LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài tại trường Đại học Nha Trang em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của nhà trường, sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, đặc biệt là các thầy cô giáo và cán bộ trong Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường đã truyền những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho em trong những năm học vừa qua. Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS. Đặng Thúy Bình và Th.S Khúc Thị An đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn và chỉ bảo giúp em hoàn thành đề tài tốt nghiệp này. Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ động viên của gia đình, bạn bè, người thân, cảm ơn những ý kiến đóng góp và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Mặc dù đã có nhiều cố gắng hoàn thiện đề tài của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những đóng góp quý báu của quý thầy cô và các bạn. Nha Trang, tháng 6 năm 2011 Sinh viên Nguyễn Thị Thúy Hà i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi LỜI NÓI ĐẦU 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI ỐC CỐI (Conus spp.) 3 I. TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI ỐC CỐI VÀ ĐỘC TỐ CỦA CHÚNG 3 I.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ PHÂN BỐ CỦA ỐC CỐI 3 I.1.1. Hệ thống phân loại của ốc cối (Conus spp.) 3 I.1.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố 3 I.1.3. Đặc điểm hình thái ngoài của ốc cối 5 I.1.4. Cấu tạo bên trong của ốc cối 8 I.1.5. Chế độ ăn và phương thức săn mồi 9 I.1.6. Đặc điểm sinh sản của ốc cối 12 I.2. NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘC TỐ CỦA ỐC CỐI 13 I.2.1. Cấu tạo bộ máy sinh độc tố (envenomation apparatus) 13 I.2.2. Phân loại độc tố conotoxin 17 I.2.3. Cơ chế tác động của độc tố ốc cối 21 I.2.4. Ứng dụng y học của độc tố ốc cối 21 I.3. NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN VỀ ỐC CỐ 23 I.3.1. Hệ gen cơ quan tử 23 I.3.2. Giới thiệu về hệ gen ty thể và hệ gen ribosom 23 1.3.3. Tình hình nghiên cứu di truyền ốc cối 28 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 ii II.1. PHƯƠNG PHÁP, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊA ĐIỂM THU MẪU 33 II.2. MÔ TẢ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI 34 II.3. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA ỐC CỐI 37 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43 III.1. MÔ TẢ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI 43 III.1.1. Conus marmoreus Linnaeus, 1758 43 III.1.1.1. Đặc điểm hình thái 43 III.1.1.2. Tập tính sống 44 III.1.1.3. Phân bố 45 III.1.1.4. Nhận xét 45 III.1.2. Conus bandanus BRUGUIÈRE, 1792 45 III.1.2.1. Đặc điểm về hình thái 45 III.1.2.2. Tập tính sống 46 III.1.2.3. Phân bố 46 III.1.2.4. Nhận xét 46 III.1.3. Conus imperialis Linnaeus, 1758 49 III.1.3.1 Đặc điểm hình thái 49 III.1.3.2. Tập tính sống 50 III.1.3.3. Phân bố 50 III.1.3.4. Nhận xét 50 III.1.4. Conus quercinus Lightfoot, 1786 52 III.1.4.1. Đặc điểm hình thái 52 III.1.4.2. Tập tính sống 53 III.1.4.3. Phân bố 54 iii III.1.4.4. Nhận xét 54 III.1.5. Conus lividus Hwass in Bruguière, 1792 54 III.1.5.1. Đặc điểm hình thái 54 III.1.5.2. Tập tính sống 56 III.1.5.3. Phân bố 56 III.1.5.4. Nhận xét 56 III.1.6. Conus capitaneus Linné, 1758 58 III.1.6.1. Đặc điểm hình thái 58 III.1.6.2. Tập tính sống 59 III.1.6.3. Phân bố 59 III.1.6.4. Nhận xét 59 III.1.7. Conus caracteristicus Fischer, 1807 60 III.1.7.1. Đặc điểm hình thái 60 III.1.7.2. Tập tính sống 61 III.1.7.3. Phân bố 62 II.1.7.4. Nhận xét 62 III.1.8. Conus betulinus Linné, 1758 62 III.1.8.1. Đặc điểm hình thái 62 III.1.8.2. Tập tính sống 63 III.1.8.3. Phân bố 63 III.1.8.4. Nhận xét 63 III.2. GIẢI PHẪU TUYẾN NỌC ĐỘC 66 III.3. KIỂM CHỨNG PHÂN LOẠI 3 NHÓM LOÀI CÓ HÌNH THÁI CHƯA RÕ NÉT BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ DNA TY THỂ 68 iv III.3.1. C. marmoreus và C. bandanus 69 III.3.2. Conus leopardus và Conus litteratus 72 III.3.3. C. distans và Conus cf. distans 75 III.4. THẢO LUẬN 78 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81 IV.1. Kết luận 81 IV.2. Kiến nghị 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 A. TÀI LIỆU TRONG NƯỚC 82 B. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 82 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Superfamily của conotoxin và conopeptide (Bingham, 2010) 20 Bảng 1.2: Các peptide độc tố với những liệu pháp tiềm năng 23 Bảng 1.3: Các genome ty thể có các gen mã hóa cho các protein 26 Bảng 2.1: Thông số dùng để phân loại kích cỡ chiều dài của ốc theo Verlag Christa Hemmen (1995) 35 Bảng 2.2: Công thức được dùng để phân loại trọng lượng của các loài ốc theo Verlag Christa Hemmen (1995) 35 Bảng 2.3: Công thức dùng để phân loại hình thái của ốc cối theo Verlag Christa Hemmen (1995) 35 Bảng 2.4: Công thức dùng để phân loại kích cỡ của ốc cối theo Verlag Christa Hemmen (1995) 36 Bảng 2.5: Trình từ các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR 40 Bảng 3.1: Bảng giá trị tính theo công thức chuẩn quốc tế của các loài ốc cối 43 Bảng 3.2: Các thông số hình thái của Conus marmoreus 44 Bảng 3.3: Các thông số hình thái của Conus bandanus 46 Bảng 3.4: Các thông số hình thái của Conus imperialis. 49 Bảng 3.5: Các thông số hình thái của Conus quercinus 53 Bảng 3.6: Các thông số hình thái của Conus lividus 55 Bảng 3.7: Các thông số hình thái của Conus capitaneus 59 Bảng 3.8: Các thông số hình thái của Conus caracteristicus 61 Bảng 3.9: Các thông số hình thái của Conus betulinus 63 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Khu vực phân bố của Conus. marmoreus (1) và C. bandanus (2) trên thế giới 4 Hình 1.2: Các thông số hình thái vỏ của ốc cối (Conus ssp.) 6 Hình 1.3: Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp.) 7 Hình 1.4: Hình thái vỏ của các loài ốc cối phân bố ở biển Việt Nam. 7 Hình 1.5: Cấu tạo bên trong của ốc cối 8 Hình 1.6: Phương thức săn mồi theo dạng móc câu của ốc cối 10 Hình 1.7: Phương thức săn mồi (cá) dạng móc câu của Conus striatus 10 Hình 1.8: Phương thức bắt mồi dạng lưới của ốc cối 11 Hình 1.9: Cơ chế bắt mồi theo dạng lưới của Conus geographus 11 Hình 1.10: Vòng đời của ốc cối 12 Hình 1.11: a: Conus achatinus :bọc trứng gắn trên vật bám (động vật 2 mảnh vỏ); b: Bọc trứng của C. nivifer 13 Hình 1.12: Cấu tạo tuyến độc tố của ốc cối 14 Hình 1.13: Cấu trúc răng kitin của ốc cối 16 Hình 1.14: Cấu trúc răng kitin của một số loài ốc cối 16 Hình 1.15: DNA ty thể người 24 Hình 1.16: Cấu trúc hệ gen ribosome 26 Hình 1.17: Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile 32 Hình 2.1: Địa điểm thu mẫu ốc cối tại vùng biển Nam Trung Bộ 33 Hình 2.2: Cấu tạo bên ngoài của ốc cối và các thông số hình thái 34 Hình 2.3: Các dạng hình dạng vỏ của Conus tính theo công thức 36 Hình 2.4: quy trình tách chiết ADN, khuếch đại gen và giải trình tự 38 Hình 2.5: Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR của gen 16S mtDNA 40 Hình 2.6: Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR của gen ITS2 rRNA 41 Hình 3.1. Hình dáng bên ngoài của Conus marmoreus và C. bandanus 47 Hình 3.1.1: Các dạng hình thái khác nhau của Conus marmoreus tại các vùng địa lý trên thế giới 48 vii Hình 3.1.2: Các dạng hình thái khác nhau của Conus bandanus tại các vùng địa lý trên thế giới 48 Hình 3.2: Đặc điểm hình thái ngoài của Conus imperialis và C. quercinus 51 Hình 3.2.1: Các dạng hình thái khác nhau của Conus imperialis tại các vùng địa lý trên thế giới 51 Hình 3.2.2: Các dạng hình thái khác nhau của Conus quercinus tại các vùng địa lý trên thế giới 52 Hình 3.3: Đặc điểm hình thái ngoài của Conus lividus (Hình trên) và C. capitaneus. (Hình dưới). a: mặt trước; b: tháp vỏ; c: mặt sau 57 Hình 3.3.1: Các dạng hình thái khác nhau của Conus lividus tại các vùng địa lý trên thế giới 57 Hình 3.3.2. Các dạng hình thái khác nhau của Conus capitaneus tại các vùng địa lý trên thế giới 58 Hình 3.4: Đặc điểm hình thái ngoài của C. caracteristicus và C. betulinus 64 Hình 3.4.1: Các dạng hình thái khác nhau của Conus caracteristicus tại các vùng địa lý trên thế giới 65 Hình 3.4.2 : Các dạng hình thái khác nhau của Conus betulinus tại các vùng địa lý trên thế giới 65 Hình 3.5: Tuyến nọc độc của một số loài ốc cối 66 Hình 3.6: Cấu trúc răng kitin của ba loài ốc cối 67 Hình 3.7: Kết qủa điện di DNA tổng số của ốc cối 68 Hình 3.8: Sản phẩm PCR gen 16S mtDNA và ITS2 rDNA 68 Hình 3.9: Trình tự gen 16S mtDNA của Conus marmoreus và C. bandanus 70 Hình 3.10: Trình tự gen ITS2 rDNA của Conus marmoreus và C. bandanus 71 Hình 3.11: Đặc điểm hình thái của Conus leopardus và C. litteratus (hình dưới) 72 Hình 3.12: Trình tự gen 16S mtDNA của Conus litteratus và C. Leopardus 74 Hình 3.13: Đặc điểm hình thái của C. distans và Conus cf. distans 75 Hình 3.14: Trình tự gen 16S mtDNA của Conus distans (from Genbank) và Conus cf. distans. 77 1 LỜI NÓI ĐẦU Với hơn 550 loài được biết đến hiện nay, giống ốc cối (Conus spp.) dường như là giống lớn nhất trong các động vật sống ở đại dương. Cùng với việc góp phần vào sự đa dạng sinh học biển, ốc cối cũng có vai trò quan trọng về mặt sinh thái - có đến hơn 36 loài cùng xuất hiện ở 1 nhánh triền san hô (Kohn, 2001); về mặt tiến hóa - tỉ lệ đa dạng (net diversification rate) của ốc cối cao nhất trong lớp chân bụng (Stanley 2007); về mặt kinh tế thì ốc cối rất đa dạng về hình dạng cũng như màu sắc hoa văn vì vậy vỏ của chúng được khai thác làm đồ mỹ nghệ và về mặt sinh học thần kinh và y học - ốc cối có rất nhiều các neuropeptides đặc hiệu trong độc tố của chúng (Olivera, 2006). Chính vì vậy, việc định danh loài và xác định mối quan hệ tiến hóa của ốc cối là rất cần thiết. Hiện nay, phân loại ốc cối chủ yếu dựa vào kích thước vỏ, kiểu, hoa văn và màu sắc hay vân trên vỏ, cụ thể là những đường gờ hay phần lồi trên vỏ (Kohn và cs, 1999). Tuy nhiên, việc định danh loài ốc cối bằng mẫu sống thường gặp nhiều khó khăn do sự biến dị liên quan đến vùng phân bố hoặc biến dị cá thể. Hơn nữa, lớp bọc ngoài vỏ ốc (periostracum) thường đục và bao phủ toàn bộ vỏ khiến các vân màu sắc bị che khuất. Việc lọai bỏ lớp bao này bằng KOH (hoặc NaOH) có thể ảnh hưởng đến các vân màu và không thể áp dụng đối với mẫu vật sống. Đặc điểm hình thái có thể chịu tác động của môi trường, biến dị cá thể cùng loài (Intraspecific) và khác loài (Interspecific), dễ gây nhầm lẫn trong quá trình phân loại. Không chỉ có các thành phần độc tố là đặc trưng cho loài, các biến dị liên quan đến vùng địa lý và tuổi cũng đã được ghi nhận (Bingham và cs, 1996). Chính vì vậy, hệ thống phân loại của loài ốc cối hiện nay vẫn còn nhiều tranh cãi và đôi khi mang lại kết quả không chính xác. Vì vậy, việc sử dụng các chỉ thị phân tử để định danh loài và xác định một cách chính xác quan hệ phát sinh chủng loại loài là điều rất cần thiết (Blaxter 2003, 2004; Hebert và cs, 2003a, b; Stoeckle 2003). Các chỉ thị phân tử của DNA ty thể thường được sử dụng kết hợp với các chỉ thị của DNA nhân. Đối với các động vật 2 thân mềm, DNA ty thể đã được chứng minh là công cụ hữu hiệu trong phân tích mối quan hệ loài (Grande và cs, 2008). Nghiên cứu của chúng tôi kết hợp đặc điểm hình thái và di truyền để định danh phân loại một số loài ốc cối (Conus spp.), đặc biệt là các loài có hình thái chưa rõ nét và đưa ra các chỉ tiêu phân loại có tính chất đặc trưng cho định danh loài. Mục tiêu nghiên cứu:  Mô tả khái quát hình dáng bên ngoài và các cơ quan của tuyến nọc độc từ đó phân loại ốc cối.  Nghiên cứu đặc điểm hình thái và di truyền để định danh phân loại một số loài (Conus spp.) thu thập ở vùng biển Miền Trung, Việt Nam. [...]... CÁC LOÀI ỐC CỐI (Conus spp. ) I TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI ỐC CỐI VÀ ĐỘC TỐ CỦA CHÚNG I.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ PHÂN BỐ CỦA ỐC CỐI Giống ốc cối thuộc nhóm họ Conidae là một trong những giống có số lượng loài lớn nhất trong ngành động vật thân mềm Cho đến nay, trên thế giới người ta đã xác định có khoảng hơn 500 loài ốc cối, chủ yếu thuộc giống Conus Ốc cối là loại động vật ăn thịt, săn mồi sống và. .. Thuận) khá đa dạng về thành phần loài Trong đợt khảo sát 2008-2009, khoảng 20 loài đã được phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền (gen 16S của DNA ti thể - 16S mtDNA) (theo Báo cáo tổng kết dự án “Bảo tồn tiềm năng di truyền các loài thủy hải sản Việt Nam năm 2008-200 9) I.1.3 Đặc điểm hình thái ngoài của ốc cối Giống Conus là tập hợp gồm khoảng 700 loài Ốc cối có hình dạng như trái tim (một. .. các hình dạng khác nhau của một số loài ốc cối thu tại Việt Nam Các chỉ tiêu phân loại dựa vào hình thái vỏ 6 Tháp vỏ Mương trước miệng vỏ Mép ngoài miệng vỏ Miệng vỏ Mép trong miệng vỏ Đáy vỏ Hình 1.2: Các thông số hình thái vỏ của ốc cối (Conus ssp .) (http://www.theconesnail.com/explore-cone-snails/shell-anatomy) Vỏ của ốc cối thường có 3 dạng hình thái khác nhau: Hình nón, hình nón rộng và hình. .. được mô tả ở hình 1.1 Hình 1.1: Khu vực phân bố của Conus marmoreus ( 1) và C bandanus ( 2) trên thế giới (Rockel và cs, 199 5) Tại Việt Nam, ốc cối phân bố chủ yếu ở các vùng ven biển thuộc khu vực Nam Trung Bộ từ Đà Nẵng đến Kiên Giang và quanh các hải đảo (Trường Sa, Hoàng Sa, Côn Đảo) Nguyễn Ngọc Thạch (200 7) mô tả 39 loài ốc ở Việt Nam thuộc họ Conidae Trong đó có rất nhiều loài phân bố ở Bình Thuận,... Hylleberg và Kilburm (200 3) trong khuôn khổ dự án Tropical Marine Molluscs Program (TMMP) đã công bố 76 loài ốc cối được tìm thấy ở vùng biển Việt Nam dựa trên việc thu thập mẫu, khảo sát các bộ sưu tập ở bảo tàng sinh vật biển Việt Nam 5 Nghiên cứu của Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Đại học Nha Trang cho thấy ốc cối ở khu vực Nam Trung Bộ (khảo sát ở 4 tỉnh Quảng Nam, Quảng Ngãi, Khánh Hòa và Bình... và C leopardus thuộc nhóm ốc có hình nón rộng Loài C capiteneus, C bandanus và C marmoreus thuộc nhóm có hình nón (hình 1. 4) 7 Hình nón rộng: Phần chóp thấp hay bằng phẳng C ebraeus Hình nón: Phần chóp không cao và không thấp qúa C lynceus C betulinus Hình nón hẹp: Phần chóp cao so với cơ thể Hình 1.3: Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp. ) Hình 1.4: Hình thái vỏ của các loài ốc cối. .. (http://www.aquariumadvice.com/forums/f16/will-this-snail-eat-my-cleanershrimps-122890.html) 12  Loài ăn nhuyễn thể (Molluscivores) Ốc cối ăn các loài nhuyễn thể khác được goi là molluscivores Một vài loài ốc cối ăn các loài ốc khác như là ốc tiền (cowries), olive shells, turbo snails, và conch snails, trong khi đó các loài khác lại ăn các loài ốc cối khác Những loài ốc này có thể giết và nuốt những con mồi lớn hơn chúng Đã có ghi nhận rằng ốc cối có thể nuốt những... Địa Trung Hải Một số loài có thể phân bố ở vĩ độ trên 400 như ở Nam Phi, Nam Australia, Nam Nhật Bản và biển Địa Trung Hải Ngoài ra chúng còn phân bố ở các vùng biển nhiệt đới và vùng biển ấm như 4 Philippine, Indonesia, Australia, Mexico, Florida, Hawaii, Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng cho thấy một số loài có thể thích ứng với sự thay đổi của điều kiện môi trường như ở vùng biển nóng mũi Cape, Nam. .. độc và tê liệt, ốc cối sẽ nhanh chóng tiêu hóa chúng I.1.6 Đặc điểm sinh sản của ốc cối Hình 1.10: Vòng đời của ốc cối (Rockel và cs, 199 5) 13 Vòng đời của ốc cối kéo dài khoảng 10 - 15 năm trong tự nhiên, cũng như trong điều kiện nuôi nhốt Sinh sản ở ốc cối không được nghiên cứu nhiều nhưng hầu hết là sinh sản hữu tính nhờ quá trình thụ tinh giữa con đực và con cái Vòng đời của ốc cối được mô tả ở (hình. .. 199 7) Tổng họ: Conoidea (Fleming, 182 2) Họ: Conidae (Rafinesque, 181 5) Giống: Conus (Linnaeus, 175 8) (http://zipcodezoo.com/Key/Animalia/Conus_Genus.asp) I.1.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố Giống ốc cối phân bố khắp nơi trên thế giới, chúng thường phân bố ở vùng vĩ độ giữa 400 Bắc và 400 Nam, tương đương với các vùng biển: Ấn độ - Thái Bình Dương, Panamic, Caribbean, Peru, Patagonic, Tây và Nam Phi và . thông số hình thái vỏ của ốc cối (Conus ssp .) 6 Hình 1.3: Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp. ) 7 Hình 1.4: Hình thái vỏ của các loài ốc cối phân bố ở biển Việt Nam. 7 Hình 1.5:. quan hệ loài (Grande và cs, 200 8). Nghiên cứu của chúng tôi kết hợp đặc điểm hình thái và di truyền để định danh phân loại một số loài ốc cối (Conus spp. ), đặc biệt là các loài có hình thái chưa. LOÀI ỐC CỐI (Conus spp. ) 3 I. TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI ỐC CỐI VÀ ĐỘC TỐ CỦA CHÚNG 3 I.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ PHÂN BỐ CỦA ỐC CỐI 3 I.1.1. Hệ thống phân loại của ốc cối (Conus spp. )