CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP • Tách chiết phân tách AND ngoại lai từ sinh vật đích • Phản ứng nối AND – vector tạo phân tử AND TTH • Chuyển AND TTH vào tế bào chủ • Chọn lọc các tế bào mang AND TTH • Sản xuất, tinh sạch protein  Các bước cơ bản tạo ADNtái tổ hợp • Endonuclease giới hạn (RE) CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP • Vector plasmid • Vector thực khuẩn thể lambda • Cosmid • BAC • YAC Vector nhân dòng 1. Vector plasmid Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ  Biểu hiện gen ở các promoter mạnh và có thể điều chỉnh o Promoter mạnh • Có ái lực cao với ARN – pol  vùng nằm ngay sau nó được phiên mã thường xuyên • Tối ưu hóa sự biểu hiện của gen nhân dòng • Khó khăn:  Kiệt quệ năng lượng của tế bào chủ  suy yếu các chức năng cần thiết o Promoter có thể điều chỉnh • Chỉ biểu hiện gen nhân dòng trong giai đoạn sinh trưởng đặc biệt của tế bào chủ • Chỉ biểu hiện trong một thời gian xác định  Một số promoter phổ biến o Promoter lac o Promoter trp o Promoter tac o Promoter trc o Promoter pL o Promoter gen 10 từ thực khuẩn thể T7 Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ o Promoter lac Nồng độ glucose Nồng độ lactose Nồng độ AMPv Vùng promoter – operator lac Mức độ phiên mã Thấp Thấp cao Thấp cao Thấp Thấp Thấp cao cao Thấp Thấp Thấp cao cao cao genoperator promoter genoperator promoter genoperatorpromoter genoperatorpromoter CAP AMPv Thể ức chế lac Thể ức chế lac CAP AMPv o Promoter trp • Điều hòa âm: nồng độ trp tăng  đóng promoter  ức chế phiên mã • Hiện tượng “rò rỉ”: phiên mã vẫn diễn ra ngay cả khi gen đã đóng lại Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ o Promoter tac và trc: • Chứa vùng -35 của promoter trp và vùng -10 của promoter lac • khác nhau một cặp base duy nhất:  Promoter tac: vùng -35 của trp và -10 của lac cách nhau 16 base  Promoter trc: vùng -35 của trp và -10 của lac cách nhau 17 base • Đều được cảm ứng khi bổ sung IPTG vào môi trường • Mạnh hơn promoter trp 3 lần, hơn promoter lac 10 lần Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ o Promoter Pl • Được kiểm soát bởi protein ức chế cI của thực khuẩn thể lambda • Được kiểm soát nhờ sự nhạy nhiệt độ:  ở 30oC, thể ức chế cI được tổng hợp liên tục  liên kết với operator của promoter Pl  ngăn cản dịch mã tổng hợp protein đích  ở 42oC, thể ức chế bị bất hoạt  promoter hoạt động  protein đích Thao tác biểu hiện ở sinh vật nhân sơ [...]... của RE ở đầu 5’ CCG TAA ATT CCG TCA CCC AGT TAA TCA ATT AGT CCC CCG TAA TCA GGG GGC ATT AGT CCC Plasmid Các vector biểu hiện dịch mã Cơ sở phân tử Cơ sở phân tử của sự dịch mã khác nhau là sự có mặt của tín hiệu khởi động dịch mã – vùng liên kết ribosome trên phân tử mARN (Ribosome Binding Site – RBS) • RBS: trình tự 6 – 8 nu bắt cặp bổ sung với trình tự nu trên ARN ribosome • RBS phải đặt trước codon...  Protein dung hợp= protein đích liên kết protein tế bào chủ bảo vệ protein đích khỏi sự phân hủy của protease tế bào chủ  Gắn nối phần mã hóa của hai hay nhiều gen với nhau  Sự có mặt của protein chủ  protein dung hợp không thích hợp cho ứng dụng lâm sàng  Protein chủ có thể ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của protein đích  Cắt protein dung hợp: • Nối gen protein đích và protein chủ bằng một... bản sao plasmid cao gánh nặng trao đổi chất cho tế bào chủ hiện tượng mất plasmid trong quá trình sinh trưởng giảm hiệu suất sản phẩm gen nhân dòng  Hai phương pháp chủ yếu: 1 Nuôi tế bào trong môi trường có kháng sinh hoặc chất đồng hóa bắt buộc chọn lọc tế bào mang plasmid có khả năng kháng kháng sinh giá thành cao 2 Đưa ADN nhân dòng trực tiếp vào ADN nhiễm sắc thể một phần của tế bào chủ... Được kiểm soát bởi một promoter có thể điều khiển AND đích phải có độ tương đồng trình tự nhất định (ít nhất là 50nu) với ADN NST trao đổi vật lý (tái tổ hợp) giữa hai phân tử AND  Quy trình cài nhập: 1 Nhận dạng vị trí cài nhập 2 Phân lập và nhân dòng một phần hoặc tất cả vùng cài nhập NST 3 Gắn nối gen nhân dòng và một promoter có thể điều khiển vào đúng hoặc lân cận vị trí cài nhập 4 Chuyển bản... tượng không tương hợp tế bào tế bào chủ không tổng hợp đủ tARN nhận biết các codon hiếm giảm hiệu suất tổng hợp protein •  khắc phục:  Nếu gen đích là của sinh vật nhân chuẩn nhân dòng và biểu hiện trong hệ thống tế bào nhân chuẩn  Tổng hợp hóa học một phiên bản mới của gen đích chứa các codon được tế bào sử dụng thường xuyên hơn – dựa vào tính thoái hóa của mã di truyền  Cải biến tế bào chủ để biểu... của enzyme chu chất hòa tan tạo liên kết disulfua (DsbC) o Sự có mặt của aa ở đầu N bền với sự phân hủy của protease o Trình tự nhạy với protease: • Trình tự PEST – prolin (P), acid glutamic (E), serine (S), threonine (T) • Thường bị chặn hai dầu bởi các cụm aa tích điện dương (lysine, arginine) tín hiệu phân hủy cho protease  Thay đổi vùng PEST tăng độ bền protein Cài nhập ADN vào nhiễm sắc thể... dụng làm kháng nguyên, kháng thể o Được dùng để đơn giản hóa quá quá trình tinh sạch protein Protein dung hợp và vấn đề cuộn gập protein • • •   Một số protein không tan  thể vùi không có hoạt tính sinh học Khắc phục: tạo protein dung hợp Protein dung hợp protein đích – thioredoxin – được tổng hợp và tích tụ ở vùng nhạy thẩm thấu tiết vào môi trường nuôi cấy dạng hòa tan tinh sạch bằng ủ ở nhiệt độ... nhân dòng một khoảng xác định  Codon khởi đầu dịch mã:  ở mức độ ARN: bộ ba AUG  ở mức độ ADN: bộ ba ATG • RBS và một vài codon đầu tiên của gen quan tâm không chứa các trình tự gây cuộn xoắn nội phân tử sau phiên mã làm cản trở tương tác RBS – ribosome • Các vector biểu hiện dịch mã Vector biểu hiện pKK233 - 2 • • • • • • Gen đánh dấu chọn lọc: gen kháng ampicillin Promoter tac Vị trí đa điểm tách... sạch protein SẢN XUẤT PROTEIN DỊ CHỦNG TRONG TẾ BÀO NHÂN CHUẨN Nhược điểm của hệ thống biểu hiện nhân sơ  Không tạo ra phiên bản protein đích thực của nhân chuẩn – không bền hoặc không có hoạt tính sinh học nguyên nhân do:  Cuôn gập protein không chính xác  Không có cơ chế cải biến sau dịch mã  Quá trình tinh sạch phức tạp, không loại bỏ hết yếu tố vi khuẩn gây độc SẢN XUẤT PROTEIN DỊ CHỦNG TRONG... quy trình công nghiệp Các kỹ thuật gây đột biến định hướng: Thay đổi hằng số Michaelis thay đổi mức độ liên kết enzyme – cơ chất, tốc độ phản ứng Thay đổi chính chịu nhiệt hay độ bền pH, hoặc cả hai của một protein  protein cải biến được sử dụng trong điều kiện làm bất hoạt protein tự nhiên Biến đổi hoạt tính enzyme trong dung môi không phải là nước puhh được thực hiện trong điều kiện phi sinh lý . CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TỬ CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP • Tách chiết phân tách AND ngoại lai từ sinh vật đích • Phản ứng nối AND – vector tạo phân tử AND TTH • Chuyển AND. hạn (RE) CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP • Vector plasmid • Vector thực khuẩn thể lambda • Cosmid • BAC • YAC Vector nhân dòng 1. Vector plasmid Thao tác biểu hiện ở sinh vật. 5’ CCG ATT TAA AGT TCA CCC CCG ATT TAA AGT TCA CCC CCG ATT TAA AGT TCA GGC CCC GGG Plasmid Các vector biểu hiện dịch mã • Cơ sở phân tử của sự dịch mã khác nhau là sự có mặt của tín hiệu khởi động dịch mã – vùng liên kết ribosome trên phân tử mARN (Ribosome Binding Site – RBS) • RBS: