ãb c m n cao, tôm b ch t nhi u trong vòng 7-10 ngày và th m tr ng t p trung ch y u giáp hi n tôm b nhi m virus nh , các d u hi u u ng c m tr ng ho c m c mãn tính, th thân có th không xu t hi n, tôm. .. ng, b nh các loài tôm he châu M , m tr ng xu t hi n c bi t là tôm chân tr ng (L vannamei) nuôi các nư c 7 Trung và Nam M vào nh ng năm cu i c a th k 20 là do m t lư ng r t l n tôm ông l nh có ngu n g c t châu Á ã ư c nh p vào các nư c này [45] Theo Sudha & ctv (2003), d a vào các d u hi u b nh lý b nh, ã chia di n bi n c a h i ch ng m c , bao g m: m c m c v i t l cao ch trong 2-3 ngày hi n rõ các m tr... tích m u tôm M u i di n cho tôm b nh, tôm kh e thu ư c ngoài ao nuôi và các m u tôm b nh thu ư c trong thí nghi m c m nhi m PCR (Polymerase Chain Reaction) phương pháp mô b nh h c xác xác u ư c ki m tra b ng k thu t nh m c nh các bi n nhi m WSSV và b ng i b nh lý trong mô và t bào c a tôm b nh 2.4.1 Phân tích m u b ng k thu t PCR Các con tôm h p h i ao hay thí nghi m ã ư c c nh trong c n 95% Sau ó ư c... Hoa Kỳ [44] 1.2.1 Nh ng nghiên c u c a th gi i v WSS tôm chân tr ng Theo Lightner, 1996; Nunan & ctv, 1997; Flegel & ctv, 2005, n nh ng năm cu i c a th k 20, b nh do WSSV ã xu t hi n và gây tác h i cho các loài tôm nuôi khu v c M la tinh như Mexico, Ecuador…, trong ó c bi t là tôm chân tr ng (Litopenaeus vannamei) và loài tôm xanh Thái Bình Dương (Litopenaeus stylirostris).[25], [35], [43] T ch c s... nghi m các nghi m th c: C-1, C-2, C-3 D qua t l ch t c a tôm Kêt lu n và xu t ý ki n Sơ l kh i n i dung nghiên c u 23 2.2 V t li u nghiên c u 2.2.1 M u tôm chân tr ng (Litopenaeus vannamei) - 1 kg Tôm he chân tr ng b nhi m h i ch ng ch t Ninh Hòa vào u tháng 4/2011 và ư c thu t i m t ao b nh ã ư c b o qu n trong t ông sâu nhi t -20°C - Tôm he chân tr ng kh e, ã nuôi ư c 45 ngày ngoài ao, âm tính v i... rác trong kho ng th i gian dài t 15-28 ngày Tuy nhiên, m c b nh mãn tính, cơ th tôm v n mang virus và có th lây nhi m cho tôm kh e [55] Wongmaneeprateep & ctv, 2010 ã công b hi n tư ng tôm chân tr ng nuôi Thái Lan b bùng phát h i ch ng chuy n màu m tr ng (WSS) c p tính do WSSV, tôm b nh b m Hình 1.2: Tôm chân tr ng (Litopenaeus vannamei) nuôi ch ng m tr ng (WSS) Thái Lan b nhi m h i - nh trái: Tôm chân . của luận văn: “ THỬ NGHIỆM PHÒNG HỘI CHỨNG CHẾT ĐỎ Ở TÔM HE CHÂN TRẮNG (Litopenaeus vannamei) BẰNG CÁC SẢN PHẨM ĐÃ CHIẾT RÚT TỪ THẢO DƯỢC TRONG ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM ’’ Các nội dung chính:. nghiệm phòng hội chứng chết đỏ ở tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) trong điều kiện thí nghiệm bằng các chế phẩm đã chiết rút từ thảo dược. 25 Hình 3.1. Hình ảnh chụp cơ sở thí nghiệm 30. nhỏ trong hướng nghiên cứu này, đó là dùng các sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược để thử nghiệm phòng bệnh chết đỏ ở tôm chân trắng trong điều kiện thí nghiệm. Tên đề tài của luận văn: “ THỬ