2.3.6. BỆNH DO HERPESVIRUS Ở CÁ CHÉP KOI (KOI HERPESVIRUS DISEASE) 1. Phạm vi Bnh do herpesvirus  cá chép koi (KHVD) là bnh nhim herpesvirus (18) có kh  gây nhim virus huyt cng (carp: Cyprinus carpio) và các bin th  cá chép koi (koi carp) và cá chép ma (ghost carp) (16). 2. Thông tin về bệnh 2.1. Các yếu tố thuộc về tác nhân gây bệnh 2.1.1. Tác nhân sinh bệnh học (aetiological agent), các dòng (strains) tác nhân gây bệnh Tác nhân sinh bnh hc là koi herpesvirus (KHV) thuc h Herpesviridae (18, 45) mc dù virus         n k và hoi t mang th ca cá chép (carp interstitial nephritis and gill necrosis virus  CNGV) (20, 30). Waltzek và cng s (42) ng ch giúp phân lot tên là cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3), kèm theo danh pháp ca các cyprinid herpesvirus khác: CyHP-u cá chép [carp pox virus], virus n sn  cá [fish papilloma virus]) và CyHV-2 (virus gây hoi t h thng to huyt ca cá vàng [goldfish haematopoietic necrosis]). Các phân tích kt chui ca phn gen di truy cho thy rng KHV có liên quan gn vi CyHV-1 và CyHV-2, và có liên quan xa vi virus cá da c ngt (Ictalurid herpesvirus: IvHV-1) và Ranid (ch) herpesvirus (RaHV-1) (42). G, Aoki và cng s   kt chui gen di truyn ca KHV và nhn di gen mã hóa các protein. H ch ra rng 15 gen cng vi các gen trong IcHV-1, xác nh xut xp KHV vào h Herpesviridae. c tính g gen di truyn ca KHV bin thiên t ít nhc này gc xác nhn là 295 kbp (2, 42). c tính v c ca hg có khác nhau. V bao ht nhân (nucleocapsid) cm âm (negative-ng kính 103  c bao quanh bi v bao ngoài (envelope) (18, 20, 40). V bao ht nhân cc ct lát mng (thin-sectionedng kính là 7884, 80110 và 110 120 nm (5, 6, 18, 28). So sánh các di truyn ca các dòng KHV phân lc t a lý khác nhau, bng các phân tích gii hn enzyme (restriction enzyme analysis) (12, 16) hay bng các phân tích kt chui y di truyn ca các dòng KHV này thc t là ging nhau. Ging vy, các polypeptides ca các dòng KHV phân lc t  nhau, mc dù mt dòng phân lc t Israel có thêm hai polypeptide (11, 12). Aoki và cng s (2)   kt chui di truyn ca ba dòng KHV phân lc t Nht Bn, Israel và M. Các di truyn này cho thy rt ging nhau  m kt chui, vi dòng ca Israel và M thì gn i dòng ca Nht Bnc gic sinh ra t hai nhánh (lineage) là nhánh Nht Bn và nhánh Israel-M, vn có ngun gc chung. 2.1.2. Sống sót bên ngoài ký chủ Các nghiên cu  Israel cho thy rng KHV vn còn ho  c trong ít nht 4 gi, n 24 gi,  nhi c là 23  25 o C (28). Các nghiên cu  Nht Bn cho thy có gim nhiu v hiu giá gây nhim ca KHV trong vòng 3 ngày trong các mu ng và bùn lng (sediment)  15 o C. Tuy nhiên, kh y nhim vn > 7  trong các m c x lý tit trùng bng hp autoclave : http://www.oie.int/  hay qua lc (35). Nghiên cng chi vi s hin din ca các dòng vi khung kháng virus. Gn thy DNA ca KHV trong các mc sông  nhi 9  11 o c khi xy ra mt  dch KHVD trong mt con sông (17). Tuy nhiên, s tn ti ca virus có th c tr giúp bi s hin din cng vt làm trung gian truyn lây và vic phát hin DNA có th không luôn là ch th v s hin din ca virus gây bnh. 2.1.3. Tính bền bỉ của tác nhân gây bệnh Virus b bt hot bi bc x UV và nhi trên 50 o C trong 1 phút. Các ch iu qu  làm bt hot virus: iodophor  200 mg lít 1 trong 20 phút, benzalkonium chloride  60 mg lít 1 trong 20 phút, ethyl alcohol  30% trong 20 phút và sodium hypochlorite  200 mg lít  1 trong 30 giây, tt c u  15°C (22). 2.1.4. Vòng đời Các báo u tra gy rng mang th ng vào ch yu ca virus trong cá chép (9, 13, 24, 29). Tuy nhiên, mt thc nghim gng minh da ph ngoài các vây cng vào chính ca KHV (7). Sau khi xâm nhp, virus phân tán t mang th n các ni tn thy s ng nhiu DNA ca KHV trong các mô thn, lách, gan và rut (9, 29). S lp ghép và to hình ca KHV trong các t bào b nhic mô t là gi các herpesvirus khác. Mt kim tra siêu cu trúc cc gây nhim thc nghing chng v các v bao hnh ln hoàn chc lp ghép trong nhân và có s phát trin tip ca ha t bào b nhim (24). S t cht nhày là bng chng rõ rn sm ca nhi phát hin thy DNA ca KHV vi m cao trong các mu cht nhày cc gây nhim thc nghing chn da trong sinh bnh hc ca virus và da là v trí quan trng trong thi tit virus. S thi ting niu   quan trng cho thi ting ADN cao cc trong các mô ca rut và thn, và virus gây nhic trong các mu phân thu thp t  nhim (9, 13). 2.2. Các yếu tố thuộc về ký chủ 2.2.1. Các loài ký chủ có mẫn cảm Bnh nhim KHV xy ra trong t nhiên ch ghi nhng (Cyprinus carpio carpio), cá chép koi (koi carp: Cyprinus carpio koi) và cá chép ma (ghost carp: Cyprinus carpio goi), và xy ra  các lai ghép các loài cá này. Các lai ghép ca cá vàng (goldfish) x cá chép ng, sinh ra t lai gic v là th hin kh n ci vi bnh nhim KHV. mc dù t l t vong là thp (5%), khong 50% các cá lai c kim tra vào 25 ngày sau khi tiêm xoang bng vi liu cao c gen di truyn ca virus, theo phát hin bng phn ng chui phân t (polymerase chain reaction  PCR) (19). 2.2.2. Các giai đoạn mẫn cảm của ký chủ Tt c các nhóm tui ca cá, t cá thiu niên (juveniles) tr u th hin có mn cm vi u kin thc nghim, cá t 2,5  6 g là có mn c vi cá 230 g (28). Mt nghiên cu  Nht Bn cho thy rng u trùng (larvae) ca cá chép (3  4 ngày sau khi n tr i vi bnh nhia cá này s có t l t vong 100% khi b m vi KHV vào 2 tháng sau (21). 2.2.3. Các loài hay tiểu quần thể có thiên hướng (khả năng phát hiện bệnh) ng), là có mn cp cho chn l phát hilà mng lai có my mng hay cá chép hng (crucian carp) x chép ng. 2.2.4. Các cơ quan mục tiêu và mô bị nhiễm Mang th, thu nht trong tin trình ca bnh phát l (13). 2.2.5. Bệnh nhiễm dai dẳng với các cá thể mang trùng suốt đời  u kin t nhiên, các cá th sng sót vi KHVD là b nhim dai dng vi virus, và nu có thì có hay không chúng thi tit virus bao lâu hay chún gi virus bao lâu. Mt s nghi vc gây nhim thc nghim,  y virus có th tn tng b nhim  nhi cho phép và sau   nhi th 2.2.6. Các trung gian truyền lây (vectors) c là trung gian vô sinh (abiotic) ch yng vt trung gian truy  vt dó liên quan trong quá trình truyn lây. 2.2.7. Các động vật thủy sinh đã biết hay có nghi ngờ mang trùng c nuôi chung các loài cá khác trong các h th y các du hiu bnh hay t vong trong các loài khác khi xy ra các  du king (5, 18, 28, 38). Tuy nhiên, c li vi phát hin  nh liu thc nghim t c cho thy có mn cm ca cá vàng và cá trm c i vi KHV (15). Gn thy trong mô ca cá vàng khe mnh sng chung vnh thc nghim vy  cá vàng b m t nhiên trong các trn d nhiên do KHV  cá chép koi (10, 31). Cn có nghiên c nh virus tn tu thêm nu cá mang trùng thi tit ra virus có kh ng. Tuy nhiên,  ng chng gia y rng cá vàng có kh m i vi KHV. Ha, nu các phát hin t c xác nhn, thì tt c các loài cá chép cyprinid s cc coi là có kh i vi KHV. 2.3. Mô hình bệnh 2.3.1. Các cơ chế truyền lây Kiu truyn lây ca KHV là truyn trng gi là truyn nay không th b qua. Truyn lây ngang có th là trc tin c là trung gian vô sinh chính. Các ngun tàng tr ca KHVD là cá b nhim th hin lâm sàng và các mang trùng n cha virus trong cá nuôi nh hay hoang c lc thi ting niu, mang th và cht nhày ci u kin thc nghim, virus gây nhic thi tit liên tc trong thi gian dài  cá  nhim, trong nhi 16 o C, thi gian thi tit ra virus ng 23 o C hay 28 o C (44). Tin trình bnh có th c bit  các nhi t 25 o  ch nhi i 23 o C. Bnh có th xut hin trong 3 ngày sau khi cho cá khe mnh vào mt h có cha cá b b 21 ngày mi phát hin thy bnh l ra   2.3.2. Lưu hành bệnh  c công b v  các qun th hoang dã ln a cá chép.  ng chng t các th nghim thc nghim v tn ti ca virus c gây nhim  nhi c tàng tr  mt nhi thp n 2.2.5). Tuy nhiên, trong các thc nghim khác  cùng mt nghiên cu tra cho rng không có cá nào b nhim dai dng sau khi phát bnh do KHV. Trong các nghiên cu khác, DNA cn thy trong cá chép không phát bnh, bi phân tích PCR, trong nhi 13 o C, và cho thy kh  nhim sng sót  các nhi thp có th n tàng tr ca virus (13). 2.3.3. Phân bố địa lý u v KHVD  c (5, 28), gii ha lý ca bnh tr nên lan rng. Bn nhiu quc gia trên th gii, ch y c hiu bit v bn bnh. Bnh hin nay xy ra, hoc ghi nhn trong cá nhp khu vào,  ít nht 22 quc gia khác nhau.  Châu Âu bao gm Austria, Belgium, Denmark, France, Italy, Luxembourg, The Netherlands, Poland, Switzerland và Anh Quc (4, 8, 16, 33).  Châu Á, Trung Qu (40), Indonesia (37), Japan (32), Hàn Quc (Rep. of) (6), Malaysia (16, 23, 25), Singapore ( cá nhp khu t Malaysia) và Thái Lan ( cá nhp khu t c, 16).  (14, 18, n din ca KHVD. n din trong nhiu quc gia khác,  nhn din hay báo cáo. 2.3.4. Tỷ lệ tử vong (mortality) và tỷ lệ mắc bệnh (morbidity) T l mc bnh ca các qun th b nhim có th là 100%, và t l t vong 70  80% (5, 41),   l t vong có th  n 90 hay 100% (5, 40). Nhim ph và vy nhim vi khun và/hoc nhing thy  cá chép b bnh và có th n t l t vong và th hin ra các du hiu (16). 2.3.5. Các yếu tố môi trường Các mô hình bnh b chi phi bi nhi c lc ca virus, la tui và tình trng sc khe ca cá, m qun th và các yu t n chuy trng, chc kém). Bnh là ph thuc vào nhi c, xy ra t n 25 o C (8, 18, 28, 32, 39, 40). i u kin thc nghim, b l t vong cao  28 o  l t vong không cao  29 hay 30 o C (20, 27), ln  13 o C (13). Tuy nhiên, DNA cc trong cá bng PCR  13 o C, và có th là cá b nhim sng sót  các nhi thp có th là các ngun tàng tr cho virus 913). 2.4. Kiểm soát và phòng ngừa m soát và phòng nga KHVD s ch yu là di vi virus, kèm theo các thc hành v sinh tt và an toàn sinh hu này là có th  các trang tri nh c cung cc t sui hay h ao và có mt h th a cá xâm nhp trang trc thi thoát. 2.4.1. Sử dụng vaccin Mt vaccin an toàn và hiu qu hin nay không sn có r      c c s d chng nga cho cá chép và có bo h i vi th thách bng virus (27, 30). Ch phm vaccin này có kích thích kháng th kháng v dài bo h t. Vaccin này hic cp phép s dng tc s dng rng rãi trong các trang tri nuôi cá chép khp quc gia này. Các kt qu nghiên cu  Nht B hin rng vic cng ming mt loi vaccin da vào liposome có ch làm bt hot là có hiu qu trong bo h i vi bnh nhim KHV (43). 2.4.2. Hóa trị liệu Không áp dng. 2.4.3. Kích thích miễn dịch (immunostimulation) Hin nay không có thông tin v s dng tác nhân kích thích min d kim soát KHVD  c nghiên cc quan tâm. 2.4.4. Giống có đề kháng  hin khác bit v  kháng vi KHVD trong các dòng cá chép khác nhau (34) và các nghiên cy r kháng là theo la tui (28). Trong các nghiên cu gi kháng, con cháu ca lai ging gia hai dòng cá chép thung vi mt dòng cá chép hoang dã  nghim bng thc nghim hay gây nhim t nhiên. T l sng sót thp nht kho l sng sót c kháng nht 61  64% (34). 2.4.5. Tái đàn với các loài có đề kháng Các  dch t nhiên c c i, bao gm cá chép bc (silver carp: Hypophthalmichthys molitrix), cá trm c (grass carp: Ctenopharyngodon idella), u to (bighead carp: Aristichthys nobilis). Các  c nuôi l du hiu bnh hay t vong nào quan sát thy trong các loài này, k c u kin  hay sau khi thc nghim sng chung vi cá b bnh, m trc tip vi virus (27, 33, 37, 38). Các lai ghép c hin là kh m  a các tn tht ln bi KHVD. Các nghiên cu trên mt qun th lai ghép ca cá ng cho th kháng vi KHVD (19). Các lai ghép này th hin phát trin nhanh chóng và có th hin hình thái ging nht vi th h cha m. Tuy nhiên, DNA ca n thy bng PCR trong các cá lai sng sót, cho thy rng chúng có kh  mani vi virus (19). 2.4.6. Các tác nhân chặn đứng bệnh (blocking agents) Không áp dng. 2.4.7. Sát trùng trứng và ấu trùng Vic sát trùng trng có th c bng x lý v hin là b bt hot bi iodophor  200 mg lít -1 trong 30 giây  15 o C (22). 2.4.8. Các thực hành chăn nuôi thông thường Các bin pháp an toàn sinh hc s bao gm bo rng cá m là t các ngun sch bnh và thit lp h thng cách ly mà cá mi nhp có th i cá ch m (sentinel)  các nhi  phát hic cách ly trong ti thiu 4 tuc khi chuyn v  nhp chung vi cá trong trang tri. Các bin pháp v sinh trong trang ti s  c khuyên áp di vi SVC và bao gm sát trùng trng xuyên sát trùng h nuôi, sát trùng bng hóa cht cho thit b trang tri, qun lý cá cn th tránh stress và tiêu hi vi cá cht. 3. Lấy mẫu 3.1. Chọn lựa các cá thể lấy mẫu Tt c các nhóm tui cu th hin mn cm vi KHVD, tuy nhiên, cá non tu ng có mn ci vi bc khuyên cho ly mu. Tính thích hp ca các m  c chn trong mt  dch nghi ng KHVD s tùy thuc vào xét nghim chc áp dng. Cá chép hp hi hay mi cht th hin các du hiu lâm sàng n hình ca bnh là thích hp cho xét nghim bi hu ht các xét nghic mô t trong n 4. Các xác cá th hin các du hiu v phân hy mô có th ch thích h pháp da vào PCR. Ging vy, các mu thu thp t cá th hin khe mnh, trong mt qun th có nghi ng bnh, có th ch xét nghic mt cách tin cy ba vào PCR nh 3.2. Bảo quản các mẫu để gởi đi Cá nguyên con s c gn phòng thí nghim còn sng hay git cht trong các vt chc niêm kín. Tuy nhiên, thích hp nht và khuyên rng nên thu thp các m c chn t sn xut cá. Cá nguyên con hay các m c gn phòng thí nghim trong các vt cha làm lp i vi cá hay ph tng thu thp làm mu. Tuy nhiên, nu ch nhn c mu cá hay ph tnh, thì các mu này ch thích h nghim da vào PCR. Các mu nh c c go qun bng alcohol   xét nghim ba vào PCR. 3.3. Gom chung (pooling) các mẫu Khi xét nghim cá bnh lâm sàng ba vào PCR, c bit nu có c gng  phân lp virus, nên tránh gom chung các mu hay ch gii hn ti mu gom. Vi xét nghi giam sát sc khe ba vào PCR, mu gom chung s gii hn tron ti mu gom. 3.4. Các cơ quan hay mô tốt nhất Khi xét nghim cá b bnh lâm sàng ba vào PCR, c bit nu có c g phân lp virus, khuyên rng nên ly mu  các mô ca mang th, thn và lách. Virus có nhiu nht trong các mô này trong quá trình bnh bc l (13). Khi xét nghim cá nhim bnh cn lâm sàng, có biu hin khe mnh, ba vào PCR, khuyên r gm rut và não trong mu thu thp. 3.5. Các mẫu/mô không thích hợp Xác cá cht th hin du hiu rt tin trin ca phân hy có th không thích hi vi bt k m nào. 4. Các phương pháp chẩn đoán Ch KHVD trong cá bnh lâm sàng có th c bng nhip bng t bào nuôi cho KHV hic coi là nha vào  phát hin DNA ca KHV. Virus ch phân lc trên mt s loi t bào nuôi và các loi t bào nuôi này khó qun lý. Kt qu là vic phân lp virus trong t bào nuôi là phn i vn dch hc, gi pháp áp dng cho chnh nhim virus huyt mùa xuân  cá chép (spring viraemia of carp  m min dch hunh quang [immunofluorescence  IF] hay xét nghim phân tích hp ph min dch kt hp enzyme [enzyme-linked immunosorbent assay  ELISA]), có th thích hp cho nhn din nhanh và ch      c báo cáo, so n hin nay, do các xét nghin có, chn  KHVD s ch da vào ch mt kim tra mà có kt hp cn ba xét nghim (16). 4.1. Các phương pháp chẩn đoán thực địa 4.1.1. Các dấu hiệu lâm sàng Trong mt  dch KHVD   t cá t l t vong trong qun th. Tt c các nhóm la tui cu th hin có mn cm vu kin thc nghii thì mn ci vi bnh. Trong kim tra k i vi cá th cá, các du hiin hình bao gm bi ng   có cu trúc xù xì, biu bì tróc ra tm hay tng mng, cht nhày sinh ra quá nhiu hay quá ít trên da và mang th, bin màu nh   mang th. Các du hi i th khác bao gm lõm mt (enophthalmia: mt huyt trên da và gc các vây, và loét  vây. 4.1.2. Các biến đổi tập tính Cá tr nên l , tách ra khi bc chy vào hay các thành h nuôi và ngáp th  mc. Mt s cá có th gp phi m ng và m    th hin các du hiu cng vng. 4.2. Các phương pháp lâm sàng 4.2.1. Bệnh tích đại thể (gross pathology)  i th là bnh tích hc (pathognomonic lession). Kt lun chn  phi ch n khi phát hin DNA ca virus hay phân lp ra virus và nhn din. Tuy nhiên, bi th thc cht nht là thy  mang th và có th khác nhau v m, t các mng hoi t nhn bin màu lan rng, hoi t nng n và viêm. Kim tra thêm có th phát hin loét  phip ca mang th, tan chy  phin th c các chót ca phin mang th p và th cp. Các bnh tích bên trong khác là có v ng không có ng hp t t ngt. Các bnh i th c báo cáo bao gm viêm dính trong xoang bng vi có hay không màu bng c n hay gan có th  th him xut huyt (petechial haemorrhagic). S hin din ca các bi th  phc tp thêm do cá chc bit là  ng, mà cùng b nhim bi các ngoArgulus sp., Chilodonella sp., Cryptobia sp., Dactylogyrus sp., Gyrodactylus sp., Ichthyobodo sp., Ichthyophthirius sp., Trichodina sp., và các monogeneans khác  mang thu loài vi khuc bit là Flavobacterium columnare  các nhi c  4.2.2. Hóa chất dùng trong lâm sàng (clinical chemistry) Không có thông tin. 4.2.3. Bệnh tích vi thể (microscopic pathology) Mô bnh hc (histophathology) ca bnh có th c hiu và bii t  các mang th     m thc cht. Mang th   hi   (hyperplasia) và teo (hypertrophy)  biu bì ca mang cá, và có th thy có tan chy ca phin mang th th cp (secondary lamellae) và kt dính ca các si mang th (gill filaments). Hoi t mang th, gii hn t các vùng nh hoi t ca các t bào biu bì ca phin mang th th cp n hoàn toàn mn mang th. Các t bào biu bì ca mang cá và các t bào bch cu (leucocytes) có th có ch ym sc th dch ra vi cho ra du y có các th vùi ni nhân nht màu ri rác. Viêm, hoi t và các th vùi trong nhân c bit là thn, y tng, gan, não, rut và biu bì vùng ming. 4.2.4. Tiêu bản ướt (wet mounts) Không áp dng. 4.2.5. Tiêu bản khô (smears) n dic trong các mu ép (imprint) t gan, thn và não ca cá b nhim, qua xét nghim min dch hunh quang (immunofluorescence  IF). Các m cao ca IF thy  thn và virus có th phát hic bng IF trong mu ép ca thn vào 1 ngày sau khi gây nhim (29, 34). 4.2.6. Soi kính hiển vi điện tử (electron microscopy)/bệnh tích tế bào (cytopathology) Vic phát hin các ht virus bng kính hin vi chuyn t (transmission electron microscopy  i vi các mô ca cá chép bnh y. Các mnh mô ca mang và thc c nh trong glutaraldehyde s c ly mu t cá chép b nhim nng n (> 10 6 ht virus). Các kt qu tt nhc t ly mu mt s cá trong mt qun th b nhim  n khác nhau ca bnh nhimm bo rng mt s mu mô là ly t các cá th b nhim nng n. 4.3. Các phương pháp phát hiện và nhận diện tác nhân gây bệnh n này, không phi tt c c th hin thành chi tit vì   n và nhn din KHV. Trong ng hp này, s có mt mô t ngn v       c công b. Các khuyn cáo v  da vào xét nghim thêm  liu có thêm t các phòng thí nghi quynh r hp vi m 4.3.1. Các phương pháp phát hiện trực tiếp c trong các ma gan, thn và não ca cá bnh, bng min dch hunh quang (IF). Các m cao ca IF thy  thn và virus có th phát hin c bng IF trên ma thn vào 1 ngày sau khi b nhim (29, 34). Kháng nguyên ca c trong các mô b nhim bm min dch ô xy hóa (immunoperoxidase staining). Kháng nguyên cc lúc 2 ngày sau khi b nhim  thy  mang th và gan (29). Tuy nhiên, vic phát hin KHV bng nhum màu min dch (immunostaining) phc din gii cn thn, do các t bào nhum  là kt qu ca phn ng chéo vi virus có huyt thanh hc có liên quan -1) hay mt protein không phi ca virus (29). Mn trc tip KHV t m   a thn, bng xét nghim kháng th hunh quang gián tip (indirect fluorescent antibody test  c mô t chi ti a vào ELISA cho phát hin trc tip kháng nguyên ca KHV trong các mô b nhi c phát trin trong mt s phòng thí nghim trên th gi        c công b rng rãi. Hi        c phát trin   phát hin KHV trong cht tit ca cá (phân) (9). c áp dng ph bin nht cho phát hin KHV mt cách trc tip trong các mô ca cá là áp dng các xét nghim phân tích dc hii vi KHV. 4.3.1.1. Các phương pháp dùng kính hiển vi (microscopic methods) 4.3.1.1.1. Tiêu bản ướt (wet mounts) Không áp dng. 4.3.1.1.2. Tiêu bản khô (smears)/mẫu ép tươi (imprints) 4.3.1.1.2.1. Xét nghiệm kháng thể huỳnh quang gián tiếp trên mẫu ép tươi của thận i) Ly huyt hoàn toàn cho cá. ii) To ma thn trên các phin kính sch hay  a các ging ca phin plastic dùng nuôi t bào. iii)  m iv) Ra mt ln vi dch mum phosphate 0,01 M (phosphate buffered saline  PBS), pH 7,2, a nhanh ba ln vi acetone lnh (bo qun  -20 o C) cho các phin kính hay dùng hn hp c -20 o C, cho các phin plastic.  hp cht làm c nh này phn ng trong 15 phút. Mt th tích 0,5 ml/2 cm 2 gi cho các mu ép trong phin plastic nuôi t bào.  các m nh này khô trong không khí trong ít nht 30 phút và x lý ngay hay bo qunh  -20 o C. vii) Tái hc cho các mu ép bng bc ra vi dung dch PBS 0,01 M, pH 7,2, có cha  b hoàn toàn dm này sau ln ra cui cùng. viii) Chun b mt dung dch ca kháng th c hay huyt thanh kháng KHV pha trong PBS 0,01 M, pH 7,2, có cha 0,05% Tween 20 (PBST),   pha loãng thích hc pha c pha sn t nhà cung cp). ix) Kt khi (block) vi 5% sa tách béo hay 1% albumin huyt thanh bò, pha trong PBST trong 30 phút  37 o C. x) Ra bn ln bng PBST. xi) X lý các mu ép bng dung dch kháng th n b t c viii) trong 1 gi  37 o C trong bung m  xy ra bt th tích là 0,25 ml/2 cm 2 mi gi cho mu ép trong các phin plastic nuôi t bào. xii) Ra bn ln vi PBST. xiii) X lý các mu ép trong 1 gi  37 o C vi dung dch ca hp cht kháng th kháng globulin min dch (kháng vi kháng th   dng    c kt hp vi fluorescein isothiocyanate (FITC) và chun b ng dn ca nhà sn xut. Các kháng th kt hp vi ng là kháng th t th hay t dê. xiv) Ra bn ln vi PBST. xv) Cho PBS vào  0,5 ml/2 cm 2 mi gi x lý các mu ép trong phin plsatic và kim tra y lên các phin kính bng lam kính (cover-slip) cùng vi glycerol saline có pH 8,5 c khi quan sát bng kính hin vi. xvi) Kii tia UV, s dng kính hin vi vi th kính x 10 và vt kính x 20  40, có kh hi t lt là > 0.65 và > 1,3. Phi ch cho ra các kt qua mong mun  so sánh vi mi quan sát khác. 4.3.1.1.3. Các lát cắt đã cố định   c mô t tro       p cho phát hin kháng nguyên ca KHV trong các lát c  m nh  c c nh trong 10%   m trung hòa (neutral buffered formalin  NBF). Tuy nhiên, các lát c     c tái h c trong PBS, có th cn ph c x    bt l kháng nguyên mà có th b che lp bi quá trình làm c nh mô. Mt x ng là  các lát ct vi 0,1% trypsin pha vi PBS  37 o C trong 30 phút. a các lát ct trong PBS lc khi tic viii  n 4.3.1.1.2 nêu trên.  phát hin trc tip kháng nguyên virus bng IFAT hay hóa min dch mô bào, các mô s c c nh trong 24  48 gi t làm c c thay th bng  bo qun lâu dài. 4.3.1.2. Phát hiện, phân lập và nhận diện tác nhân gây bệnh 4.3.1.2.1. Tế bào nuôi cấy Chnh lâm sàng có th thc hic bng phân lp virus trong t bào nuôi. Tuy nhiên, virus ch phân lc gi hn trong mt s loi t bào nuôi và các t bào này có th y, phân lp bng t bào nuôi thì không nha c công b phát hin DNa ca virus, nên nuôi cy phân lc cho là i vi KHVD (16). Các lớp tế bào nuôi (cell line) sẽ sử dụng: KF-1 hay CCB Chiết xuất ra virus Áp dc mô t n A.2.2.2. Cấy gây nhiễm (inoculation) vào các đơn lớp tế bào c khi cy gây nhim cho t bào nuôi, các huyn d c x lý vi các chn A.2.2.1 và A.2.2.2. ii) Nng t bào (cytotoxic effect) quan sát thy sau khi cy vào huyn d c x lý cht kháng sinh, thì lc ít nht 1 ml dch phù ni ca huyn d  c cellulose acetate c 0,45 µm (hay lc c  có màng ít kt bám protein).  cy trc tip, chuyn mt th tích thích hp huyn d c lên các lp t c 24  48 gi trong các bình nuôi flask hay các phin nhiu ging. Cy vào ít nht 5 cm 2 ca lp t bào vi 100 µl dch phù nc. Cách khác, t pha loãng gi ln ca dch phù ni qua lc pha vng nuôi t m  pH 7,6 và c b sung 2% huyt thanh phôi bê (fetal calf serum   hp ph trong 0,5  1 gi  18  22 o  dch cy, thêm vào mt th tích thích hng nuôi t bào (1  1,5 ml/5 cm 2 cho bình nuôi flask), và   n 25 o C.  dng các phin nhiu ging,  i khí quyn CO 2 s c pH trong quá trình . Theo dõi quá trình ủ cấy i) Theo dõi tin trình gây nhii chtính và các t bào nuôi cy khác bng kim tra hàng ngày vi kính hin vi   i x 40  100 trong 14 ngày. Khuyên nên s dng kính hin vi phn quang (phase-contrast microscope). ii) Duy trì pH cng nuôi t bào  t n 7,6 trong quá trình  cu này có th c bng nuôi t bào dng   m (HEPES-buffered medium: HEPES = N-2-hydroxyethyl-piperazine-N-2- ethanesulfonic acid) cho các bình nuôi cy flask có ny kín. iii) Nu xut hin ng gây bnh tích t bào (cytopathic effect  CPE) trong các m cy này vi  pha loãng ca dch phù nn din s c tin hành ngay (xem  iv) Nu không phát trin CPE trong các m cy (mc dù có tin tring trong các i chng có virus), cy truyn tip các m cy trong 14 ngày. Ni chng không phát tric CPE, xét nghim phc lp li vi các lp t bào mi có mn cm vi các lô mi ca mu. Phương pháp cấy truyền tiếp (subcultivation) i) Chuyng dch cng nuôi t bào t tt c các m cc cy bng dch phù ni ca huyn dch mu, lên các lp t bào nuôi mi. [...]... Không áp dụng 6 (Các) khuyến cáo cho giám sát tập trung để tuyên bố sạch đối với bệnh do herpesvirus ở cá chép koi Giám sát tập trung sẽ dựa vào theo dõi thƣờng xuyên các vị trí có các loài có mẫn cảm Các vị trí sẽ đƣợc theo dõi khi các nhiệt độ nƣớc đạt đến các mức độ mà cho phép phát triển bệnh (> 17oC) và không sớm hơn 3 tuần sau khi các nhiệt độ nƣớc đã đạt đến Mọi cá chết, hay cá thể hiện tập tính... chủ là tối ƣu Cá chép bị nhiễm sản sinh ra các kháng thể kháng virus, và các xét nghiệm ELISA đã đƣợc công bố sẽ dựa vào phát hiện các kháng thể này ở độ pha loãng cao của huyết thanh (1, 26, 30, 36) Kháng thể đã phát hiện thấy trong huyết thanh ở 3 tuần sau khi gây bệnh thực nghiệm và tồn tại trong cá sống sót đến 1 năm sau khi bị nhiễm tự nhiên (1, 30, 36) Huyết thanh từ cá chép koi chứa các kháng thể... công cụ giám sát duy nhất Tuy nhiên, do chƣa đủ hiểu biết về các đáp ứng huyết thanh học của cá đối với virus gây nhiễm, việc phát hiện các kháng thể của cá đối với các virus vẫn chƣa đƣợc chấp nhận là phƣơng pháp theo dõi để làm thủ tục cho xác định tình trạng nhiễm virus của các quần thể cá Việc đánh giá một số kỹ thuật huyết thanh học đối với một số bệnh do virus ở cá sẽ gia tăng trong tƣơng lai gần,... khuyên áp dụng iều này là do virus phát triển chậm và không chuẩn xác trong các tế bào nuôi cấy 4.3.1.2.3 Các phương pháp phân tử Với các phƣơng pháp PCR một lần (single-round PCR) đã đƣợc công bố, chi tiết về các giao thức nêu dƣới đây hiện nay đƣợc coi là nhạy nhất cho phát hiện DNA của KHV trong các mẫu mô tƣơi từ cá chép bệnh lâm sàng Các giao thức này có thể cũng phát hiện đến các mức độ cận lâm sàng... Khi các vị trí đã đƣợc nhận ra là nghi ngờ dƣới tiêu chí v) và vi), việc xét nghiệm KHV sẽ chỉ đƣợc tiến hành nếu các nhiệt độ nƣớc đã đạt đến các mức độ mà cho phép phát triển đƣợc bệnh (> 17oC) Nếu các nhiệt độ nƣớc là dƣới các mức độ cho phép phát triển bệnh, thì mẫu cá còn sống có thể đƣợc đặt vào các nhiệt độ cao hơn (lý tƣởng là 20 – 24oC) và đƣợc xét nghiệm vào 14 – 21 ngày sau 7.2 Định nghĩa các... hiện có phản ứng chéo, ở mứa độ thấp, với CyHV-1, là một chỉ thị thêm cho sự liên quan gần gụi giữa các virus này Bằng chứng về các phản ứng chéo đã chứng minh đƣợc trong ELISA thuận nghịch (reciprocal ELISA) và các phân tích thấm thấu cầu Tây (Western blot analyses) đối với huyết thanh từ cá chép koi bị nhiễm bởi CyHV-1 hay KHV (1) Các nhà chẩn đoán virus học cũng sẽ lƣu ý rằng cá mới đƣợc cấp vaccin... các mẫu xét nghiệm 4.3.2 Các phương pháp huyết thanh học Tình trạng miễn dịch của cá là yếu tố quan trọng sau khi phơi nhiễm với KHV, với cả miễn dịch không đặc hiệu (chất cản nhiễm interferon) lẫn miễn dịch đặc hiệu (các kháng thể trong huyết thanh, miễn dịch quan trung gian tế bào) đều có các vai trò quan trọng trong bệnh nhiễm herpesvirus Bệnh lâm sàng xảy ra chủ yếu ở các nhiệt độ nƣớc từ 18oC... Tiêu chí sau đây sẽ hội đủ cho xác nhận KHV: i) Tỷ lệ tử vong, các dấu hiệu lâm sàng và các biến đổi bệnh tích thực chất của bệnh do KHV ( oạn 4.2) và phát hiện có KHV bằng một hay nhiều phƣơng pháp sau đây: a) Phát hiện KHV bằng PCR theo các phƣơng pháp đƣợc mô tả trong oạn 4.3.1.2.3 b) Phát hiện KHV trong các mô xử lý bằng các phƣơng cách của kháng thể đặc hiệu kháng KHV (nhƣ IFAT trên mẫu mô ép... đƣợc phát triển và công bố của Gray và cộng sự (14) Nếu mẫu mô thể hiện bằng chứng phân hủy thì nên sử dụng các bộ đoạn mồi nhắm đến các vùng ngắn hơn của gen di truyền, nhƣ các bộ đoạn mồi đƣợc phát triển bởi Hutoran và cộng sự (20) Cách khác, các bộ đoạn mồi mở rộng có thể đƣợc cải tiến đến các kết chuỗi mục tiêu ngắn hơn trong gen di truyền của KHV Giao thức chuẩn bị mẫu nêu chi tiết dƣới đây áp... Ly tâm các mẫu AND này trong 5 phút ở 18.000 g vii) Loại bỏ ethanol bằng sử dụng ống hút pipette và để phần trầm lắng khô trong không khí, bằng cách đặt nghiêng ống và để miệng ống mở, trong 5 phút viii) Tái hòa tan phần trầm lắng trong 50 µl nƣớc loại dùng cho xét nghiệm phân tử, đã làm ấm trƣớc đến 60oC, và ủ ở 60oC trong 5 phút Các mẫu AND này có thể đƣợc bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng Các lưu . 2.3.6. BỆNH DO HERPESVIRUS Ở CÁ CHÉP KOI (KOI HERPESVIRUS DISEASE) 1. Phạm vi Bnh do herpesvirus  cá chép koi (KHVD) là bnh nhim herpesvirus (18) có kh  gây. carpio), cá chép koi (koi carp: Cyprinus carpio koi) và cá chép ma (ghost carp: Cyprinus carpio goi), và xy ra  các lai ghép các loài cá này. Các lai ghép ca cá vàng (goldfish) x cá chép ng,. 6. (Các) khuyến cáo cho giám sát tập trung để tuyên bố sạch đối với bệnh do herpesvirus ở cá chép koi Giám sát tp trung s dng xuyên các v trí có các loài có mn cm. Các