51 chuyển sang màu nâu đỏ. Ngoài ra, Hoy và ctv. (1999) đã chứng minh rằng nồng độ vi khuẩn có trong dịch chiết cũng có thể ảnh hưởng đến khả năng lan truyền và gia tăng dịch bệnh sau khi chủng. Kết quả được trình bày trong bảng 4.2 còn cho thấy mức độ nhiễm bệnh sau khi chủng của các cây khác nhau trong cùng một bụi không giống nhau. Cụ thể trong bụi 3, tỉ lệ bó mạch đỏ của cây được quan sát sau 30 ngày là 92 %, tỉ lệ này tăng lên đến 92,1 % ở cây quan sát sau 45 ngày và 94 % ở cây quan sát sau 60 ngày. Trường hợp tương tự cũng xảy ra trong quá trình khảo sát bụi 4, bụi 6, bụi 7 cho thấy sự đáp ứng đối với vi khuẩn của các cây khác nhau trong cùng một bụi có thể không giống nhau. Theo Brumbley và ctv. (2006), hiện nay vẫn chưa biết được sự tắc mạch là do sản phẩm của vi khuẩn tạo ra, do cơ chế đáp ứng của cây trồng, hay là do sự kết hợp của cả hai. Sau quá trình quan sát dưới kính hiển vi điện tử, Kao và Damanm (1978) đã nhận thấy sự cư trú của vi khuẩn ở bên trong các hốc của mạch gỗ, gần với thành tế bào và đôi khi tồn tại cả bên trong thành tế bào. Sự liên kết giữa tế bào vi khuẩn và các cơ chất ở đây là nguyên nhân dẫn đến sự tắt nghẽn tại các mạch gỗ của cây. Năm 1980, các tác giả đã kiểm tra mẫu mô mía bị bệnh dưới kính hiển vi và nhận thấy sự hiện diện của vi khuẩn trong các bó mạch, quản bào, nhu mô, và các kẽ hở của mạch mộc (trích dẫn bởi Monteiro – Vitorello, 2004). 4.3. Thí nghiệm 3: Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx Dịch chiết sử dụng để phân lập vi khuẩn Lxx được thu nhận tương tự như trong thí nghiệm 2. Sau đó, tiến hành lọc dịch chiết qua màng lọc 0,45 m và cấy trãi dịch chiết trên môi trường thạch SC và MSC. Sau 28 – 42 ngày ủ ở 28°C, chúng tôi ghi nhận được sự xuất hiện của 11 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc mang các đặc điểm giống như mô tả của Davis (1980): có đường kính 0,1 – 0,3 mm, hình tròn lồi, có rìa và không có sắc tố. Các khuẩn lạc này được cấy chuyền tiếp tục trên môi trường thạch MSC và SC để thu nhận khuẩn lạc thuần. Tuy nhiên, sau 3 ngày ủ ở 28 C, chỉ có 8 dòng khuẩn lạc vẫn duy trì các đặc điểm của khuẩn lạc ban đầu, các dòng này được tiếp tục cấy chuyền sang môi trường thạch SC và MSC; sau đó, tăng sinh trong môi trường lỏng S8 để thu sinh khối. 52 Lxx là một loại vi khuẩn rất khó nuôi cấy. Do vi khuẩn Lxx không tạo ra các triệu chứng đáng tin cậy ở bên ngoài hay bên trong cây mía nên sự nhầm lẫn rất dễ xảy ra trong quá trình thu thập mẫu. Hơn nữa, dưới điều kiện tưới tiêu đầy đủ hoặc trong mùa mưa, triệu chứng cằn cỗi của bệnh có thể giảm xuống đến mức không thể nhận thấy (Brumbley và ctv., 2006). Ngoài ra, Lxx chỉ có thể phát triển trên môi trường nuôi cấy SC (Davis và ctv., 1980) hoặc MSC (Brumbley và ctv., 2006), đây là hai loại môi trường rất phức tạp. Bên cạnh đó, thời gian nuôi cấy đối với loại vi khuẩn này thường rất dài (28 – 42 ngày). Do môi trường nuôi cấy rất giàu dinh dưỡng lại được ủ trong thời gian dài nên sự tạp nhiễm rất dễ xảy ra; để hạn chế điều này, nalidixic acid được bổ sung vào môi trường nuôi cấy qua màng lọc nitrocellulose (0,2 m). Brumbley và ctv. (2006) đã chứng minh rằng vi khuẩn Lxx có khả năng kháng lại nalidixic acid nhưng nó nhạy cảm cao đối với ampicillin (100 g/mL); tetracycline (2 g/mL) và kanamycin (50 g/mL). Năm 2002, Brumbley và ctv. đã chứng minh rằng để vi khuẩn phát triển một cách hiệu quả trong môi trường lỏng cần gia tăng nồng độ của KH 2 PO 4 và glucose, giảm nồng độ của K 2 HPO 4 và cystein trong môi trường S8 được đề nghị bởi Davis và ctv. (1980). Nhiều công trình nghiên cứu về sinh học phân tử đã được thực hiện nhằm giải thích sự khó phát triển của vi khuẩn Lxx trên môi trường nhân tạo. Bộ gen của Leifsonia xyli subsp. xyli Brazillian (CTCB07) đã được giải trình tự hoàn chỉnh bởi nhóm di truyền môi trường và nông nghiệp (AEG) Brazil. Vi khuẩn Lxx có bộ gen dài 2,6 Mb, có tỉ lệ G – C là 68 % và chứa khoảng 2022 khung đọc mở (open reading frame); trong đó thiếu các gen trao đổi chất và sinh tổng hợp acid amine, đặc biệt là gen sinh tổng hợp cystein và methionin nên chúng trở nên rất khó nuôi cấy. Monteiro – Vitorello và ctv. (2004) đã tiến hành thí nghiệm và phát hiện rằng sự phát triển của vi khuẩn sẽ nhanh hơn nếu bổ sung cysteine và methionine vào môi trường nuôi cấy. Năm 2004, Monteiro – Vitorello và ctv. đã tiến hành phân tích trình tự nhiễm sắc thể của vi khuẩn Lxx và phát hiện có một số lượng lớn pseudogen (gen khuyết). Pseudogen là các đoạn gen được hình thành do sự xê dịch khung đọc mở, sự mất 53 nucleotide hoặc do các đột biến điểm dẫn tới sự thừa hoặc thiếu các codon kết thúc và tạo ra các gen không hoàn chỉnh (Monteiro – Vitorello và ctv., 2004), theo tác giả đây chính là sự thoái hóa về mặt di truyền trong quần thể Lxx. Ông cũng cho rằng sự thoái hóa này được xảy ra bởi quá trình thích nghi kí chủ và phổ kí chủ hẹp; các pseudogen của Lxx đã được xác định bao gồm 51 gen mã hóa transposase, các gen cần thiết cho sự biến dưỡng galactose và glutarate, các gen cần cho sự tổng hợp cystein và methionine, 20 gen gây bệnh và gây độc; số lượng lớn các gen rối loạn chức năng giải thích sự kém chịu đựng về dinh dưỡng của Lxx, qua đó, lý giải tại sao loại vi khuẩn này chỉ sống được trong bó mạch của cây mía và rất khó nuôi cấy. Gillaspie và Teakle (1989) nhận thấy rằng vi khuẩn Lxx có thể xâm nhiễm vào các loài cây thân cỏ khác (bắp, cỏ voi, cỏ kê, cỏ tranh, cỏ lồng vực) trong thí nghiệm chủng, nhưng chưa bao tìm thấy khuẩn lạc Lxx ở các loài thân cỏ này một cách tự nhiên hay sự hiện diện của Lxx một cách tự do trong môi trường. Brumbley và ctv. (2006) đã kết luận rằng bộ gen của Lxx cũng mã hóa một vài sản phẩm cho phép chúng chống lại cơ chế phản vệ của cây chủ và sống sót được trong bó mạch của cây chủ như các mầm bệnh thực vật khác. Chẳng hạn như các gen mã hóa cho hai enzyme phân giải vách tế bào - pectinase và cellulase (Monteiro - Vitorello và ctv., 2004). Theo Kao and Damann (1978), các gen này có thể liên quan đến sự hút chất dinh dưỡng từ bó mạch và cũng có thể khởi đầu việc sản xuất chất kết dính làm bít bó mạch dẫn của cây bị bệnh. Ngoài ra, Monteiro - Vitorello và ctv., (2004) cho rằng các gen này còn có thể liên quan đến sự tổng hợp hormone acid abscisic ở thực vật, đây là một chất ức chế tăng trưởng có thể liên quan đến sự cằn cỗi và làm giảm lượng chồi trên cây mía bị nhiễm bệnh cằn mía gốc (trích dẫn bởi Brumbley và ctv., 2006). 4.4. Thử nghiệm sinh hóa bƣớc đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc Dịch vi khuẩn nuôi cấy tăng sinh trong môi trường lỏng S8 từ thí nghiệm 3 được sử dụng để tiến hành các thử nghiệm sinh hóa nhằm phát hiện sơ bộ vi khuẩn Lxx. 54 Các kết quả thử nghiệm sinh hóa đối với 8 dòng vi khuẩn đã phân lập được trình bày trong bảng 4.3, hình ảnh minh họa được trình bày trong hình 4.4. Bảng 4.3. Bảng kết quả của các thử nghiệm sinh hóa đối với 8 dòng vi khuẩn đã phân lập đƣợc Dòng vi khuẩn phân lập được Xác định Gram Phản ứng Manitol Sorbitol Catalase Amylase Casein Dòng 1 + + + + - - Dòng 2 + + - + - - Dòng 3 + - - - - - Dòng 4 + - - - - - Dòng 5 + + + + + - Dòng 6 + - - - ND - Dòng 7 + + + + ND + Dòng 8 + - - - ND + ND: không xác định được do các dòng vi khuẩn này không phát triển thành khuẩn lạc trên các môi trường thử nghiệm sinh hóa. Do vi khuẩn Lxx có kích thước rất nhỏ (0,25 - 0,35 x 1 - 4 m, đôi khi dài đến 10 m) nên không thể quan sát được dưới kính hiển vi quang học thông thường mà đòi hỏi phải sử dụng kính hiển vi nền tối hoặc kính hiển vi đối pha ở độ phóng đại X 1000 (Davis và Bailey, 2000). Do đó, phương pháp nhuộm để xác định Gram không thích hợp đối với Lxx, chúng tôi tiến hành xác định Gram của 8 dòng vi khuẩn phân lập được bằng dung dịch KOH 3% (Malcolm và Charles, 1997). Thử nghiệm khả năng lên men nhằm xác định nguồn carbon được vi khuẩn sử dụng trong quá trình tăng trưởng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng hai loại nguồn carbon là manitol và sorbitol. Khi vi khuẩn có khả năng lên men, các sản phẩm hữu cơ được tạo ra (rượu, acid hữu cơ và CO 2 ) đều làm giảm pH của môi trường dẫn đến sự đổi màu của chất chỉ thị pH trong môi trường. Vi khuẩn có khả năng sinh acid khi chỉ thị đỏ phenol trong môi trường chuyển thành màu vàng; ngược lại, vi khuẩn không có khả năng sinh acid khi chỉ thị đỏ phenol trong môi trường không đổi màu (Trần Linh Thước, 2003). 55 56 Theo bảng 4.3, chúng tôi nhận thấy chỉ có 4 dòng vi khuẩn (1, 2, 5, 7) từ 8 dòng vi khuẩn phân lập được cho kết quả dương tính với manitol; 5 dòng vi khuẩn (2, 3, 4, 6, 8) cho kết quả âm tính với sorbitol. Kết quả thử nghiệm catalase cho thấy 4 dòng (1, 2, 5, 7) dương tính; chỉ có 2 dòng (1, 2) cho phản ứng âm tính với amylase. Trong phản ứng casein, hầu hết các dòng vi khuẩn phân lập được đều cho kết quả âm tính (ngoại trừ dòng 7, 8). Đối chiếu bảng kết quả 4.3 với bảng phụ lục 6, chúng tôi nhận thấy trong 8 dòng vi khuẩn phân lập được chỉ có dòng 2 có thể là vi khuẩn Lxx. Để giải thích kết quả trong bảng 4.3, có 2 giả thiết được đặt ra. Một là trong dịch chiết đem nuôi cấy không có sự hiện diện của vi khuẩn Lxx, điều này có nghĩa là phương pháp nhuộm STM cho kết quả dương tính giả trong quá trình phát hiện bệnh. Nói cách khác, phương pháp STM là phương pháp không hiệu quả trong chẩn đoán bệnh cằn mía gốc. Hai là có sự tạp nhiễm xảy ra trong quá trình nuôi cấy hoặc ủ vi khuẩn. Giả thiết thứ nhất được loại bỏ do phương pháp nhuộm STM là một phương pháp thông dụng đã được thừa nhận bởi nhiều nhà khoa học trên thế giới (Hà Đình Tuấn, 2004). Theo Giglioti và ctv. (1999), phương pháp nhuộm STM là phương pháp hiệu quả để phát hiện bệnh cằn mía gốc, dựa vào tỉ lệ bó mạch tắc và bó mạch thông trong thân mía người ta có thể xác định, đánh giá mức độ nhiễm bệnh của cây trên cánh đồng. Từ kết quả khảo sát ở thí nghiệm 1, chúng tôi đã tiến hành thu nhận dịch chiết từ lóng 1 (lóng có mật độ vi khuẩn lớn nhất) của cây mía ở trong bụi có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất. Cây mía được chọn thuộc giống VN85-1427, đây là giống có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất trong 5 giống mía sản xuất được trồng tại Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, tỉnh Bình Dương (C90-127, VN84- 4137, DLM24, R570, VN85-1427). Kết quả khảo sát của Nguyễn Anh Khoa (2006) về tình hình nhiễm bệnh cằn mía gốc trên các giống mía khác nhau tại Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, tỉnh Bình Dương cho thấy vào thời điểm khảo sát, giống mía VN85-1427 đã bị nhiễm Lxx ở mức trung bình. Từ đó, có thể khẳng định rằng vi khuẩn Lxx vẫn tồn tại và ngày càng phát triển trên giống mía này vì cho đến nay, vẫn chưa có biện pháp xử lý và kiểm soát dịch bệnh cằn mía gốc nào được thực hiện tại Trung tâm. 57 Như vậy, trong 8 dòng vi khuẩn phân lập được chỉ có dòng 2 có thể là vi khuẩn Lxx, 7 dòng vi khuẩn còn lại là các dòng tạp nhiễm. Sự tạp nhiễm rất dễ xảy ra trong quá trình nuôi cấy do vi khuẩn Lxx chỉ có thể phát triển trên môi trường MSC hoặc SC sau thời gian ủ từ 28 – 42 ngày. Môi trường nuôi cấy rất giàu dinh dưỡng lại được ủ trong thời gian quá dài nên sự tạp nhiễm là vấn đề rất khó tránh khỏi. Bên cạnh đó, sự tạp nhiễm cũng có thể xảy ra trong quá trình thu nhận dịch chiết do ở thân mía có chứa hàm lượng đường cao, đây là điều kiện thuận lợi cho các loại vi khuẩn và nấm phát triển. Đối tượng nuôi cấy là một loại vi khuẩn kí sinh chuyên tính gây tắc bó mạch nên việc khử trùng thân mía rất khó khăn, trong thí nghiệm này, chúng tôi chỉ sử dụng cồn 70 vì nếu sử dụng các chất có tác dụng khử trùng bề mặt mạnh thì sự sống của vi khuẩn Lxx trong thân mía sẽ không đảm bảo. Theo bảng 4.3, cả 7 dòng vi khuẩn tạp nhiễm đều là vi khuẩn Gram dương. Do nalidixic acid chỉ có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn Gram âm nên sự xuất hiện của các loại vi khuẩn Gram dương khác trên môi trường nuôi cấy là điều không thể tránh khỏi. Ngoài ra, Brumbley và ctv. (2006) đã chứng minh rằng vi khuẩn Lxx có khả năng kháng lại nalidixic acid nhưng lại nhạy cảm cao đối với kháng sinh (ampicilin, tetracycline, kanamycin); do đó, không thể bổ sung các loại chất kháng sinh này vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lxx. Sự tạp nhiễm nấm và các loại vi khuẩn có kích thước lớn đã được hạn chế bằng cách lọc dịch chiết qua màng lọc 0,45 m. Tuy nhiên, phương pháp này không thể loại bỏ được các loại vi khuẩn có kích thước nhỏ khác cùng tồn tại trong dịch chiết, điều này lý giải tại sao 7 dòng vi khuẩn tạp nhiễm đều có kích thước và mô tả khuẩn lạc tương tự như mô tả khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx. Trong quá trình ủ, các loại vi khuẩn tạp nhiễm này sẽ phát triển rất nhanh trên môi trường giàu dinh dưỡng, qua đó, ức chế sự phát triển của vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli. 58 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây ra là một trong những bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng nhất đối với sản lượng mía nói riêng và ngành công nghiệp mía đường nói chung. Ở Việt Nam, bệnh cằn mía gốc đã được phát hiện từ lâu, tuy nhiên cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu cụ thể nào về căn bệnh nguy hiểm này. Qua quá trình tiến hành các thí nghiệm, chúng tôi đã rút ra được một số kết luận sau: Kết quả khảo sát sự phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo các lóng của cây mía bị bệnh cho thấy mật độ vi khuẩn tập trung cao nhất ở lóng thứ nhất (lóng gần gốc nhất), mật độ này có xu hướng giảm dần theo chiều cao cây. Ngoài ra, sự phân bố của vi khuẩn trong cùng một lóng tập trung chủ yếu ở phần lõi bên trong. Thời gian cần thiết để vi khuẩn Lxx gây tắc mạch là khoảng 30 ngày sau khi cây bị nhiễm bệnh. Trước khoảng thời gian này, không thể phát hiện được sự hiện diện của vi khuẩn ở trong bó mạch. Trong quá trình tiến hành nuôi cấy vi khuẩn Lxx, chúng tôi nhận thấy đây là một loại vi khuẩn kí sinh chuyên tính rất khó nuôi cấy, đòi hỏi môi trường dinh dưỡng phức tạp và thời gian nuôi cấy rất dài. Sau 28 – 42 ngày nuôi cấy, chúng tôi đã phân lập được 8 dòng khuẩn lạc có đặc điểm giống như mô tả khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx (đường kính 0,1 – 0,3 mm, hình tròn lồi, có rìa và không có sắc tố). Kết quả thử nghiệm sinh hóa cho thấy trong 8 dòng khuẩn lạc được phân lập thì chỉ có dòng 2 có khả năng là vi khuẩn Lxx. 5.2. Đề nghị Phương pháp nhuộm STM là một phương pháp hiệu quả để phát hiện bệnh cằn mía gốc. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ tiến hành được đối với những cây mía trên 3 tháng tuổi. Chính điều này làm cho việc quản lý bệnh trở nên rất khó 59 khăn. Do đó, cần nghiên cứu và phát triển một quy trình chẩn đoán bệnh ngay từ khi cây còn nhỏ để có biện pháp xử lý kịp thời. Kết quả đạt được trong các thử nghiệm sinh hóa chỉ nhằm loại bớt những trường hợp không phải là vi khuẩn Lxx trong 8 dòng được phân lập chứ không thể xác định chính xác dòng nào là vi khuẩn Lxx. Do đó, cần phải tiến hành các thí nghiệm sinh học phân tử để xác định lại xem dòng 2 (dựa trên kết quả phản ứng sinh hóa) có phải là vi khuẩn Lxx hay không. Quá trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx rất khó khăn do đây là loại vi khuẩn ký sinh chuyên tính trong bó mạch của cây mía. Vi khuẩn Lxx chỉ có thể phát triển trên môi trường MSC hoặc SC sau thời gian 28 – 42 ngày, môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng lại được ủ trong thời gian dài nên sự tạp nhiễm rất dễ xảy ra. Vì vậy, cần phải thiết lập một quy trình nuôi cấy vô trùng hiệu quả nhằm hạn chế tối đa sự tạp nhiễm trên môi trường nuôi cấy. 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt 1. Bùi Trang Việt, 2002. Sinh lý thực vật đại cương. Phần I: Dinh dưỡng. Nhà xuất bản đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Trang 34, 67 – 75. 2. Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996. Chương 8: Cây mía. Giáo trình cây công nghiệp (Đoàn Thị Thanh Nhàn). Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. Trang 151 – 165. 3. Hà Đình Tuấn, 2004. Điều tra thành phần bệnh hại mía trên một số giống mới nhập nội và khảo sát diễn biến bệnh hại quan trọng ở vùng mía nguyên liệu miền Đông Nam Bộ. Luận văn thạc sĩ khoa học Nông Nghiệp, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 4. Nguyễn Anh Khoa, 2006. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kĩ thuật ELISA và bước đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kĩ thuật PCR. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Nguyễn Huy Ước, 1994. Kỹ thuật trồng mía. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. Trang 78 – 79. 6. Nguyễn Huy Ước, 1999. Cây mía và kĩ thuật trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. Hồ Chí Minh. Trang 11 – 16. 7. Trần Linh Thước, 2003. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 74 – 77, 216. 8. Trần Thùy, 1996. Kỹ thuật trồng mía. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. Hồ Chí Minh. Trang 4 – 8. 9. Trần Văn Sỏi, 2001. Kỹ thuật trồng mía ở vùng đồi núi. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội. Trang 3. 10. Trần Văn Sỏi, 2003. Cây mía. Nhà xuất bản Nghệ An. Trang 7. . Kết luận Bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây ra là một trong những bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng nhất đối với sản lượng mía nói riêng và ngành công nghiệp mía. TP. Hồ Chí Minh, Vi t Nam. 4. Nguyễn Anh Khoa, 20 06. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kĩ thuật ELISA và bước đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kĩ thuật PCR. Khóa luận tốt nghiệp. sự cằn cỗi và làm giảm lượng chồi trên cây mía bị nhiễm bệnh cằn mía gốc (trích dẫn bởi Brumbley và ctv., 20 06) . 4.4. Thử nghiệm sinh hóa bƣớc đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn