17 đến hàng triệu bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Nhƣng trong một số trƣờng hợp, tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phage cũng không sinh sôi. Hiện tƣợng này có thể do một trong hai nguyên nhân là DNA phage gắn vào vi khuẩn dƣới dạng không hoạt động trong một thời gian hay DNA phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiêu diệt khi vừa mới xâm nhập, hệ thống bảo vệ này là các enzym cắt giới hạn. Đây chính là hiện tƣợng giới hạn. Khi nghiên cứu DNA phage bằng phƣơng pháp Southern blot, ngƣời ta thấy rằng DNA phage trích từ vi khuẩn bị phá vỡ có kých thƣớc nguyên vẹn trong khi DNA phage trích từ vi khuẩn không bị phá vỡ lại bị cắt thành những đọan nhỏ hơn kých thƣớc đã xác định. Tuy vậy, ngay trên những chủng kháng phage, vẫn có một số vi khuẩn bị phân hủy. Các phage do số ít vi khuẩn này phóng thích có khả năng phân hủy chủng vi khuẩn trƣớc kia còn kháng phage. Tất cả những hiện tƣợng nêu trên là kết quả của một hệ thống gồm hai enzym: Các enzym cắt giới hạn cắt DNA phage ở những vị trí chuyên biệt, luôn luôn tạo thành những đọan có kých thƣớc nhất định và Methylase là enzym chịu trách nhiệm gắn nhóm methyl vào A hay C ở vị trí cắt của các enzym cắt giới hạn. Khi A hay C đƣợc methyl hóa, enzym cắt giới hạn không còn nhận biết đƣợc vị trí cắt. DNA vi khuẩn không bị chính các enzym cắt giới hạn của chúng cắt là nhờ cơ chế này. Các enzym cắt giới hạn hợp thành hệ thống bảo vệ ở tế bào procaryote, chƣa có hệ thống nào tƣơng đƣơng đƣợc phát hiện ở eucaryote. Khái niện enzym cắt: Enzym cắt giới hạn là các endonuclease có khả năng thủy giải DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những trình tự xác định. Dựa vào khả năng này ngƣời ta chia ra làm 3 loại enzym cắt giới hạn: Loại 1: khi enzym nhận biết đƣợc trình tự nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000-5000 nucleotide và giải phóng độ khoảng vài chục nucleotide. Loại 2: enzym nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí đó. Loại 3: enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA tại vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide. Trong các thí nghiệm ngƣời ta chỉ sử dụng các enzym cắt giới hạn loại 2 Khái niệm trình tự nhận biết: Mỗi enzym cắt giới hạn nhận biết một trình tự nocleotide đặc trƣng. Các trình tự này thƣờng bao gồm từ 4-8 nucleotide (thƣờng là 4 hay 6). Các RE khác nhau có cùng trình tự nhận biết gọi là isochizomers. Đối với một 18 số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotide của trình tự có thể đƣợc thay thế bởi nucleotide khác. Ví dụ : NspI GGGC(A,T)C- vị trí cắt thứ tƣ có thể là C, A, hay T Bgly GCCNNNNNGGC – N là bất kì nucleotide nào. Đặc trƣng quan trọng nhất của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palyndromic, nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng đƣợc đọc theo chiều 5’ 3’. Nhƣ vậy, vị trí cắt là giống nhau trên hai mạch. Hình 2.4 : Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn (a) DNA của phage bị phân huỷ trong tế bào vi khuẩn (b) DNA của vi khuẩn không đƣôc nhận biết bởi enzym cắt Các kiểu cắt của RE loại 2: Cắt tạo đầu bằng (blunt-ends): Một số RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm. Sau khi cắt, hai đầu bằng sẽ không có khả năng tự kết hợp lại. Để nối chúng lại phải dùng enzym T4 lygase. HaeIII 5’ GG CC 3’ 3’ GG CC 3’ 5’ GG CC 3’ 3’ CC GG 5’ Cắt đầu dính (cohesive ends): Ở một số RE, vị trí cắt lệch nhau trên hai mạch. Trong trƣờng hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại, hai phân tử EcoRI không cắt DNA đƣợc methyl hoá DNA đƣợc methyl hoá Enzym cắt giới hạn EcoRI Enzym cắt giới hạn EcoRI DNA không đƣợc methyl hoá DNA không đƣợc methyl hoá Phân cắt Đầu dính 19 DNA có nguồn gốc khác nhau khi đƣợc cắt bởi chung một RE sẽ có khả năng kết hợp thành một thông qua các đầu dính. EcoRI 5’ G AATT C 3’ 3’ C TTAA G 5’ 5’ G AATT 3’ 3’ C TTAA G 5’ 2.5.2 Các enzym sửa chữa DNA 2.5.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) Bản sao của một chuỗi axit nucleic luôn luôn đƣợc tổng hợp, nhờ một enzym sao chép, theo cách bổ sung, đối song, và theo hƣớng 5’P 3’OH. Các DNA polymerase tổng hợp chuỗi DNA từ khuôn DNA đƣợc gọi là DNA polymerase tùy thuộc DNA. DNA polymerase không thể tự khởi đầu một chuỗi axit nucleic, để khởi đầu một chuỗi axit nucleic cần cho vào môi trƣờng phản ứng một mồi axit nucleic. DNA polymerase I(từ E.coly) là một chuỗi polypeptide duy nhất với ba hoạt động enzym: DNA polymerase (tổng hợp) 5’ 3’, exonuclease (thủy giải) 3’ 5’ và exonuclease 5’ 3’. Enzym DNA fragment Klenow là enzym DNA polymerase I bị cắt bỏ tiểu đơn vị nhỏ (nhờ một protease), phần chịu trách nhiệm exonuclease 5’ 3’. Do đó, enzym Klenow có hai hoạt động: hoạt động tổng hợp DNA polymerase 5’ 3’ và hoạt động thủy giải exonuclease 3’ 5’. 2.5.2.2 Terminal transferase Enzym này đƣợc ly trích từ tuyến ức của bê. Terminal transferase xúc tác phản ứng gắn các deoxynucleotide vào đầu 3’OH tự do của phân tử DNA. Sự gắn này mang tính ngẫu nhiên nên thành phần nucluetide của chuỗi polynucleotide mới hình thành hoàn toàn phụ thuộc nồng độ của 4 loại nucleotide có trong phản ứng. Enzym này đƣợc sử dụng khi cần thêm đuôi nucleotide để tạo đầu sole cho phân tử DNA hay đánh dấu đầu 3’OH của các DNA trong phƣơng pháp xác định trình tự nucleic axit theo Maxam và Gilbert. 20 2.5.2.3 Các DNase Các DNase thƣờng đƣợc cô lập từ tuyến tụy bò, là các endonuclease có khả năng cắt một phân tử DNA sợi đơn hay kép theo cách ngẫu nhiên để cho một hỗn hợp các olygonucleotide. Hoạt động của DNase thay đổi tuỳ theo sự hiện diện của Mn 2+ hay Mg 2+ . Khi có Mn 2+ , DNase tác động trên hai sợi DNA gần nhƣ ở cùng một nơi để cho những đầu thẳng (hay không quá 1-2 nucleotide). Khi có Mg 2+ , DNase tác động trên mỗi sợi DNA riêng lẻ. 2.5.3 Các enzym khử phosphoril hoá. Đó là các phosphatase kiềm, có vai trò loại một nhóm phosphate ở đầu 5’ của chuỗi DNA. Ngƣời ta thƣờng khử phosphoril hoá vector vừa đƣợc mở bởi enzym giới hạn để tránh sự tự đóng lại của vector. Enzym loại này thƣờng đƣợc sử dụng là CIP (Calf intestinal alkalyne phosphatase), cấu trúc là một dimer glycoprotein- xúc tác phản ứng cắt bỏ gốc phosphate từ phân tử DNA mạch thẳng. Trong phản ứng của enzym này cần có sự hiện diện của ion Zn 2+ nhƣ là yếu tố hoạt hoá. Sau khi phản ứng xảy ra bất hoạt enzym bang cách thêm vào một lƣợng nhỏ proteinase K và EDTA, sản phẩm khử phosphoril đƣợc tinh sạch lại bằng cách sử dụng phenol:chloroform (Simsek và cộng sự, 1973). 2.5.4 Các enzym nối DNA Phản ứng nối giữa một đoạn phân tử DNA và vector đã mở vòng bằng enzym cắt giới hạn lyên quan đến sự hình thành lyên kết cộng hoá trị giữa gốc phosphate và gốc hydroxyl của hai phân tử DNA mạch đôi lyền kề. Sự hình thành lyên kết này có thể đƣợc xúc tác bởi hai loại enzym là E.coly DNA lygase hay T4 DNA lygase. 2.5.3.1 E.coly DNA lygase Enzym đƣợc ly trích từ E.coly xúc tác nối hai đoạn DNA có đầu sole 5’ ACGG + TAATCGCCA 3’ 3’ TGCCATTA GCGGT 5’ E.coly DNA lygase 5’ ACGGTAATCGCCA 3’ 3’ TGCCATTAGCGGT 3’ 21 2.5.3.2 T4 DNA lygase Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coly. Enzym này có cùng chức năng với lygase trích từ E.coly nhƣng đặc biệt còn có khả năng nối hai trình tự DNA đầu bằng nên là lygase đƣợc chuộng nhất trong sinh học phân tử. 2.6 Thiết kế DNA tái tổ hợp và tăng bội 2.6.1 Với plasmid Enzym hạn chế cắt vector ở vị trí hạn chế hay MSC. Các DNA sợi kép (plasmid thẳng) với các đầu dính hay bằng đƣợc tạo thành. Đoạn DNA lạ đƣợc cắt ra từ một phân tử DNA lớn bởi cùng enzym cắt giới hạn (với trƣờng hợp đầu dính) hoặc thu nhận từ phản ứng PCR. Sau đó, phản ứng nối giữa vector và DNA chèn đƣợc tiến hành dƣới sự xúc tác của DNA lygase, DNA lygase giúp sự tạo nối đồng hóa trị giữa các nucleotide cạnh nhau. 2.6.2 Với DNA phage Khác với DNA plasmid, DNA không đóng vòng, nhƣng ta cũng có thể tạo các ngân hàng DNA bằng cách dùng các phage làm vector, theo cùng nguyên tắc với sự dùng plasmid. Các bƣớc tạo DNA tái tổ hợp : Làm phóng thích DNA phage ra khỏi vỏ, làm cho các đầu tận cùng của đọan DNA insert có khả năng tƣơng hợp với các đầu tận cùng của DNA phage, và sau đó dùng lygase để nối lyền các đoạn DNA, tái tạo vỏ phage nhờ chất trích protein từ vỏ phage. Đến đây, phage sẵn sàng nhiễm vào vi khuẩn. Để tăng bội DNA phage ngƣời ta cho các phage nhiễm vào vi khuẩn. Các phage chứa DNA lạ sinh sản mạnh và phá vỡ vi khuẩn. Các vi khuẩn sau đó đƣợc trải trên thạch trong hộp petri. 2.7 Các nghiên cứu về biến nạp DNA Cohen và công sự (1973), đã thành công khi biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E.coly bằng phƣơng pháp Calcium chloride. Sambrook và cộng sự (1989), đƣa ra phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E.coly khả nạp, biến nạp plasmid vào tế bào theo phƣơng pháp hóa chất và sốc nhiệt, sau đó ông đƣa ra công thức tính hệ số biến nạp N = A x10 n x OV/PV N: hệ số biến nạp, tính bằng CFU/µg plasmid DNA A: số khuẩn lạc đếm đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc n: hệ số pha loãng 22 OV: thể tích ban đầu khi phục hồi (µl) OP: thể tích dịch vi khuẩn đƣợc trải trên đĩa (µl) Inoue và cộng sự(1990), đƣa ra công thức dung dịch TB sử dụng trong quá trình chuẩn bị tế bào khả nạp nhƣ sau: 10mM Pipes, 55mM MnCl 2 , 15mM CaCl 2 , 250mM KCl Zhiming Tu và cộng sự (2004), nghiên cứu cải thiện phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp và nâng cao hệ số biến nạp plasmid sử dụng những chủng E.coly khác nhau. Kết quả nghiên cứu của ông cho thấy sử dụng tế bào ở đầu phage log ảnh hƣởng rất lớn đến sự thành công của việc chuẩn bị tế bào khả nạp. Giá trị OD 600 thích hợp của dịch nuôi cấy khi chuẩn bị tế bào khả nạp với các chủng vi khuẩn nhƣ sau: XL-blue là từ 0.15-0.45, TG1 là từ 0.2-0.5, DH5α là từ 0.145-0.45. Nồng độ của CaCl 2 sử dụng trong dung dich TB tối ƣu là 75mM. Cũng trong nghiên cứu này Zhiming Tu cho thấy thời gian lƣu trữ tế bào khả nạp ở -20 o C là 7 ngày, ở -70 o C là 15 ngày. 23 PHẦN 3: VẬT LYỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp Thời gian : Khoá luận đƣợc tiến hành từ ngày 01 tháng 03 năm 2005 đến ngày 15 tháng 08 năm 2005. Địa điểm : Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh Trƣờng Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh và phòng 118,105 khu Phƣợng Vỹ Trƣờng Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Vật lyệu và phƣơng pháp dùng trong thí nghiệm 3.2.1 Vật lyệu làm thí nghiệm Vật lyệu dùng trong thí nghiệm là vi khuẩn E.coly DH5α và plasmid pBluescirpt II SK ( + / - ), đoạn DNA thu đƣợc từ phản ứng PCR. 3.2.1.1 Vi khuẩn E.coly DH5α Chủng vi khuẩn đã đột biến, có những thiếu hụt dùng để biến nạp và nhân nhanh số lƣợng bản sao plasmid hoặc cosmid. Kiểu gen : supE44 ∆lacU169(Ф80lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1relA1. Đột biến Ф80lacZ∆M15 cho phép xảy ra hiện tƣợng α-complementation với tiểu phần mang đầu amino của β-galactosidase đƣợc mã hoá bởi plasmid họ pUC (Hanahan 1983 ; Bwnthesda Research Laboratories 1986) 3.2.1.2 pBluescript II SK(+/-) pBluescript phagemid (plasmid với vùng khởi đầu sao chép của phage) là vector nhân tạo, đƣợc thiết kế để sử dụng trong cloning và đọc trình tự. pBluescript chứa MSC với trình tự nhận biết của 21 enzym cắt giới hạn. Bên ngoài vùng MSC là T7, T3 RNA polymerase promoter, có thể sử dụng để tổng hợp RNA invitro. Trình tự của T7, T3 còn có thể sử dụng để thiết kế primer sử dụng cho phƣơng pháp đọc trình tự. pBluescript chứa trình tự mã hoá cho 131 amino axit của β-galactosidase. Việc phân biệt pBluescript II SK (+/-) hay pBluescript II KS (+/-) phụ thuộc vào cách sắp xếp thứ tự các trình tự nhận biết của các enzym cắt giới hạn trong vùng MSC so với trình tự của T7, T3 RNA polymerase promoter. Ở pBluescript II SK (+/-), trình tự của enzym Kpn I gần với T7 promoter, trình tự của enzym Sac I gần với T3 promoter và ngƣợc lại. 24 Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MSC của plasmid pBluescript II SK (+/-) 3.2.1.3 Đoạn DNA Hai đoạn DNA đƣợc chọn nghiên cứu trong khoá luận này là Đoạn DNA (629bp) chứa gen mã hoá 2,4-diacetylploroglucinol (2,4-DAPG) trong vi khuẩn Psedomonas fluorescens. Đoạn DNA(580bp)trong vùng ITS của loài nấm Beauveria bassiana. 3.2.2 Dụng cụ thí nghiệm Đĩa petri, Ống nghiệm Eppendorf các loại Pipet và đầu tip Lọ thủy tinh đƣng hóa chất Đầu lọc hóa chất Thùng đựng nƣớc đá Bình tam giác 3.2.3 Các thiết bị máy móc Tủ cấy vô trùng Bồn ổn nhiệt Máy ly tâm Tủ định ôn Máy lắc vi khuẩn Tủ lạnh Máy đo OD Tủ sấy dụng cụ Thiết bị điện di Máy chụp gel Lò vi sóng 3.2.4 Các loại môi trƣơng nuôi cấy vi khuẩn Môi trƣờng LB lỏng (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua ) Môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, ampicillyn) Môi trƣờng LB agar (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar ) . giải) 3 5’ và exonuclease 5’ 3 . Enzym DNA fragment Klenow là enzym DNA polymerase I bị cắt bỏ tiểu đơn vị nhỏ (nhờ một protease), phần chịu trách nhiệm exonuclease 5’ 3 . Do đó, enzym Klenow. bởi hai loại enzym là E. coly DNA lygase hay T4 DNA lygase. 2.5 .3. 1 E. coly DNA lygase Enzym đƣợc ly trích từ E. coly xúc tác nối hai đoạn DNA có đầu sole 5’ ACGG + TAATCGCCA 3 3 TGCCATTA. cần cho vào môi trƣờng phản ứng một mồi axit nucleic. DNA polymerase I(từ E. coly) là một chuỗi polypeptide duy nhất với ba hoạt động enzym: DNA polymerase (tổng hợp) 5’ 3 , exonuclease (thủy