1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HỮU LẠC THỦY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L., Amaryllidaceae) Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc Mã số: 62.73.15.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2014 2 Công trình được hoàn thành tại: ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. VÕ THỊ BẠCH HUỆ Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp tại: ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Vào ……. giờ ……. ngày ……. tháng …… năm ……. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện khoa học Tổng hợp TPHCM - Thư viện Đại học Y Dược TPHCM 3 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ 1. Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Nguyễn Hồng Thiên Thanh, Võ Thị Bạch Huệ (2013), Phân lập và xây dựng chất chuẩn crinamidin từ lá TNHC (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae), Tạp chí Dược học, số 441, tr. 38-41. 2. Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Lê Minh Thắng, Kiều Lê Thanh Thảo, Võ Thị Bạch Huệ (2013), Định lượng đồng thời 6 alcaloid (crinamidin, 6- hydroxycrinamidin, 6-hydroxypowellin, 6-hydroxybuphanidrin, undulatin, 6-hydroxyundulatin) từ cao chiết lá TNHC (Crinum latifolium) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, Tạp chí dược học, số 442, tr. 52-56. 3. Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Trịnh Thị Thanh Nhã, Phan Thanh Dũng, Võ Thị Bạch Huệ (2013), Xác định hàm lượng của astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC (Crinum latifolium) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản, Tạp chí dược học, số 443, tr. 53-58. 4. Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Quang Anh Nguyet (2011), “Influence of pH on the separation of Crinum latifolium alakloids by thin layer chromatography and column chromatography”, Conference proceeding, the 2nd analytica Vietnam conference 2011, pp 213-216. 5. Nguyen Huu Lac Thuy, Nguyen Dang Khoa, Nguyen Thi Ngoc Yen, Vo Thi Bach Hue (2011), “Extraction and preliminary screening for AChE inhibitor activity of Crinum latifolium L. leaves extracts”, Conference proceeding, The 2nd Analytica VietNam Conference 201, pp 249-254. 6. Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Le Quang Hanh Thu (2011), “Antioxidant activity of extracts from Crinum latifolium L., Amaryllidaceae”, Proceeding of The 7 th Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, pp 607-611. 7. Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Thi Ngoc Yen (2011), “Isolation and identification of alkaloidal composition from the roots of Crinum latifolium L. Amaryllidaceae by silica gel coated buffer on chromatographic column technique”, Proceeding of The 7 th Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, pp 600-603. 8. Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Thi Phuong Trang (2011), “Isolation and identification of isoquercitrin from the leaves of 4 Crinum latifolium L., Amaryllidaceae”, Proceeding of The 7 th Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, pp 604-606. 5 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề - Cây Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae) là dược liệu đang được sử dụng phổ biến như thực phẩm chức năng, hoặc dạng bào chế thuốc để điều trị các dạng u xơ tử cung, u tuyến tiền liệt. - Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây TNHC được nhiều tác giả quan tâm và có nhiều công trình đã công bố. Tuy nhiên các nghiên cứu về lĩnh vực kiểm nghiệm thì hạn chế hơn. DĐVN IV hiện vẫn chưa có chuyên luận cho cây TNHC. Do đó, công tác đảm bảo chất lượng của nguyên liệu và các chế phẩm có TNHC vẫn chưa được thực hiện một cách chặt chẽ. Nguyên nhân chủ yếu là do thành phần hóa học của dược liệu này vẫn chưa được công bố một cách toàn diện; chưa có công trình khoa học nào khẳng định chất đánh dấu và hoàn toàn chưa có bất kỳ chất đối chiếu (CĐC) có nguồn gốc từ dược liệu này được phân phối bởi hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia. Với mong muốn giải quyết các bất cập hiện tại trong công tác “Đảm bảo chất lượng” cho nguyên liệu TNHC, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và flavonoid cho cây Trinh Nữ Hoàng Cung – Crinum latifolium L., Amaryllidaceae” với các nội dung nghiên cứu như sau: 1. Chiết xuất cao cồn, các phân đoạn alcaloid, phân đoạn flavonoid và phân lập hợp chất tinh khiết từ cây Trinh nữ hoàng cung. 2. Thiết lập một số chất đối chiếu hóa học có nguồn gốc từ cây Trinh nữ hoàng cung. 3. Xây dựng quy trình định tính, định lượng alcaloid và flavonoid trong lá Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp HPLC và CE. 6 4. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu bột lá Trinh nữ hoàng cung. 2. Tính cấp thiết của đề tài: cho đến nay chưa có công trình khoa học nào xác định toàn diện thành phần hóa học cũng như chưa có tài liệu xác định các chất đánh dấu và chưa có quy trình định lượng đồng thời một số chất đánh dấu trong thành phần TNHC. Hệ thống kiểm nghiệm quốc gia chưa cung cấp bất kỳ CĐC nào có nguồn gốc từ TNHC. Tuy nhiên, thực tế thì cây TNHC đang được sử dụng rất phổ biến. Vì vậy các kết quả nghiên cứu của luận án có thể giải quyết được bất cập trong công tác quản lý và đảm bảo chất lượng của dược liệu cũng như các sản phẩm có thành phần TNHC. 3. Những đóng góp mới của luận án: Luận án đã đạt được một số kết quả mới, đóng góp vào công trình nghiên cứu cho cây TNHC như sau: 1. Ứng dụng phương pháp SFE vào chiết alcaloid từ TNHC. 2. Phân lập đươc 17 hoạt chất từ các bộ phận của TNHC. Trong đó có một alcaloid mới, cấu trúc là 6-ethoxyundulatin. Các hợp chất esculetin, 6-ethoxybuphanidrin, flazin và isoquercitrin được phân lập lần đầu tiên từ cây TNHC. 3. Thiết lập 6 CĐC: crinamidin, 6-hydroxycrinamidin, lycorin, hippadin, astragalin và isoquercitrin. Hiện tại, các CĐC này đều chưa được phân phối bởi hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia. 4. Xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu 4 quy trình phân tích alcaloid hoặc flavonoid bằng HPLC và CE. Các quy trình này đều chưa được công bố bởi bất cứ công trình nào trong nước và thế giới. 5. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm TNHC. Hiện tại DĐVN IV và Dược điển các nước đều chưa có chuyên luận này. 7 4. Bố cục luận án: có 120 trang chính: đặt vấn đề (2); chương 1: TQTL (24); chương 2: PPNC (13); chương 3: KQNC (62), chương 4 BL (16); kết luận (2); kiến nghị (1). Và danh mục công trình (1); TLTK (12). NỘI DUNG LUẬN ÁN Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU - Thực vật học cây TNHC: Tên khoa học: Crinum latifolium L., họ Thủy tiên Amaryllidaceae. Tên thông thường: Trinh nữ hoàng cung, Hoàng cung trinh nữ, Tỏi lơi lá rộng, Náng lá rộng. Đặc điểm hình thái: cỏ nhiều năm; thân hành, hình cầu, phía trên có thân giả ngắn do các bẹ lá ôm sát nhau làm thành. Phiến lá dạng bản, màu xanh nhạt, mép lượn sóng. Cụm hoa tán, có 10-20 hoa. Hoa đều, lưỡng tính, màu tím hồng. Nhị 6 rời nhau; màu trắng, bao phấn màu vàng 2 ô. Bầu hạ, 3 ô. Vòi nhụy dạng sợi. - Thành phần hóa học và tác dụng sinh học: Có các nhóm hoạt chất chính là alcaloid (36) và flavonoid (8); ngoài ra còn có nhóm coumarin, carbohydrat. Các tác dụng chính là kháng khối u, kháng viêm, kháng oxi hóa và kích thích miễn dịch. - Các phương pháp chiết hoạt chất và khảo sát hóa học Hoạt chất được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt, hoặc ngâm; hoặc đun hồi lưu. 8 Các hợp chất tinh khiết được phân lập bằng kỹ thuật sắc ký cột hoặc sắc ký lớp mỏng chế hóa. Thành phần alcaloid trong TNHC được xác định bằng phương pháp GC, UV, HPLC. - Phương pháp thiết lập chất đối chiếu: Theo hướng dẫn của ASEAN. Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu là các alcaloid và flavonoid trong cây TNHC. 2.2 Phương pháp nghiên cứu: 2.2.1. Các phương pháp chiết xuất: - Chiết ngấm kiệt, chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm: nghiên cứu các điều kiện dung môi, tỷ lệ dung môi/dược liệu. - Chiết bằng dung môi lỏng siêu tới hạn (SFE): khảo sát các yếu tố áp suất, thời gian, tỷ lệ dung môi hỗ trợ. 2.2.2. Phương pháp phân lập chất tinh khiết: - Sử dụng phương pháp sắc ký cột chân không và sắc ký cột cổ điển. - Biện giải cấu trúc bằng phương pháp phổ nghiệm UV, IR, MS, NMR. 2.2.3. Phương pháp HPLC, CE và dấu vân tay: Khảo sát các điều kiện để xây dựng quy trình định tính, định lượng alcaloid và flavonoid trong cây TNHC. Quy trình phải đạt các yêu cầu về thẩm định. - Quy trình xử lý mẫu: khảo sát quy trình chiết alcaloid và flavonoid từ lá TNHC (dung môi chiết, số lần chiết) và dung môi pha mẫu. - Phương pháp HPLC: khảo sát thành phần pha động, tỷ lệ và pH pha động, kỹ thuật rửa giải. 9 - Phương pháp CE: kỹ thuật điện di, dung dịch đệm (hệ đệm, nồng độ đệm, pH dung dịch đệm); nồng độ SDS. - Phương pháp dấu vân tay: - SKLM: khảo sát các điều kiện phân tích về dung môi và thuốc thử phát hiện để xác định các đặc trưng cơ bản của DVT– SKLM của hai nhóm hoạt chất chính alcaloid và flavonoid của TNHC qua hệ số R f và màu sắc của các vết đặc trưng. - HPLC: ứng dụng các điều kiện của phương pháp HPLC vào phân tích vân tay cho dược liệu TNHC. Ghi nhận thời gian lưu, phổ UV-Vis, % diện tích của các pic đặc trưng. Xác định DVT– HPLC của hai nhóm hoạt chất chính của TNHC. 2.2.4. Phương pháp thiết lập CĐC: Thực hiện theo hướng dẫn của ASEAN, ấn bản về quy trình thiết lập CĐC hóa học thứ cấp. 2.2.5. Đề xuất một số chỉ tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu TNHC: - Các chỉ tiêu hóa lý thông thường của dược liệu và phương pháp thực hiện theo hướng dẫn của DĐVN IV. - Chỉ tiêu định tính bằng bằng phương pháp dấu vân tay được khảo sát với 6 CĐC alcaloid hoặc 2 CĐC flavonoid đánh dấu. - Chỉ tiêu định tính và định lượng bằng phương pháp HPLC được khảo sát với 2 CĐC alcaloid hoặc 2 CĐC flavonoid đánh dấu. Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Các quy trình chiết cao cồn, alcaloid và flavonoid từ TNHC Chiết cao cồn, phân đoạn alcaloid và flavonoid bằng phương pháp ngấm kiệt: 10 - Chiết cao cồn: dược liệu được làm ẩm bằng dung môi khoảng 12 giờ. Cho dung môi ngập dược liệu 1- 2 cm, ngâm khoảng 24 giờ. Rút dịch chiết đến khi âm tính với TT Dragendorff và TT FeCl 3 1%. Tỷ lệ dung môi/dược liệu là (10 : 1). Gộp dịch chiết, lọc và cô đến cao đặc. - Chiết flavonoid: cao cồn được siêu âm với HCl 1%. Lắc với ethyl acetat đến khi âm tính với TT FeCl 3 1%. Gộp các dịch chiết ethyl acetat, thu hồi dung môi đến cao đặc chứa flavonoid. - Chiết alcaloid: dịch acid sau khi chiết flavonoid được kiềm hóa bằng amoniac 25% đến pH 9-10. Lắc với cloroform đến khi âm tính với TT Dragendorff, thu hồi dung môi đến cao đặc chứa alcaloid. Chiết alcaloid và flavonoid từ lá TNHC kết hợp 2 phương pháp: - Chiết alcaloid và flavonoid bằng phương pháp SFE: thiết bị là hệ thống chiết bằng lưu chất CO 2 do Đài loan sản xuất với ba bình chiết lắp song song, thể tích 20 lít/bình. Điều kiện SFE: áp suất 200 bar, nhiệt độ 50 o C, thời gian chiết 2 giờ, 15% cồn 96%. Dịch SFE được thu hồi dung môi (cao L- SFE). Cao L-SFE được hòa tan với HCl 1%. Dịch acid được chiết flavonoid FL-SFE và alcaloid AL-SFE. - Chiết alcaloid và flavonoid bằng phương pháp ngấm kiệt: bột lá sau khi chiết SFE được tiếp tục chiết ngấm kiệt với cồn 70%. Dịch chiết cồn được chiết flavonoid FL-NK và alcaloid AL-NK. 3.2 Phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao chiết TNHC - Các PĐ alcaloid và flavonoid được chiết từ các bộ phận của cây TNHC, sau đó tách PĐ bằng VLC và phân lập các hợp chất bằng CC. - Sử dụng chất hấp phụ là silica gel tẩm đệm pH 9 đối với mẫu phân lập alcaloid; silica gel pH 4 cho mẫu phân lập flavonoid. - Riêng 6-ethoxyundulatin (2) và 6-ethoxybuphanidirn (3) phải qua 3 giai đoạn: chiết lỏng – lỏng với ether ethylic để tách lấy nhóm kém [...]... 6ethoxyundulatin và 6-ethoxybuphanidirin 29 Luận án đã xây dựng được bộ dữ liệu phổ học cho 17 hợp chất từ cây TNHC, đặc biệt là dữ liệu phổ học của một hợp chất alcaloid mới được phân lập trong tự nhiên và 11 alcaloid thuộc khung crinin - khung alcaloid đại diện cho các loài trong chi Crinum 4.3 Thiết lập chất đối chiếu từ cao chiết TNHC: - Sau quá trình nghiên cứu, nhận thấy crinamidin, 6hydroxycrinmidin là 2 alcaloid; ... của TNHC 3 Thiết lập chất đối chiếu: - 6 hợp chất có nguồn gốc từ cây TNHC đạt yêu cầu CĐC hóa học thứ cấp với bộ dữ liệu gồm điểm chảy, phổ UV, IR, MS, NMR - Gồm 4 alcaloid: crinamidin, 6-hydroxycrinamidin, lycorin, hippadin và 2 flavonoid: astragalin và isoquercitrin 4 Quy trình định tính - định lượng alcaloid hoặc flavonoid: - Luận án đã xây dựng 4 quy trình định lượng alcaloid hoặc flavonoid trong... isoquercitrin là 2 flavonoid có thể được chọn làm các chất đánh dấu cho dược liệu TNHC Vì vậy các chất này được tiến hành đánh giá về quy trình chiết xuất, phân lập để thiết lập CĐC Các bước thực hiện theo hướng dẫn của ASEAN, ấn bản về quy trình thiết lập CĐC hóa học - Bên cạnh đó, lycorin và hippadin cũng được thiết lập CĐC do 2 hợp chất này có độ tinh khiết cao và hiệu suất phân lập lớn Lycorin là alcaloid. .. LUẬN 31 Luận án đã hoàn thành các nội dung nghiên cứu và đạt tất cả các mục tiêu đề ra ban đầu, tóm tắt các kết quả đạt được như sau: 1 Chiết xuất hoạt chất từ TNHC: xây dựng được 2 quy trình chiết xuất cao toàn phần từ TNHC - Quy trình 1 là quy trình chiết cao cồn, PĐ alcaloid hoặc flavonoid bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn 70% - Quy trình 2 có sự kết hợp 2 phương pháp SFE và ngấm kiệt để chiết cao... để khảo sát thành phần hóa học và thiết lập CĐC: Đối với nguyên liệu lá: mục tiêu là khảo sát toàn diện thành phần hóa học, phương pháp SFE được lựa chọn để chiết hoạt chất ở giai đoạn đầu và dược liệu sau đó được chiết ngấm kiệt Cao chiết sẽ đa dạng hơn về thành phần do dung môi chiết trãi rộng hơn về độ phân cực 28 Đối với nguyên liệu rễ hoặc thân hành: kết quả khảo sát cho thấy SFE cho hiệu quả... đã được xây dựng và thẩm định đạt các yêu cầu của một quy trình phân tích định lượng Đây là ưu điểm của tiêu chuẩn kiểm nghiệm vì HPLC là phương pháp có độ chính xác cao, được khuyến khích ứng dụng vào kiểm nghiệm các mẫu đa thành phần như mẫu sinh học hay mẫu từ dược liệu Phương pháp dấu vân tay với các chi tiết đặc trưng cho thành phần hoạt chất của TNHC sẽ góp phần đánh giá chặt chẽ hơn chất lượng... định tính bằng phương pháp dấu vân tay và chỉ tiêu định lượng bằng phương pháp HPLC với các CĐC đánh dấu đặc trưng cho TNHC KIẾN NGHỊ Các kết quả nghiên cứu đạt được là cơ sở khoa học để thực hiện các nội dung nghiên cứu sâu hơn cho dược liệu TNHC: 1 Từ kết quả các chất đối chiếu đã được thiết lập, các quy trình phân tích đã được thẩm định và các tiêu chuẩn kiểm nghiệm đã được báo cáo trong nội dung... hành sắc ký đối với dung dịch đối chiếu Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic astragalin và isoquercitrin không được lớn 2,0% Tiến hành sắc ký lần lượt dung dịch thử và dung dịch đối chiếu Dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch đối chiếu và nồng độ astragalin (C21H20O11) và isoquercitrin (C21H20O12) đối chiếu, tính... 6-hydroxypowellin - 9 hợp chất đã được công bố trước đây từ TNHC: hippadin, augustamin, lycorin, undulatin, crinamidin, 6-hydroxybuphanidrin, 6hydroxyundulatin, 6-hydroxycrinamidin và astragalin 3.3 Thiết lập chất đối chiếu - Các hợp chất có độ tinh khiết cao, khối lượng khoảng 500 mg và là chất đánh dấu của cây TNHC được chọn để thiết lập CĐC - 6 nguyên liệu được chọn để thiết lập CĐC: 4 alcaloid là crinamidin,... hoặc flavonoid 20 Mẫu đối chiếu alcaloid: crinamidin (98,71%), 6hydroxycrinamidin (96,75%), 6-hydroxypowellin (98,56%), 6-hydroxyundulatin (99,66%), undulatin (98,50%) và 6-hydroxybuphanidrin (98,65%) Mẫu đối chiếu flavonoid: astragalin (98,28%), isoquercitrin (98,15%) Cafein (100,01%) và quercetin (91,4%) là chuẩn nội của quy trình CE 3.4.1 Quy trình xử lý mẫu - Mẫu thử alcaloid: cân 10 g bột lá cho vào . hóa học, thiết l p chất đối chiếu và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và flavonoid cho cây Trinh Nữ Hoàng Cung – Crinum latifolium L. , Amaryllidaceae” với các nội dung nghiên. 9 6,7 3 9 9,9 9 10 0,0 0 9 8,3 0 9 8,1 3 5 9 8,7 3 9 6,7 4 9 9,9 3 10 0,0 0 9 8,3 0 9 8,0 9 6 9 8,7 6 9 6,7 5 9 9,9 5 9 9,9 9 9 8,2 9 9 8,1 0 7 9 8,7 0 9 6,7 2 9 9,9 1 10 0,0 0 9 8,3 1 9 8,1 5 8 9 8,7 4 9 6,7 6 9 9,9 8 10 0,0 0 9 8,2 5 9 8,1 1 9 9 8,7 1. DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HỮU L C THỦY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, THIẾT L P CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID VÀ