Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 9 Hình 2.4: Một số dạng hoa đẹp của giống Dendrobium. Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 10 III. Các phương pháp nhân giống. 3.1 Nhân giống ngoài thiên nhiên. 3.1.1 Nhân giống vô tính. a. Tách bụi: đây là phương pháp đã được các nghệ nhân sử dụng đối với các giống lan đa thân như Cattleya, Dendrobium, Cymbidium, Paphiopelium…ở Cattleya, Dendrobium, và những giống tương tự: ở mỗi gốc của giả hành thường có ít nhất một mắt ngủ nên có thể tách mỗi hành giả thành một đơn vò để trồng. b. Chiết cành: ở Dendrobium thường tạo ra cây con trên giả hành (Keiki) một cách tự nhiên. Khi các cây con này khá mạnh, có rễ tốt, có thể tách ra khỏi giả hành để trồng. 3.1.2 Nhân giống hữu tính. a. Sự thụ phấn: Trong thiên nhiên sự thụ phấn ở lan do côn trùng thực hiện. Cấu trúc của hoa lan là hoàn toàn để thích ứng cho sự thụ phấn ấy. Có hai phương pháp thụ phấn: - Sự tự thụ phấn: Khi phấn hoa của bông hoa này được rơi vào nuốm của chính hoa ấy. Điều này hiếm khi xảy ra trong tự nhiên ở hoa lan vì cấu trúc của bộ phận sinh dục đực và cái ở hoa lan. - Sự thụ phấn chéo: Khi phấn hoa ở hoa này được để vào nuốm của hoa khác của cùng cây hay cùng loài (thường xảy ra trong thiên nhiên do côn trùng thực hiện), hoặc khác loài, khác giống (thường do con người thực hiện). b. Quả lan: Nếu sự thụ phấn có kết quả, thì có thể ngay trong ngày hay sang ngày hôm sau, các phiến hoa xụ lại nhưng không rụng. Và để trành sự thụ phấn khác do côn trùng người ta dùng bao nilong trùm hoa lại, nhưng không buộc kín miệng vì hầm hơi sẽ làm hư trái. Sau khi thụ phấn, bầu noãn từ từ trương phù to ra thành trái. Mỗi trái có thể chứa hàng ngàn hay đến cả triệu hột. Khi tr từ màu xanh lục chuyển sang màu vàng lục thì nên hái trái. c. Gieo hạt: Trong thiên nhiên muốn hạt lan nẩy mầm thì hạt lan phải được nhiễm một loại nấm kí sinh. Người ta đã khám phá ra một số loài nấm giúp nẩy mầm ở hạt lan, mỗi loài chỉ giúp nẩy mầm một số giống lan mà thôi. - Rhizoctonia repens giúp nảy mầm ở Cattleya, Laelia, Angraecum, Cypripedium (Paphiopedilum). Download» http://Agriviet.Com Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 11 - Rhizoctonia mucoroides giúp nẩy mầm ở Vanda, Phalaenopsis. - Rhizoctonia lanugiosa giúp cho hột nẩy mầm ở Oncidium, Odontoglossum và Miltonoa [16]. 3.2 Nhân giống trong phòng thí nghiệm. Trong phòng thí nghiệm lan Dendrobium được chúng tôi nhân giống bằng phương pháp gieo hạt in-vitro. Trong thiên nhiên, vì hột lan quá nhỏ, không chứa chất dự trữ và chỉ có một phôi chưa phân hóa, nên không thể phát triển theo một phương cách bình thường được và vì vậy mà việc cho hột lan nẩy mầm và phát triển thành cây lan trưởng thành là vấn đề khó khăn. Người trồng lan đã tìm nhiều cách gieo hạt nhưng không thành công. Năm 1922, Knudson ở Mỹ, thành công trong việc thay thế nấm bằng đường ở môi trường thạch để gieo hạt [16]. Phương pháp này có nhiều ưu điểm như: - Kết hợp với kỹ thuật lai giống tạo ra nhiều giống lan mới cung cấp cho thò trường. - Giúp bảo tồn các loài lan quý, và nhân nhanh số lượng giúp cho công tác bảo tồn. IV. Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật. Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác đònh ở điều kiện vô trùng [5]. Kỹ thuật in vitro dựa trên nguyên lý là tế bào thực vật có tính toàn thể, nghóa là từ một mô, một cơ quan hoặc một tế bào của bất kỳ bộ phận nào của cây đều có thể phát triển thành một cây hoàn chỉnh nếu được nuôi trong môi trường thích hợp [6]. 4.1 Điều kiện nuôi cấy tế bào thực vật. a. Yêu cầu cơ bản nhất của phòng nuôi cấy mô là phải đảm bảo vô trùng. Khái niệm vô trùng này bao gồm vô trùng môi trường nuôi cấy và cả sự bảo đảm sao cho mẫu nuôi cấy được hoàn toàn vô trùng. b. Các yêu cầu cơ bản của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật: - Khi thiết lập phòng nuôi cấy mô thực vật phải đảm bảo được tính liên tục thuận lợi cho các thao tác, các giai đoạn trong suốt quá trình nuôi cấy mô. - Đảm bảo được vệ sinh (tính vô trùng) của sản phẩm cuối cùng. - Chuẩn bò môi trường đúng cách, chọn đúng môi trường cho từng loại thực vật và từng giai đoạn nuôi cấy. - Chọn và xử lý mô thích hợp trước khi cấy [7]. Download» http://Agriviet.Com Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 12 c. Các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy bao gồm: nước, muối khoáng (đa lượng và vi lượng), nguồn cacbon, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng, agar (đối với môi trường rắn) [14]. - Nước: nước dùng trong môi trường nuôi cấy là nước cất, hoặc nước khử ion, tốt nhất là nước cất hai lần từ các máy cất nước hoàn toàn bằng thủy tinh. - Đường: tạo nguồn cacbon giúp mô tổng hợp nên cacbohydrat cho cây mà không phải do quanh hợp của mô cây tạo nên; đường sử dụng phổ biến là saccarose (1-6% w / v ), glucose (2% w / v ). - Các muối khoáng đa lượng: nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi một lượng nhất đònh các nguyên tố đa lượng như N, P, K, Ca, Mg, S, Fe, … - Các muối khoáng vi lượng có vai trò quan trọng trong đời sống thực vật. Chúng tham gia vào các quá trình sinh hóa trong tế bào, tham gia vào trung tâm hoạt tính của enzyme và vitamin, tăng tính chống chòu của thực vật với các điều kiện môi trường bất lợi. Các vi lượng thông dụng là Mn, B, Zn, Cu, Co, I, nồng độ sử dụng trong môi trường rất thấp. - Vitamins: chủ yếu myo-inositol, acid nicotinic, puridoxin HCl (B 6 ), thiamin HCl (B 1 )…Các vitamin dễ bò hỏng do nhiễm tạo nên cần giữ ở t 0 < 0 0 C [9]. - Chất điều hòa tăng trưởng: tùy theo từng mục đích nuôi cấy có thể chọn các nồng độ và tổ hợp các nồng độ và tổ hợp các chất điêu hòa sinh trưởng phù hợp. Các chất điều hòa sinh trưởng thường dùng là IAA, NAA, 2,4D, Kinetin, BAP, IBA…[14] - Agar(đối với môi trường đặc): là một polisacarit làm từ rong biển. Agar tan ở 100 0 C và khi nguội sẽ đông đặc lại. Hàm lượng sử dụng từ 8-10g/l tùy hãng chế tạo[10]. d. Nhiệt độ, ánh sáng và pH ảnh hưởng đến quá trình cấy: - Nhiệt độ: nhiệt độ của phòng nuôi cấy thường được điều chỉnh ổn đònh từ 22-25 0 C. ở mỗi tế bào thực vật khác nhau thì nhiệt độ nuôi cấy cũng khác nhau [5]. - nh sáng: có ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái cây nuôi cấy. Các yếu tố ảnh hưởng bao gồm: cường độ, chu kỳ, thành phần quang phổ ánh sáng. Cường độ ánh sáng từ: 1000- 2500 lux được dùng phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại mô [5]. - pH: là một yếu tố quan trọng. Sự ổn đònh pH môi trường là yếu tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào. Để điều chỉnh Download» http://Agriviet.Com Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 13 pH môi trường có thể dùng dung dòch 10% hoặc 1N NaOH hoặc 1N HCl [14]. 4.2 Kỹ thuật gieo hạt trong ống nghiệm. a. Đặc điểm của hạt lan. Không giống những loại hạt khác, hạt lan rất nhỏ, như hạt bụi và không chứa nguồn dự trữ thức ăn. Trong tự nhiên, hạt có thể nẩy mầm nhưng sẽ không phát triển nếu không có sự tác động của nấm mycorrhizal [22]. Loại nấm này tiêu hóa các vật chất hữu cơ trên cây chủ hoặc trong đất, chuyển hóa thành các đường đơn giản giúp hạt lan nẩy mầm và giúp phôi phát triển [23]. Khi hạt lan đã nẩy mầm, nó sẽ tạo ra một lượng lớn các tế bào không phân hóa được gọi là protocorm. Nếu tất cả đều tốt, protocorm sẽ tiếp tục trong vài tuần, vài tháng, thậm chí cả năm tùy loài, cho đến khi đủ lớn để tạo thân và rễ. các loài lan đất, duy trì mối quan hệ cộng sinh này rất quan trọng trong suốt giai đoạn đầu tiên của cây, vì protocorm nằm dưới đất nên không thể tự tổng hợp thức ăn. các loài lan phụ sinh, protocorm thường xanh, và vì thế nó có thể tự tổng hợp được một ít thức ăn [22]. b. Khử trùng trái lan. Việc khử rùng trái lan có thể thực hiện theo hai phương pháp: - Quả lan sau khi mổ ra, hạt thu được trước khi đem gieo cần tuyển chọn các hạt chắc, các hạt lép không thụ tinh cần phải loại bỏ đi bằng cách đem ly tâm trong nước cất; các hạt lan tốt sẽ lắng phía dưới ống nghiệm, hạt lép nổi lên trên, được gạn bỏ đi. Các hạt tốt được tiếp tục khử trùng bằng Hypochlorite de calcium 10%. Sau đấy, cho hạt lan và nước khử trùng vào ống nghiệm, vừa đủ phủ kín hạt lan, lắc mạnh, đều và để yên trong vòng 10 phút, sau đó đổ nước khử trùng ra bằng ống hút, và tiếp tục rửa hạt lan 3 lần bằng nước cất vô trùng. Cuối cùng hạt lan đã khử trùng sẽ được gieo vào các bình chứa môi trường. - Khi quả lan đã được cắt trên cây, mang vào phòng thí nghiệm, cần để nơi sạch sẽ, thoáng mát. Nếu chưa gieo hạt ngay thì có thể giữ quả trong tủ lạnh, trong vòng 3-4 ngày. Khi gieo hạt, trước tiên quả lan cần cắt bỏ các cuống dài, đuôi còn sót lại các lá đài, cánh hoa…Dùng bông gòn có tẩm alcol 70 0 để lau toàn bộ mặt ngoài của quả. Một khi vào tủ cấy vô trùng, quả lan sẽ được: - Nhúng vào alcol 90-96 0 , trong 1 phút, hơ nhanh qua ngọn lửa. - Nhúng vào Hypochlorite de calcium 10%, trong 10 phút, rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng. Download» http://Agriviet.Com Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 14 Sau đấy quả lan sẽ được cắt gọt hai đầu, và dùng dao mổ xẻ dọc quả lan (mổ hai đường đối diện nhau), tách làm hai quả lan, kế đến dùng pince và dao mổ để giữ lấy tất cả các hạt có trong hai nửa quả lan, bằng cách gõ nhẹ lên phần ngoài của vỏ quả. Nếu sự thụ tinh tốt, tất cả các hạt sẽ có màu vàng và đều rơi xuống một đóa petri dùng để hứng lấy hạt. Sau đó người ta sẽ dùng muỗng hoặc một dụng cụ inox dùng để gieo hạt vào các bình chứa môi trường [8]. c. Kỹ thuật gieo hạt trong ống nghiệm: hạt sẽ nẩy mầm trong ống nghiệm bằng thủy tinh hay bằng nhựa trên môi trường rắn có chứa đường và các loại chất khoáng cần thiết để hạt nẩy mầm và phát triển. Đối với lan có hai kiểu nẩy mầm cơ bản: nẩy mầm cần nấm cộng sinh và nẩy mầm không cộng sinh. - Trong kiểu nẩy mầm cộng sinh, hạt được gieo với một lượng nhỏ nấm mycorrhizal thích hợp. Nấm này sẽ phát triển trên môi trường, bao phủ các hạt nẩy mầm và mối quan hệ cộng sinh xuất hiện sẽ duy trì sức sống của protocorm cho đến khi nó tạo ra lá và có khả năng tự dưỡng. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để nhân giống các loại lan đất ở vùng ôn đới. Kỹ thuật này có lợi thế là môi trường sử dụng rất đơn giản (một trong những dạng phổ biến chỉ bao gồm bột yến mạch và một ít dòch chiết nấm men), và cây sinh ra thường khỏe hơn và có khả năng để kháng với các tác động của nấm tốt hơn cây đối chứng nẩy mầm không cần nấm. Kỹ thuật này có một nhược điểm là cần phải có một chủng nấm mycorrhizal thuần khiết, hoặc quan hệ cộng sinh không phát triển, hoặc trở thành ký sinh và hạt gieo sẽ chết. Có rất ít nghiên cứu thực hiện về các loài nấm mycorrhizal ở các loài lan nhiệt đới, nên kỹ thuật này ít được áp dụng. - Kiểu nẩy mầm không cộng sinh thường được sử dụng để nhân giống các loài lan nhiệt đới. Môi trường sử dụng phức tạp hơn bao gồm các muối khoáng, các chất hữu cơ và đường với một lượng thích hợp để hạt lan nẩy mầm mà không cần nấm [22]. d. ng dụng của việc gieo hạt. - Gia tăng lượng hoa lan trên thò trường - Nhân giống các loài lan hiếm nhằn nhân nhanh số lượng cả trong tự nhiên và trong các chương trình bảo tồn. - Cung cấp cây con để bán, giúp hạn chế sự khai thác cây hoang dại, kích thích sự quan tâm của công chúng và tạo nguồn thu ngân sách. - Kết hợp với kỹ thuật lai giống tạo ra những cây lan khỏe mạnh có màu sắc đặc biệt [22]. Download» http://Agriviet.Com Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 15 V. Các công trình ngiên cứu gieo hạt lan trong ống nghiệm. 5.1 Trong nước: Dương Công Kiên và cộng sự nghiên cứu lai tạo và gieo hạt lan Dendrobium trong ống nghiệm [8]. 5.2 Ngoài nước: Năm 1844, Neumann, một người Pháp làm vườn, đã làm nẩy mầm một số hột lan bằng cách rải đại các hột lan trên các cục đất ở quanh gốc của các cây lan lớn. Năm 1899, Noel Bernard, nhà thực vật người Pháp, đã khám phá ra bí mật của việc nẩy mầm ở hột lan khi ông khảo sát các hột Neottia nidus-avis nẩy mầm tự nhiên trong rừng. Năm 1904, ông cộng tác với Burgeff để đưa ra phương pháp gieo hột lan có nhiễm nấm trong chai thạch [16]. Năm 1909, Hans Burgeff đã làm nẩy mầm được Laeliocattleya trên môi trường dinh dưỡng gồm 0,33% saccarose (đường mía). Năm 1922, Lewis Knudson đã làm nẩy mầm Cattleya mossiae trên môi trường Pfefferds 1% saccarose (đường mía) [11]. VI. Mục đích gieo hạt lan Dendrobium trong ống nghiệm. Hình 2.5: Quả lan Dendrobium. Các nhà trồng lan không ngừng tìm kiếm các giống lan mới để thõa mãn sự hiếu kì của mình hoặc có thể đem bán. Có hai cách để có được giống lan mới. Một là, sưu tập những giống lan hoang dại trong rừng đem về thuần hóa, tạo các điều kiện nhân tạo giống tự nhiên để cây lan có thể ra hóa. Phương pháp này gặp nhiều rủi ro do điều kiện môi trường không thuận lợi cho cây lan phát triển. Hai là, tạo ra những giống lan lai mới, cây lan lai sẽ mang những đặc tính tốt vựơt trội của cả bố mẹ, có thể thỏa mãn được nhu cầu của người thưởng thức lan. Tuy nhiên khi hai cây lan lai với nhau đạt kết quả và tạo trái cần phải kết hợp với phương pháp gieo hạt trong ống nghiệm để hạt lan có thể nẩy mầm dễ dàng. Có như vậy mới có thể kiểm tra kết quả của việc lai hai cây lan. Đối với một số giống lan quý cần phải bảo vệ thì phương pháp gieo hạt trong ống nghiệm giúp bảo tồn giống, nhân nhanh số lượng cây mà vẫn đảm bảo được tính ổn đònh di truyền. Download» http://Agriviet.Com Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Vật liệu – Phương pháp SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 16 PHẦN III: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP I. Vật liệu và điều kiện gieo hạt trong ống nghiệm. 1.1 Mẫu quả gieo hạt. Vật liệu là quả lan Dendrobium lai dài từ 4-5 cm lấy từ cây ngoài thiên nhiên, tại vườn thầy Dương Công Kiên, quận 12, thành phố Hồ Chí Minh. 1.2 Môi trường nuôi cấy. Môi trường Knudson C (1946), bổ sung thêm: - Nước dừa 15%. - Than hoạt tính 0.5g/l, tùy theo mục đích thí nghiệm. - Đường 30g/l. - Agar 8,5 g/l. - pH = 5.7 – 6. Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962), bổ sung thêm: - Nước dừa 15%. - Than hoạt tính 0.5g/l, tùy theo mục đích thí nghiệm. - Glycin 0.5g/l - myo-Inositol 0.1mg/l - Đường 30g/l. - Agar 8,5 g/l. - pH = 5.5 – 5.7. Sử dụng chai thủy tinh 100 ml và 500 ml để nuôi cấy. Tất cả môi trường được hấp khử trùng ở 1atm, 121 0 C trong thời gian 20 phút. 1.3 Điều kiện nuôi cấy. Thí nghiệm được thực hiện từ ngày 20/01/2005 đến ngày 26/05/2005, tại công ty Văn Thành Tài, 114 Hồng Hà, Quận Tân Bình, Thành phố Hồ Chí Minh, với các điều kiện nuôi cấy như sau: - Nhiệt độ phòng nuôi: 24-28 0 C. - Cường độ chiếu sáng: 2000-3000 lux. - Thời gian chiếu sáng: 8 giờ/ngày. - Ẩm độ trung bình: 60-70%. Download» http://Agriviet.Com Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Vật liệu – Phương pháp SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 17 II. Hướng đi của đề tài. Đối với đề tài, chúng tôi hướng mục đích nhân giống lan Dendrobium lai bằng phương pháp gieo hạt in-vitro nhằm: - Cung cấp giống lan mới cho các phòng nuôi cấy mô. - Tạo ra cây con khỏe, sạch bệnh, để trồng ra vườn ươm. - Kiểm tra kết quả lai. Với thời gian quá ngắn, từ nguyên liệu ban đầu là quả lan, chúng tôi chỉ có thể thực hiện được các giai đoạn: - Khử trùng quả. - Nhân protocorm. - Ra rễ. III. Bố trí thí nghiệm: 3.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng quả a. Mục đích thí nghiệm: - Tìm phương pháp khử trùng thích hợp. - Tìm nồng độ Hypochloride calcium Ca(OCl) 2 và thời gian khử trùng thích hợp đối với quả lan. - Theo dõi biểu hiện của hạt. b. Phương pháp và hóa chất sử dụng: - Phương pháp đốt cồn. - Phương pháp hóa chất: dùng Ca(OCl) 2 . c. Bố trí thí nghiệm: - Mẫu lấy từ thiên nhiên. - Rữa mẫu dưới nước chảy khoảng 10 phút. - Rửa mẫu bằng xà phòng pha loãng. - Rửa lại nhiều lần bằng nước cất. Chuyển mẫu vào tủ cấy vô trùng. - Rửa mẫu bằng cồn 70 0 trong 1-2 phút. - Rửa mẫu lại bằng nước cất vô trùng khoảng 2-3 lần. - Ngâm mẫu trong Ca(OCl) 2 và thường xuyên lắc mẫu. - Rửa lại mẫu nhiều lần bằng nước cất vô trùng khoảng 3-4 lần cho thật sạch. - Nhúng vào cồn 90 0 và hơ nhanh qua ngọn lửa. - Nhanh chóng đặt quả lan vào đóa petri vào đậy nắp lại. Download» http://Agriviet.Com . Miltonoa [16]. 3 .2 Nhân giống trong phòng thí nghiệm. Trong phòng thí nghiệm lan Dendrobium được chúng tôi nhân giống bằng phương pháp gieo hạt in-vitro. Trong thiên nhiên, vì hột lan quá nhỏ,. SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 10 III. Các phương pháp nhân giống. 3.1 Nhân giống ngoài thiên nhiên. 3.1.1 Nhân giống vô tính. a. Tách bụi: đây là phương pháp đã được các nghệ nhân. 20 05 Vật liệu – Phương pháp SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 17 II. Hướng đi của đề tài. Đối với đề tài, chúng tôi hướng mục đích nhân giống lan Dendrobium lai bằng phương pháp gieo hạt