Chương 4 1 CHƯƠNG 4: THAO TÁC VỚI DNA TINH KHIẾT Trước hết, chuẩn bị mẫu DNA tinh khiết.Bước tiếp theo trong một thí nghiệm tách dòng gen là xây dựng phân tử DNA tái tổ hợp.Để tạo ra phân tử tái tổ hợp này, vector cũng như DNA được tạo dòng, phải được cắt tại những điểm riêng biệt và sau đó nối lại với nhau một cách có kiểm soát.Cắt và nối là hai vídụ về kĩ thuật thao tác DNA, gồm nhiều kỹ thuật đã được phát triển trên nhiều năm qua.Khi được cắt và nối, phân tử DNA có thể ngắn lại, dài ra, sao chép thành RNA hoặc thành phân tử DNA mới và được sửa chữa bằng việc thêm vào hoặc lấy đi những nhóm hóa học đặc biệt.Tất cả những thao tác này có thể được thực hiên trong một ống nghiệm, ngoài việc cung cấp nền tảng cho tách dòng gen,nó còn sử dụng cho những nghiên cứu cơ bản trong sinh hóa học DNA, cấu trúc gen và kiểm soát biểu hiện gen. Hầu hết các kỹ thuật thao tác DNA đều sử dụng enzyme tinh khiết. Các enzyme này tham gia vào các quá trình thiết yếu bên trong tế bào như sao chép DNA và dịch mã, phá vỡ các phân tử DNA không mong muốn hoặc DNA ngoại lai (ví dụ DNA virú xâm nhập vào) sửa chữa các DNA bị biến đổi và tái tổ hợp (recombination) giữa các DNA khác nhau.Sau khi được tinh sạch từ tế bào, các enzyme này có khả năng thực hiện những phản ứng tự nhiên (sẵn có) của chúng hoặc những phản ứng có quan hệ gần gũi với chúng, trong điều kiện nhân tạo.Mặc dù những phản ứng enzyme này khá dễ hiểu, nhưng khi thực hiện chúng không thể xảy ra hoàn toàn như các phương pháp hóa học chuẩn.Vì vậy, những enzyme này giữ vai trò quyết định trong kỹ thuật di truyền và một ngành công nghiệp quan trọng xuất hiện làm công việc chuẩn bị enzyme, mô tả đặc tính enzyme và tiếp thị chúng.Các công ty điều chế enzyme tinh khiết cao đã cung cấp cho các nhà sinh học phân tử các nhu cầu cần thiết Thao tác cắt và nối trong tách dòng gen được thực hiện bởi những enzyme được gọi là restriction enzyme (dùng để cắt) và ligase ( để nối).Trong chương này hầu hết sẽ liên quan đến những cách thức sử dụng hai loại enzyme này.Tuy nhiên, trước hết phải xem toàn bộ vùng DNA enzyme thao tác để xác định chính xác kiểu phản ứng gì có thể được thực hiện.Những chương sau sẽ mô tả cách thức sử dụng những loại enzyme này. 4.1 VÙNG ENZYME THAO TÁC Những enzyme này có thể được nhóm thành 5 loại lớn phụ thuộc vào loại phản ứng mà chúng xúc tác 1. Nucleases: là những enzyme cắt, làm ngắn lại hoặc suy thoái phân tử DNA. 2. Ligases: nối các phân tử acid nucleic lại với nhau. 3. Polymerases: sao chép các phân tử. 4. Nhóm enzyme sửa chữa(Modifying enzymes): cắt bỏ hoặc thêm vào các nhóm hóa học. 5. Topoisomerases: phá vỡ hoặc tạo ra hiện tượng xoắn đoạn DNA vòng Trước khi xem xét chi tiết từng loại enzyme, cần làm 2 điểm sau. Đầu tiên chia Chương 4 2 mỗi enzyme thành 1 loại cụ thể, trong một số trường hợp enzyme cũng có thể thuộc hai hay nhiều hơn một loại.Quan trọng nhất, nhiều polymerase có khả năng xúc tác để tạo thành những phân tử DNA mới hoặc sửa chữa enzyme.Thứ hai, nên hiểu rõ rằng, cũng như những enzyme thao tác trên DNA, người ta cũng đã biết những enzyme tương tự có khả năng hoạt động trên RNA. Sử dụng ribonuclease để loại bỏ những RNA tạp nhiễm khi chuẩn bị DNA mẫu là một ví dụ của enzyme.Mặc dù một số enzyme thao tác trên RNA được ứng dụng trong tách dòng gen và sẽ được đề cập ở những chương kế tiếp, chúng ta sẽ giới hạn những hiểu biết vào những enzyme hoạt động trên DNA. 4.1.1Nucleases Nuclease phân hủy phân tử DNA bằng cách bẻ gãy cầu nối phosphodiester liên kết giữa hai nucleotide trong cùng một mạch.Có hai loại nucleotide riêng biệt(hình 4.1) Hình 4.1 Phản ứng xúc tác của hai loại nuclease khác nhau (a).Exonuclease phân hủy nucleotide từ ngoài vào. (b)Endonuclease bẻ gãy cầu nối phosphodiester từ bên trong. 1. Exonucleases, phân hủy lần lượt từng nucleotide từ điểm bắt đầu của phân tử DNA. 2. Endonucleases, phá vỡ cầu nối phosphodiester bên trong phân tử DNA. Điểm khác biệt chủ yếu giữa các loại exonuclease là số mạch được phân hủy khi enzyme này tấn công vào phân tử mạch đôi. Enzyme Bal31 (tinh chế từ vi khuẩn Alteromonas espejiana) là một ví dụ của exonuclease. Enzyme này phân hủy các nucleotide của cả hai sợi của phân tử mạch đôi.(Hình 4.2(a)) Hình 4.2 . Phản ứng xúc tác của các loại exonuclease khác nhau. (a) Bal31 thủy phân nucleotide của cả hai mạch của phân tử mạch đôi. (b) Exonuclease III, từng nucleotide một từ đầu 3’. Thời gian để Bal31 phân hủy phân tử DNA càng nhiều, càng tạo ra nhiều đoạn DNA có kích thước ngắn.Mặt khác, những enzyme như exonuclease III(E.coli) chỉ phân hủy một mạch của phân tử mạch đôi, sản phẩm tạo ra bao gồm cả phân tử mạch đơn không bị phân hủy. Việc phân loại endonuclease cũng theo cách trên.Endonuclease S1 (từ nấm Aspergillus oryzae) chỉ phân hủy mạch đơn của phân tử DNA mạch đôi (Hình 4.3(a)), trong khi deoxyribonucleotide I (Dnase I) được lấy từ tụy bò cắt cả hai mạch đơn và đôi (hình 4.3 (b)). DNase I không đặc hiệu. Nó tấn công vào DNA tại bất kì cầu nối phosphodiester từ bên trong, kết quả là tạo ra hỗn hợp gồm nhiều mononucleotide và những đoạn oligonucleotide ngắn.Mặt khác, một nhóm enzyme đặc biệt gọi là Chương 4 3 restriction endonucleases chỉ phân hủy DNA mạch đôi tại những vị trí nhất định.(hình 4.3(c)).Những enzyme quan trọng này được mô tả chi tiết ở trang 60. Hình 4.3 Phản ứng xúc tác của các loại endonuclease khác nhau. (a) Nuclease S1, chỉ phân hủy DNA mạch đơn, gồm những vị trí cắt chính trên một mạch của phân tử mạch đôi. (b)DNase I, cắt cả DNA mạch đơn và đôi. (c) Restriction endonuclease, cắt DNA mạch đôi tại một số vị trí giới hạn. 4.1.2 Ligases: Chức năng của ligase trong tế bào là sửa chữa những mạch đơn bị đứt (gián đoạn) trong quá trình sao chép DNA.Ở hầu hết các cơ thể, DNA ligase sẽ nối hai đoạn riêng lẻ của phân tử DNA mạch đôi lại với nhau.(hình 4.4).Vai trò của các enzyme này sẽ được mô tả ở trang 77) Hình 4.4 Hai phản ứng được xúc tác bởi DNA ligase. (a) Sửa chữa một điểm gián đoạn, một cầu nối phosphodiester bị thiếu ở một mạch của phân tử mạch đôi. (b) Nối hai phân tử lại với nhau. 4.1.3. Polymerases: DNA polymerases là những enzyme tổng hợp nên một mạch mới của phân tử DNA từ mạch khuôn (template) DNA hoặc RNA (hình 4.5(a)).Hầu hết những polymerase này chỉ thực hiện chức năng khi mẫu có một vùng mạch đôi bị đứt.Những polymerase này sẽ hoạt động như một primer để khởi đầu cho quá trình trùng hợp. Có 3 loại DNA polymerase được dùng thường xuyên trong kỹ thuật di truyền. Loại thứ nhất là polymerase I, được tách chiết từ E.coli.Loại enzyme này tấn công vào một vùng mạch đơn ngắn (hay “nick”) trên một vùng lớn DNA mạch đôi, sau đó tổng hợp một mạch đơn hoàn toàn mới, phá hủy mạch hiện tại trong tiến trình sao chép (hình4.5(b)). Vì vậy, DNA polymerase I là một ví dụ về tính hoạt động kép của enzyme : sự tổng hợp DNA và sự phân hủy DNA. Thực tế, hoạt tính polymerase và nuclease của DNA polymerase I được kiểm soát bởi các phần khác nhau của phân tử enzyme.Hoạt tính nuclease nằm trong 323 amino acid đầu tiên của chuỗi polypeptide, vì vậy việc loại bỏ đoạn này tạo ra một enzyme bổ sung.Enzyme này vẫn giữ lại chức năng trùng hợp (polymerase) nhưng không có khả năng phân hủy DNA.Enzyme bổ sung này, được gọi là Klenow fragment, vẫn có thể tổng hợp một mạch DNA bổ sung với mạch đơn khuôn, nhưng vì không có hoạt tính nuclease nên nó không thể tiếp tục tổng hợp để lấp đầy đoạn nick (hình 4.5(c).Có Chương 4 4 một vài enzyme khác, những polymerase tự nhiên và những kiểu(bản sao) bổ sung có khả năng thực hiện những chức năng giống nhau.Những ứng dụng chủ yếu của đoạn Klenow và những polymerase dạng này là trong giải trình tự DNA.(trang 192). Loại thứ ba của DNA polymerase, rất quan trọng trong kỹ thuật di truyền, là reverse transcriptase, enzyme liên quan đến sự tái tạo của một vài loại virus. Reverse transcriptase là enzyme duy nhất sử dụng khuôn là RNA (hình4.5(d)).Khả năng tổng hợp một mạch DNA bổ sung từ khuôn RNA của enzyme này là trung tâm của kỹ thuật cDNA cloning(trang 167). Hình 4.5 Phản ứng xúc tác của DNA polymerase. (a) Phản ứng cơ bản:một mạch DNA mới được tổng hợp từ đầu 5’ đến đầu 3’. (b) DNA polymerase I, đầu tiên lấp đầy những đoạn nick, sau đó tổng hợp nên một mạch mới, phân hủy những đoạn hiện tại trong quá trình thực hiện phản ứng tổng hợp. (c) Đoạn Klenow, chỉ lấp đầy đoạn nick. (d) Sự phiên mã ngược (Reverse transcriptase), sử dụng khuôn là RNA. 4.1.4 Enzyme sửa chữa DNA Có nhiều enzyme sửa chữa phân tử DNA , bằng cách gắn thêm vào hoặc loại bỏ những nhóm hóa học đặc biệt.Quan trọng nhất bao gồm các enzyme sau: 1. Alkaline phosphatase (từ E.coli hoặc mô ruột của bê), loại bỏ nhóm phosphate hiện diện ở đầu 5’(5’- terminus) của phân tử DNA (hình 4.6 (a)). 2. Polynucleotide kinase (từ E.coli bị nhiễm T4 phage, có tác động ngược với Alkaline phosphatase, thêm vào các nhóm phosphate ở đầu 5’ tự do (hình 4.6 (b)). 3. Terminal deoxynucleotidyl transferase (từ tuyến giáp của bê), thêm vào một hoặc nhiều deoxynucleotide từ đầu 3’(3’-terminus) của phân từ DNA.(hình 4.6 (c)). 4.1.5 Topoisomerases Loại cuối cùng của các enzyme thao tác DNA là topoisomerases, có khả năng thay đổi cấu tạo của các DNA mạch vòng khép kín (ví dụ DNA plasmid) bằng việc đưa vào hoặc loại bỏ các sợi siêu xoắn (trang 39). Mặc dù rất quan trọng trong những nghiên cứu sao chép DNA, người ta vẫn chưa tìm thấy tính hữu dụng thật sự của topoisomerase trong kỹ thuật di truyền. Hình 4.6 Phản ứng xúc tác của các enzyme sửa chữa DNA. (a) Alkaline phosphatase, loại bỏ nhóm 5’- phosphate . (b) Polynucleotide kinase, gắn vào nhóm 5’-phosphate. Chương 4 5 (c) Terminal deoxynucleotidyl transferase, gắn các nucleotide vào đầu 3’ của chuỗi polynucleotide của cả phân tử mạch đơn (i) cũng như phân tử mạch đôi(ii). 4.2 CÁC ENZYME THUỘC ENZYME CẮT GIỚI HẠN DNA Việc tách dòng gene đòi hỏi phân tử DNA phải được cắt theo kiểu rất chính xác và có thể sinh sản được.Kiểu cắt này được minh họa trong hình 4.7 (a),vị trí vector được cắt trong quá trình xây dựng phân tử DNA tái tổ hợp.Mỗi phân tử vector phải được tách tại những vị trí đơn độc để mở vòng, nhờ đó DNA mới được chèn vào;một phân tử được cắt nhiều hơn một lần sẽ tạo ra hai hoặc nhiều đoạn riêng biệt, sẽ không được dùng trong tách dòng gen.Hơn nữa, mỗi phân tử vector phải được cắt một cách chính xác tại cùng một vị trí trên vòng tròn (sẽ được trình bày rõ hơn ở chương sau), sự chia tách ngẫu nhiên sẽ không thỏa đáng.Cũng nên hiều rõ rằng các loại nuclease đặc biệt rất cần thiết để thực hiện thao tác này. Thường, các enzyme này rất cần thiết để tách phân tử DNA cần được tạo dòng (hình 4.7 (b)).Có hai lý do cho sự cần thiết này.Thứ nhất, nếu mục đích là tạo dong một gen riêng lẻ, có thể chỉ bao gồm 2-3 kb của DNA, sau đó gen này phải được cắt bớt vùng lớn (> 80 kb) của phân tử DNA quá dài, bằng cách sử dụng khéo léo các kỹ thuật trong công việc chuẩn bị đã được mô tả ở chương 3.Thứ hai, phân tử DNA lớn phải được bẻ gãy một cách dễ dàng để tạo ra các đoạn đủ nhỏ mà vector có thể mang được.Hầu hết các vector tách dòng thường tỏ ra ưu tiên hơn cho những đoạn DNA nằm trong vùng có kích cỡ đặc biệt; ví dụ các vector M13-based, rất không hiệu quả trong tách dòng các phân tử DNA có chiều dài lớn hơn 3 kb. Các restriction endonuclease tinh chế cho phép các nhà sinh học phân tử cắt DNA theo những cách thức rất chính xác và có thể sinh sản được ( những yêu cầu được đòi hỏi trong tách dòng gen).Việc khám phá ra những enzyme này đã đem lại giải Nobel cho W.Arber, H.Smith và D.Nathans năm 1978 và là một trong những chìa khóa chính cho sự phát triển kỹ thuật di truyền. Hình 4.7 Sự cần thiết của các thao tác cắt chính xác trong một thí nghiệm tách dòng gen. (a) Các phân tử vector:Mỗi phân tử vector phải được cắt một lần, tại cùng vị trí. (b) Phân tử DNA chứa gen được tạo dòng. 4.2.1 Sự khám phá và chức năng của enzyme cắt giới hạn Enzyme giới hạn được khám phá vào đầu những năm 1950 khi người ta phát hiện ra khả năng chống lại sự xâm nhiễm của virus ở một số giống vi khuẩn, một hiện tượng có liên quan đến host-controlled restriction. Cơ chế của sự giới hạn không quá phức tạp mặc dù phải tốn trên 20 năm để hiểu một cách đầy đủ.Sự giới hạn xảy ra bởi vì vi khuẩn sản xuất ra một enzyme phân hủy DNA vi rus trước khi nó có thời gian để sao chép tổng hợp trực tiếp những phần tử virus mới.(hình 4.8(a)).DNA của chính vi khuẩn, tất nhiên sẽ không bị phân hủy, Chương 4 6 được bảo vệ khỏi sự tấn công vì nó mang những nhóm methyl được thêm vào.Những nhóm methyl này sẽ ngăn cản hoạt động của enzyme phân hủy.(hình 4.8 (b)).Những enzyme phân hủy này được gọi là enzyme cắt giới hạn và được tổng hợp nhiều, có thể là ở tất cả các loài vi khuẩn; hiện nay có trên 1200 loài vi khuẩn khác nhau đã được mô tả.Ba loại khác nhau của enzyme cắt giới hạn đã được nhận dạng,mỗi loại được phân biệt bởi một phương thức hoạt động hơi khác nhau.loại I và loại III khá phức tạp và chỉ đóng một vai trò giới hạn trong kỹ thuật di truyền.Mặt khác, enzyme cắt giới hạn loại II là enzyme cắt quan trọng nhất trong tách dòng gen. Hình 4.8 Chức năng của enzyme cắt giới hạn trong tế bào vi khuẩn . (a) DNA phage bị phân cắt:phage tiêm DNA vào tế bào vi khuẩn; enzyme cắt giới hạn gắn vào DNA phage, DNA phage bị phân tách và bất hoạt. (b) DNA vi khuẩn không bị phân tách: Đoạn trình tự nhận biết được methyl hóa , vì vậy enzyme cắt giới hạn không thể gắn vào đoạn trình tự nhận biết. 4.2.2 Enzyme cắt giới hạn loại II căt DNA tại những trình tự nucleotide đặc biệt Nét đặc trưng cơ bản của enzyme cắt giới hạn loại II là mỗi enzyme có một trình tự nhận biết đặc biệt để cắt phân tử DNA.Một enzyme riêng biệt sẽ cắt DNA tại trình tự nhận biết và không cắt tại bất cứ vị trí nào khác. Ví dụ, enzyme cắt giới hạn được gọi là PvuiI (được ly trích từ Proteus vulgaris) chỉ cắt DNA tại hexanucleotide CGATCG.Trái lại, một enzyme thứ hai cũng từ vi khuẩn này, đươc gọi là PvuiII, cắt tại một vị trí hexanucleotide khác, trong trường hợp này là CAGCTG. Nhiều enzyme cắt giới hạn nhận biết vị trí đích là hexanucleotide, nhưng những enzyme khác cắt ở trình tự bốn, năm hoặc thậm chí tám nucleotide.Sau3A (từ giống Staphylococcus aureus 3A) cắt tại GATC và AluI (Arthrobacter luteus) cắt tại AGCT.Cũng có những ví dụ về enzyme cắt giới hạn với những trình tự nhận biết thoái hóa, nghĩa là nó cắt DNA tại bất kì một trong một họ các vị trí có liên quan.Ví dụ như, HinfI (giống Haemophilus influenzae R f ), nhận biết GANTC, vì vậy cắt tại GAATC, GATTC, GAGTC và GACTC. Trình tự giới hạn của một số enzyme cắt giới hạn thường được dùng nhất được liệt kê trong bảng 4.1 4.2.3 Đầu bằng và đầu dính Tính chính xác tự nhiên trong việc cắt của một enzyme cắt giới hạn được xem là điều quan trọng nhất khi thiết kế một thí nghiệm tách dòng gen.Nhiều enzyme cắt giới hạn tạo một vết cắt đơn giản trên mạch đôi, ở khoảng giữa của trình tự nhận biết.(hình 4.9(a)), kết quả tạo ra một đầu bằng hoặc đầu ngang (blunt).PvulII và AluI là những ví dụ về những enzyme cắt đầu bằng. Tuy nhiên, một số lượng khá lớn những enzyme cắt giới hạn cắt DNA theo cách hơi khác nhau.Những enzyme này không cắt DNA tại cùng một vị trí chính xác.Thay vào đó vị trí cắt được bố trí chệch nhau, thường từ hai hoặc bốn nucleotide, vì vậy kết quả tạo ra những đoạn DNA có một đoạn mạch đơn ngắn lồi ra ở mỗi đầu.(hình 4.9 Chương 4 7 (b)).Những đầu này được gọi là đầu dính (sticky) hoặc đầu cố kết, trong đó các cặp base giữa chúng có thể gắn kết trở lại với nhau thành phân tử DNA ban đầu. một đặc điểm quan trọng của enzyme cắt đầu bằng là những enzyme cắt giới hạn với những trình tự nhận biết khác nhau có thể tạo ra những đầu dính giống nhau.BamHI (trình tự nhận biết GGATCC) và BglII(AGATCT) là những ví dụ - cả hai đều tạo ra đầu dính GATC (hình 4.9 (c)).Những đầu dính giống nhau cũng được tạo ra bởi Sau3A, nhận biết chỉ với 4 nucleotide GATC.Những đoạn DNA được tạo ra từ sự phân cắt của các enzyme này có thể được nối với một đoạn khác nếu đoạn này có đầu dính mang trình tự bổ sung với đoạn đó. Hình 4.9 Các đầu được tạo ra bởi sự phân tách DNA của các enzyme cắt giới hạn khác nhau. (a) EnzymeAluI cắt tạo đầu bằng. (b) Enzyme EcoRI cắt tạo đầu dính. (c) Enzyme BamHI, BglII và Sau3A cắt tạo ra các đầu dính giống nhau. 4.2.4 Tần số của trình tự nhận biết trên phân tử DNA Số lượng trình tự nhận biết của một phân tử DNA riêng biệt được biết bằng việc tính toán chính xác chiều dài của phân tử đó.Một trình tự 4 nucleotide (ví dụ GATC), cứ sau 44 =256 nucleotide sẽ lặp lại một lần, và một trình tự 6 nucleotide(ví dụ GGATCC) cứ sau 46 = 4096 nucleotide sẽ lặp lại một lần.Những tính toán này giả định rằng các nucleotide này được sắp xếp theo kiểu tự do và bốn loại nucleotide khác nhau hiện diện với tỉ lệ bằng nhau (GC chiếm 50%). Trong thực tế, sự giả định này không hoàn toàn hợp lí.Ví dụ như, phân tử DNA λ 49 kb phải chứa 12 vị trí cho một enzyme cắt giới hạn có trình tự nhận biết 6 nucleotide.Thật ra những vị trí nhận biết này không xảy ra thường xuyên (ví dụ , 6 vị trí cho BglII, 5 vị trí cho BamHI và chỉ 2 vị trí cho SalI), theo thực tế thì số lượng GC chưa đến 50% ( hình 4.10 (a)). Hơn nữa, nhìn chung các vị trí nhận biết không đặt cách đều nhau dọc theo phân tử DNA.Nếu lúc đó các vị trí này được nhận biết bởi một enzyme cắt giới hạn riêng biệt, sẽ cho ra các đoạn có kích thước xấp xỉ nhau.Hình 4.10 (b) cho thấy các đoạn được tạo ra bằng việc cắt DNA λcủa các enzyme BglII, BamHI và SalI .Trong mỗi trường hợp có sự trải dài đáng kể về kích thước các đoạn DNA, điều này chỉ ra rằng các nucleotide trong phân tử DNA λ không được sắp xếp một cách ngẫu nhiên. Từ hình 4.10 chúng ta có thể thấy rằng, mặc dù những tính toán có thể đưa ra một khái niệm có bao nhiêu vị trí giới hạn được mong đợi trong một phân tử DNA cho trước, nhưng chỉ cần phân tích một thí nghiệm chúng ta có thể thấy được bức tranh thực sự. Vì vậy, chúng ta phải tiến hành xem xét cách sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phòng thí nghiệm. Hình 4.10 Sự giới hạn của phân tử DNA λ. (a) Các vị trí của trình tự nhận biết đối với BglII, BamHI và SalI. Chương 4 8 (b) Các đoạn được tạo ra do một trong những enzyme cắt giới hạn trên tạo ra; số cặp base chứa trong kích thước của các đoạn 4.2.5 Thực hiện một hệ thống giới hạn trong phòng thí nghiệm Ví dụ chúng ta sẽ xem xét cách để sắp xếp một mẫu DNAλ (nồng độ 125 µg/ml bằng BglII. Đầu tiên hút một lượng DNA cho vào trong ống nghiệm.Lượng DNA được giới hạn phụ thuộc vào bản chất của thí nghiệm; trong trường hợp này chúng ta sẽ cần 2 µg DNAλ, được cho vào 16 µl mẫu (hình 4.11(a)). Vì vậy cần phải có những micropipette với độ chính xác cao. Rõ ràng một thành phần chính khác trong phản ứng là enzyme cắt giới hạn, do các công ty thương mại cung cấp, là dung dịch tinh khiết với nồng độ đã biết.Nhưng trước khi thêm enzyme vào, dung dịch chứa DNA phải được điều chỉnh về điều kiện thích hợp để đảm bảo hoạt động tối ưu của enzyme.Hầu hết các enzyme hoạt động thích hợp ở pH 7.4, nhưng một vài enzyme khác thay đổi yêu cầu dựa trên cường độ ion (thường được cung cấp bởi NaCl)và nồng độ Mg2+ (tất cả các enzyme cắt giới hạn loại II đòi hỏi Mg2+ cho chức năng của chúng). Cũng cần thêm vào một nhân tố khử, như dithiothreitol, để ổn định enzyme và ngăn cản sự bất hoạt của chúng.Cung cấp điều kiện thích hợp cho enzyme rất quan trọng. Nếu nồng độ NaCl và Mg2+ không đúng, không những làm giảm hoạt tính enzyme cắt giới hạn mà còn có thể là nguyên nhân gây nên những biến đổi về tính chuyên biệt của enzyme, làm cho DNA bị cắt ở những trình tự nhận biết không chuyên biệt. Thành phần của một buffer thích hợp cho BglII đã được cho trong bảng 4.2.Nồng độ buffer này gấp 10 lần so với nồng độ làm việc, và được pha loãng bằng cách thêm vào hỗn hợp phản ứng.Trong ví dụ của chúng ta, thể tích cuối thích hợp cho hỗn hợp phản ứng là 20 µl, vì vậy ta thêm 2 µl của 10x BglII buffer vào 16 µl DNA đã được chuẩn bị sẵn. (hình 4.11(b). Bây giờ có thể thêm enzyme cắt giới hạn vào.Thông thường, 1 đơn vị enzyme được định nghĩa là số lượng enzyme cần thiết để cắt 1 µg DNA trong 1 giờ, vì vậy ta cần 2 đơn vị BglII để cắt 2 µg λDNA.BglII thường được sử dụng ở nồng độ 4 đơn vị/ µl, vì vậy 0,5 µl sẽ đủ để cắt DNA.Vì vậy, thành phần cuối cùng trong hỗn hợp phản ứng là 0,5 µl BglII + 1,5 µl nước, cho thể tích cuối cùng là 20 µl. (hình 4.11 (c)). Nhân tố cuối cùng được tính đến là nhiệt độ ủ.Hầu hết các enzyme cắt giới hạn, bao gồm BglII, hoạt động tốt nhất ở 37 o C, nhưng một số enzyme có yêu cầu khác.Ví dụ như TaqI,được tinh chế từ vi khuẩn Thermus aquaticus, quen sống ở nhiệt độ cao như suối nước nóng.Vì vậy khi sử dụng Taq phải ủ ở 65 o C để enzyme hoạt động tối đa. Sau 1 giờ sự hạn chế đã được hoàn thành.(hình 4.11(d)).Nếu các đoạn DNA tạo ra bởi sự giới hạn được sử dụng trong thí nghiệm tạo dòng, thì enzyme bằng cách nào đó phải được phá hủy để không hoạt động ngẫu nhiên trên các phân tử DNA được thêm vào ở sau giai đoạn tiếp theo.Có vài cách phá hủy enzyme.Ủ ở 70 o C trong thời gian Chương 4 9 ngắn là hiệu quả, hoặc chiết phenol hoặc thêm vào EDTA (kết hợp ion Mg2+ ngăn cản sự hoạt động của enzyme cắt giới hạn).(hình 4.11(e)). Hình 4.11 Thực hiện hoạt động giới hạn trong phòng thí nghiệm. Xem bài đọc chi tiết. 4.2.6 Phân tích kết quả cắt giới hạn: Tiêu hoá giới hạn sẽ tạo ra một số lượng những đoạn DNA, kích thước của chúng phụ thuộc vào vị trí trình tự xác định (hình 4.10). Một cách rõ ràng, việc xác định số lượng và kích thước những đoạn này thì cần thiết nếu như restriction endonuclease được sử dụng cho mục đích gene cloning. Một phân tử DNA được cắt thì được xác định dễ dàng bởi việc kiểm tra độ đậm đặc của dung dịch. Phân tử có kích thước lớn tạo ra dung dịch đậm đặc hơn kích thước nhỏ. Tuy nhiên việc tìm ra các đoạn cắt chuyên biệt thì khó khăn hơn. Thật ra, trong vài năm việc này gặp khó khăn đối với thí nghiệm liên quan đến DNA. Khó khăn này được giải quyết sớmnhững năm 70 khi kỹ thuật điện di được phát triển. (a) Sự phân tách những phân tử trên gel: Phân tử DNA cũng giống như protein và những phân tử sinh học khác có mang điện tích, chẳng hạn DNA mang điện tích âm. Khi DNA được dặt trong điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương (hìng 4.12a). Tốc độ di chuyển của ptử phụ thuộc vào hai yếu tố: hình dạng và tỉ lệ giữa khối lượng và điện tích. Hầu hết những ptử DNA có hình dạng giống nhau và tỉ lệ khối lượng/kích thước tương tự nhau. Vì thế, nững đoạn có kích thước khác nhau không phân tích được trên điện di chuẩn - Hình 4.12 Điện di chuẩn +(a)không phân tách đoạn DNA có kích thước khác nhau +(b) có Tuy nhiên, kích thước có ảnh hưỏng đến điện di trên gel. Gel là agarose, polyacrylamide, hoặc hỗn hợp với hệ thống mạng lưới các lỗ, xuyên qua đó những ptử DNA sẽ tiến về cực dương. Ptử nhỏ đi nhanh hơn, vì thế gel electrophoresic phân tách DNA phù hợp kích thước của chúng ( hình 4.12b) Thực tế thành phần gel xác định kích thước đoạn DNA phân tích. Tấm dày 0.5 cm với 0.5% agarose phân tách đoạn có kích thước từ 1-30kb, rõ nhất là từ 10-12kb. Tấm mỏng 0.3mm với 40% polyacrylamide, phân tách đoạn có kích thước nhỏ 1- 300bp, thậm chí đến một nu. (b) Phát hiện ptử DNA trên gel: (i) Nhuộm màu: Cách dễ nhất để xem kêt quả trên gel điện di là nhuộm gel. Dùng EtBr làm chất nhuộm, để nhuộm DNA trên gel agarose và polyacrylamide (hình 4.13). Sau đó các band sẽ được phát hiện dưới tia UV. (ii) Phóng xạ tự ghi của DNA được dánh dấu phóng xạ: Một điều bất lợi với việc nhuộm EtBr là giới hạn về độ nhạy. Nếu nồng độ DNA ít hơn 25 ng thì phát hiện bằng việc nhuộm là không chắc chắn. Do đó đòi hỏi có phương pháp nhạy hơn. Chương 4 10 Đó là pp phóng xạ tự ghi. Nếu DNA được đáng dấu trướ khi điện di bởi việc gắn một radioactive marker vào ptử DNA chuyên biệt, sau đó DNA có thể được phát hiện bởi việc đặt X-ray sensitive photographic film trên gel. DNA phóng xạ sẽ tiếp xúc với màng, bày ra mô hình band.(hình 4.14) Một ptử DNA được đáng dấu bởi việc gắn vào nu mang đồng vị phóng xạ phospho, 32 P (hình 4.15a). Vài phương pháp đã được thực hiện, pp phổ biến nhất là nick translation và end-filling. Nick translation đề cập đến hoạt động của DNA polymerase I. Hầu hết mẫu tinh khiết DNA thì chứa vài phtử nick, tuy nhiên việc chuẩn bị phải được tiến hành cẩn thận,vì vậy Dna polymerase I sẽ được gắn vào DNA và xúc tác cho phản ứng thay thế mạch. Phản ứng này đòi hỏi cung cấp nu, nếu một trong số được đánh dấu phóng xạ thì phân tử DNA trở nên được đánh dấu (hình 4.15b) Nick translation có thể được sử dụng để đánh dấu bât kỳ nhưng vài trường hợp khó khăn gây ra sự phân cắt DNA.End-filling là pp nhẹ nhàng, hiếm hki gây đứt gãy DNA, nhưng chỉ sử dụng để đánh dấu phân tử DNA có sticky end. Enzyme được sử dụng là đoạn Klenow, điền vào một sticky end bởi việc tổng hợp mạch bổ sung (hình 4.15c). Giống với nick translation, nếu phản ứng end- filling được tiến hành trong sự hiện diện của nu được dánh dấu thì ptử DNA trở nên được đánh dâú. Cả nick translation và end-filling có thể đánh dấu DNA như một sự mở rộng một số lượng rất nhỏ được xác định trên gel bằng phóng xạ tự ghi. Như nồng DNA độ ít 2 ng trên band có thể phát hiện. -Hình 4.13: việc phát hiện DNA trên gel agarose bởi nhuộm EtBr và chiếu tia UV -Hình 4.14: dùng phóng xạ tự ghi để phát hiện DNA được đánh dâu phóng xạ tren agarose gel -Hình 4.15: Đánh dấu phóng xạ +(a) Cấu trúc của [α -32 P]dATP +(b) Việc đánh dấu DNA bằng nick translation +(c) Việc đánh dấu DNA bằng end-filling 4.2.7 Đánh giá kích thước phân tử DNA: Điện di sẽ phân tách ptử DNA có kích thước khác nhau, việc di chuyển ptử nhỏ nhất xa nhất về phía cực dương. Nếu vài đoạn DNA có kích thước đa dạng được hiện diện thì có một dãy các band xuất hiện trên gel. Làm thế nào để kích thước những đoạn này có thể được xác định? Phương pháp chính xác nhất dùng mối quan hệ toán học liên quan giữa tốc độ di chuyển và trọng lượng phân tử. Hàm quan hệ là: D=a-b(logM) Trong đó: D: khoảng cách di chuyển; M: trọng lượng phân tử; a,b là hằng số phụ thuộc điều kiện điện di. Tuy nhiên, phương pháp ít chính xác hơn để đánh giá kích thước các đoạn DNA cũng được dùng. Sự tiêu hoá giới hạn, bao gồm các đoạn có kích thước đã biết [...]... điều này tạo ra sự rõ ràng từ thí nghiệm cẩn thận của cấu trúc trùng hợp (hình 4. 24a) Đầu 5’ mang nhóm phosphate, đầu 3’ mang nhóm OH (hình 4. 24b) Sau đó sẽ di n ra việc nối giữa 5’-P và 3’-OH (hình 4. 24c) -Hình 4. 22 Một khó khăn của việc dùng linker So sánh kết quả bmong muốn của BamHI được thể hiện trong hình 4. 21b -Hình 4. 23 Adaptor và tiềm năng của việc sử dụng (a) Một loại Adaptor (b) Hai adaptor... một vị trí không được phân cắt - Hình 4. 18 Sơ đồ giới hạn vi s dụ này thể hiện vị trí điểm của XbaI, XhoI, và KpnI trên phân tử -DNA có thể được xác định 4. 3 Nối phân tử DNA lại với nhau: 4. 3.1 Kiểu hoạt động của DNA ligase 11 Chương 4 Tất cả tế bào đều sản xuất ra DNA ligase, nhưng enzyme dùng trong công nghệ di truyền thì tinh khiết từ E.coli đã được nhiễm bởi phage T4 Trông tbào enzyme giữ chức năng... giới hạn vẫn cần - Hình 4. 24 sự tách biệt giữa đầu 3’ và 5’ (a) Cấu trúc một mạch polynu , phân biệt về mặt hoá học đầu 5’ và 3’ (b) Mạch đôi polynu song song ngược nhau (c) Nối đầu 5’ và 3’ lại với 13 Chương 4 Phân tử adaptor được tổng hợp đầu bằng giống DNA tự nhiên, nhưng sticky end thì khác 3’-OH của sticky end thường giống, nhưng đầu 5’-P thì được biến đổi, loại đi P vào OH ( hình 4. 25a) Kết quả... nối 2 phân tử một cách chính xác, sự không liên tục giống nhau thì sửa chữa và xác nhận Hai liên kết phosphodiester phải được thực hiện trên một mạch (Hình 4. 20a) - Hình 4. 20 Phản ứng nối bởi ligase (a) Nối đầu bằng (b) Nối phân tử so le 4. 3.2 Sticky end tăng hiệu quả nối Phản ứng nối trong hình 4. 20a thể hiện nối các đầu bằng Mặc dù pản ứng này có thể tiến hành trong các ống nghiệm nhưng nó không hiệu... hình 4. 21b chứa một hay nhiều trình tự nhận biết của BamHI Nếu có trường hợp này thì ptử đầu bằng sau đó bị cắt để tạo các sticky end (HÌnh 4. 22) P2 thứ hai là tạo sticky end trên ptử đầu bằng để tránh trường hợp này là Adaptor Adaptor giống như linker, là những oligonu ngắn được tổng hợp Tuy nhiên, không giống linker, một adaptor được tổng hợp đã có một sticky end (hình 4. 23a ) Ý tưởng là quá trình. . .Chương 4 được thể hiện trên gel điện di Sự phân cắt giới hạn của  DNA thường được dùng như những marker, Ví dụ,  DNA được phân cắt bởi HindIII tạo thành 8 đoạn kích thước đoạn ngắn nhất là 120bp, dài nhất là 23 kb Kích thước những này biết trước, kích thứơc những đoạn nay dùng trong thí nghiệm phân cắt có thể được đánh giá bởi sự so sánh các vị trí trên band (hình 4. 16) Mặc dù không... partial digestion, được tiến hành dướ những điều kiện mà tạo ra những đoạn chỉ một số lượng giới hạn vị trí cắt trên bất kỳ phân tử DNA nào Partial digestion đạt được bởi thời gian ủ ngắn vì thế các enzym không đủ thời gian để cắt tất cả các vị trí hoặc ủ ở nhiệt độ thấp (4 oC hơn là 37oC) , giới hạn hoạt động của enzyme Kết quả của partial digestion là tạo ra những kiểu band phức tạp trên điện di Cũng... dài hơn 20 nu sau đó khá ổn định tham gia giai đoạn tiếp theo của thí nghiệm tạo dòng -Hình 4. 26 Homopolymer tailing (a) tổng hợp homopolymer tailing (b) cấu trúc phântử DNA tái tổ hợp từ vector có đuôi được chèn DNA (c) sửa chữa DNA tái tổ hợp Ghi chú: có gì không hiểu các ban tham khảo tài liệu tiếng anh 14 Chương 4 15 ... DNA, việc tạo ra cấu trúc chuỗi được thực hiện ở hình 4. 21b Tuy nhiên, sự phân cắt bởi BamHI cắt chuỗi trên tại những trình tự xác định, việc tạo ra một số lượng lớn những linker được cắt và những đoạn DNA ban đầu và bây giờ là những BamHI Sticky end Những đoạn biến đổi này sẵn sàng cho việc nối trong tạo dòng vector được giới hạn bởi BamHI -Hình 4. 21 Những Linker và việc sử dụng chúng +(a) Cấu trúc... lượng và kích thước của những đoạn được tạo ra bởi các enzyme giới hạn phải được xác định trên điện di, sau đó có thể so sánh với kích thước đánh dấu (hình 4. 18) Sau đó, những thông tin này phải được bổ sung bởi double digestion là DNA được cắt bởi 2 enzyme giới hạn Điều này, có thể được thực hiện bởi double digestion trong một giai đoạn nếu cả những enzyme cos nhưng yêu cầu tương tự về pH, nồng độ Mg2+ . cấu trúc trùng hợp (hình 4. 24a). Đầu 5’ mang nhóm phosphate, đầu 3’ mang nhóm OH (hình 4. 24b). Sau đó sẽ di n ra việc nối giữa 5’-P và 3’-OH (hình 4. 24c). -Hình 4. 22 Một khó khăn của việc. hiện. -Hình 4. 13: việc phát hiện DNA trên gel agarose bởi nhuộm EtBr và chiếu tia UV -Hình 4. 14: dùng phóng xạ tự ghi để phát hiện DNA được đánh dâu phóng xạ tren agarose gel -Hình 4. 15: Đánh. thuật di truyền. Hình 4. 6 Phản ứng xúc tác của các enzyme sửa chữa DNA. (a) Alkaline phosphatase, loại bỏ nhóm 5 - phosphate . (b) Polynucleotide kinase, gắn vào nhóm 5’-phosphate. Chương