17 - Bộ cánh nửa (Heteroptera): bị tác động bởi cơ chế ngán ăn, ức chế phát triển và biến thái làm cho quần thể côn trùng dần dần bị suy thoái. - Bộ cánh tơ (Thysanoptera): phương thức tác động chủ yếu là ức chế phát triển và sinh sản của đối tượng. 2.4.2 Đối với vi nấm [23] Dầu xoan chịu hạn có thể ức chế hoàn toàn Aspergillus niger, Fusarium monoliforme, Macrophomina phaseolina và Drechslera rostrata (Anon, 1986). Dịch chiết từ lá xoan chịu hạn cũng có khả năng ức chế phát triển và sự nảy mầm bào tử của nấm Fusarium equiseti, Fusarium semitectum và giảm mức độ bệnh ở củ khoai tây gây ra bởi hai loại nấm Aspergillus flavus và Aspergillus niger. Dịch chiết từ lá xoan chịu hạn cũng có hiệu quả ức chế đối với nấm gây bệnh cháy lá ở lúa (Pyricularia oryzae), (Rajeswari và Mariappan, 1993). Dịch chiết từ lá xoan chịu hạn có tác dụng ức chế sự sinh tổng hợp độc tố của hai loại nấm A. flavus và A. parasiticus (Hampden và ctv, 1993). 2.4.3 Đối với tuyến trùng [23] Dịch chiết từ lá, hoa, quả và vỏ cây xoan chịu hạn có độc tính cao đối với nhiều loại tuyến trùng như: Helicotylenchus indicus Siddiqui, Hoplolaimus indicus Sher và Tylenchus filiformis, Tylenchorchynchus brasscae Siddiqui, Rotylenchus reniformis và Meloidogyne incognita Chitwood (Siddiqui và Alam, 1985). Nimbin và một số hợp chất thuộc nhóm limonoid khác có khả năng ức chế giai đoạn trưởng thành, làm rối loạn chu kỳ sống và có thể gây chết cho đối tượng (Vijayalakshmi và ctv, 1985). 2.5 Một số công trình nghiên cứu về tác động của dịch chiết từ xoan chịu hạn lên sâu bọ Phần này trình bày một số kết quả nghiên cứu đã công bố liên quan đến tính kháng sâu hại của các sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn, làm cơ sở cho việc thực hiện đề tài này. Nhóm tác giả Dương Anh Tuấn và cộng sự thuộc Viện Hóa Học – Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia đã phân lập hoạt chất azadirachtin từ hạt cây xoan chịu hạn trồng tại Ninh Thuận. Kết quả cho thấy hoạt chất azadirachtin phân lập có độ sạch 92%, hiệu suất chiết tách là 0,054%. Thử nghiệm trên sâu khoang hại rau Spodoptera litura cho thấy azadirachtin có hoạt tính gây ngán ăn khá cao, chỉ số 18 gây ngán ăn trung bình đạt 71,54% ở liều lượng 7,89 mg/cm 2 và chỉ số ngán ăn trung bình đạt 87 ở liều lượng 15,6 mg/cm 2 [8]. Những thí nghiệm ở phòng thí nghiệm và nhà kính cho thấy dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn (NSKE’s) làm giảm đáng kể khả năng đẻ của Leptinotarsa decemlineata trong suốt thời kỳ sinh sản (khoảng 3 tháng). Sau khi phun lên lá khoai tây bằng dịch chiết AZT – VR – K (Feulrhake, 1984) 2,5ml/l nước hoặc dịch chiết từ nước, con cái ăn lá đã xử lý thuốc đẻ rất ít trứng, một số con hoàn toàn không đẻ. Trong khi đó, 20 con đối chứng (không ăn lá đã xử lý thuốc) thì sinh sản bình thường. Vậy ta có thể điển khiển bằng cách phun NSKE’s vào ruộng khoai tây tại thời điểm bắt đầu của thời kỳ đẻ trứng, vào mùa xuân [46]. Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Tiến Thắng và Akiko Hirano bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của dầu neem lên sự ký sinh của Bọ Hà (Cylas formicarius F.) trưởng thành trong củ khoai lang (Ipomoea batatas L.) đã kết luận: dầu neem bắt đầu tác dụng với Bọ Hà ở tuần thứ 2 sau xử lý và hiệu quả càng rỏ rệt ở tuần thứ 3 và tuần thứ 4 sau xử lý. Ở nồng độ 200 ppm, tác dụng của dầu neem đối với Bọ Hà là rỏ rệt nhất. Dầu neem làm giảm sự ký sinh, sự sinh sản của Bọ Hà đối với khoai lang ngay từ tuần đầu tiên và có tác dụng xua đuổi Bọ Hà đến ký sinh [21]. Nhóm tác giả Vũ Văn Độ, Vũ Đăng Khánh và Nguyễn Tiến Thắng thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới – Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia đã đánh giá được hiệu quả gây chết của chế phẩm phối trộn giữa dầu neem và Bt (Bacillus thuringiensis) đối với sâu xanh (Heliothis armigera) và sâu tơ (Plutella xylostella). Kết quả nghiên cứu cho thấy: chế phẩm phối trộn giữa dầu neem và Bt gây chết sâu xanh và sâu tơ mạnh hơn so với chế phẩm chỉ chứa dầu neem hoặc chỉ chứa Bt. Hiệu quả gây chết mạnh nhất và rõ ràng nhất ở nồng độ 32% dầu neem và 10% hoặc 15% Bt [6]. Theo S. Singh và R. P. Singh, dịch chiết xuất từ nhân hạt xoan chịu hạn và Azadirachtin làm cản trở khả năng đẻ trứng của Bactrocera cucurbitae và Bactrocera dorsalis. Azadirachtin và năm loại dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn gồm: dịch chiết trong nước, dịch chiết trong ethanol, dịch chiết trong hexane, dịch chiết trong ethanol được loại dầu bằng n – hexane, và dịch chiết trong acetone của bột nhân hạt neem đã loại dầu được dùng để thử nghiệm sự tác động của chúng lên sự đẻ trứng. Dưới điều kiện thử nghiệm có chọn lọc, tất cả dịch chiết trừ dịch chiết trong nước đều 19 ngăn cản đáng kể sự đẻ trứng của Bactrocera cucurbitae tại nồng độ 1,25% trở lên. Dịch chiết từ nước chỉ tác động ở nồng độ 5% trở lên. Đối với Bactrocera dorsalis, dịch chiết trong ethanol và trong acetone tác động ở nồng độ 1,25% trở lên, dịch chiết trong nước và trong ethanol được loại dầu bằng n – hexane chỉ tác động từ 5% trở lên và dịch chiết trong n- hexane chỉ tác động từ tại nồng độ 20% [47]. 2.6 Chiết xuất, phối chế và sử dụng các sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn 2.6.1 Chiết xuất hoạt chất từ xoan chịu hạn Mặc dù các hoạt chất sinh học được tìm thấy ở hầu hết các bộ phận cây xoan chịu hạn nhưng các hoạt chất sinh học trong nhân hạt chiếm đa số và dễ thu nhận nhất. Người ta có thể thu nhận hoạt chất sinh học bằng cách chiết xuất với các loại dung môi khác nhau. Các chất có hoạt tính sinh học hòa tan kém trong nước nhưng lại hòa tan gần như hoàn toàn trong dung môi hữu cơ: alcohol, ketone hoặc ether. Việc chiết xuất khá đơn giản, người ta có thể áp dụng phương pháp truyền thống như ngâm, ngấm kiệt và khuấy trộn hoặc phương pháp hiện nay nhờ sử dụng máy ép lạnh. Phương pháp ngâm: Ngâm là phương pháp cho nguyên liệu đã nghiền nhỏ đến độ mịn thích hợp, sau đó cho tiếp xúc với dung môi trong một một thời gian nhất định. sau một thời gian ngâm, gạn lấy dịch chiết và dịch ép, sau đó để lắng, lọc lấy dịch trong [8]. Phương pháp ngấm kiệt: Ngấm kiệt là phương pháp chiết xuất hoạt chất bằng cách cho dung môi chảy qua rất chậm khối nguyên liệu đựng trong một dụng cụ đặc biệt gọi là bình ngấm kiệt, trong quá trình chiết xuất không cần khuấy trộn, có nhiều cách ngấm kiệt khác nhau như: ngấm kiệt phân đoạn (tái ngấm kiệt), ngấm kiệt ngược dòng (gián đoạn và liên tục), ngấm kiệt dưới tác dụng của áp suất, …[9] Ép dầu: Ấn Độ và một số nước thường dùng công nghệ ép dầu từ nhân hạt xoan chịu hạn, dầu ép có màu nâu sẩm, vị đắng và có mùi tỏi do có các hợp chất lưu huỳnh có trong hạt. Phần bã sau khi ép có thể được chiết tiếp bằng các dung môi khác nhau để tận thu hoạt chất hoặc sử dụng làm phân bón. Các dịch chiết thường được pha chế thành các chế phẩm dạng hạt, bột phun, bột hòa nước hoặc dạng nhũ, có bổ sung các chất phụ gia để hạn chế sự phân hủy hoạt chất do điều kiện ngoại cảnh nhằm tăng hoạt lực và dễ dàng đáp ứng cho nhiều đối tượng dịch hại, cây trồng khác nhau. Hiệu quả phòng trị côn trùng có thể tăng lên từ 10 – 20 lần nếu phối hợp dịch 20 chiết hạt xoan chịu hạn với pyrethrin. Dầu hạt neem hòa với acid humic sẽ tăng tác dụng lưu dẫn khi phun lên lá hoặc tưới gốc [8]. Các dung môi chiết xuất phổ biến nhất là: 2.6.1.1 Chiết xuất bằng nƣớc Kỹ thuật đơn giản và được sử dụng phổ biến nhất là xay, nghiền nguyên liệu đến độ mịn thích hợp và chiết xuất hoạt chất sinh học trong nước. Thông thường người ta cho nguyên liệu đã xay mịn vào trong một túi vải và ngâm chìm trong một chậu nước. Ngâm có thể được tiến hành một lần với toàn bộ dung môi hoặc ngâm phân đoạn, ngâm phân đoạn nghĩa là chia quá trình ngâm ra nhiều lần, mỗi lần ngâm dùng một phần của toàn lượng dung môi, người ta có thể tiến hành ngâm phân đoạn một lần hoặc nhiều lần [8]. Dịch chiết thu được có thể sử dụng trực tiếp trên đồng ruộng mà không cần bổ sung thêm phụ gia. Tuy nhiên, có thể lọc dịch chiết và phối chế nó dưới dạng nhũ tương để dễ sử dụng hơn. Cách chiết xuất này thích hợp ở các vùng đồng quê hoặc ở các nước nông nghiệp chưa phát triển. Người ta thường chiết xuất bằng nước khoảng 20 – 30 kg hạt xoan chịu hạn để phun trên một hécta [33]. Theo GS. Govindachari và cộng sự (1999) thì dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn trong nước chứa các chất có hoạt tính sinh học tương tự như các dịch chiết trong alcohol, nhưng hàm lượng ít hơn [35]. 2.6.1.2 Chiết xuất bằng hexane Bột nguyên liệu được ngâm trong dung môi hexane, thu được dầu xoan chịu hạn. Dầu xoan chịu hạn không được xem là thuốc diệt sâu hại mạnh. Tuy nhiên, những kết quả nghiên cứu cho thấy trong một số trường hợp dầu xoan chịu hạn vẫn được sử dụng để diệt trứng của nhiều loại côn trùng, ấu trùng của muỗi và một số sâu hại trong đó có rầy xanh đuôi đen, .v.v. là những đối tượng khó kiểm soát bằng các biện pháp khác. Cặn còn lại sau khi chiết xuất bằng hexane chứa nhiều thành phần limonoid chính và việc chiết xuất tiếp cặn chiết đó bằng nước hoặc cồn sẽ cho sản phẩm chiết chứa hàm lượng limonoid cao, sạch, không chứa dầu [33]. 2.6.1.3 Chiết xuất bằng pentane Dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn trong pentane có tác dụng phòng trừ ve, rệp và nhện. Thành phần có hoạt tính sinh học trong dịch chiết này không phải là azadirachtin. 21 2.6.1.4 Chiết xuất bằng cồn Chiết xuất nhân hạt xoan chịu hạn trong cồn là biện pháp thu nhận các sản phẩm dùng làm thuốc trừ sâu hại ở dạng cô đặc. Các hợp chất limonoid hòa tan tốt trong dung môi cồn. Bột nhân hạt xoan chịu hạn đem ngâm trong trong ethanol hoặc methanol, thu được dịch chiết xuất chứa hàm lượng hoạt chất sinh học từ 0,2 – 6,2 %. Dịch chiết nhân hạt xoan chịu hạn trong nước có tác dụng diệt sâu hại không cao là do các hoạt chất sinh học của xoan chịu hạn không tan tốt trong nước. Còn dịch chiết của nhân hạt xoan chịu hạn trong cồn chứa các chất có hoạt tính sinh học cao hơn khoảng 50 lần so với dịch chiết trong nước [33]. 2.6.2 Phối chế sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn Dạng thuốc trừ sâu hại từ xoan chịu hạn đơn giản nhất là dạng dịch chiết thô nhưng để gia tăng hoạt lực người ta thường phối chế sản phẩm chiết xuất thô với một số hoạt chất khác. Phối chế là việc chuyển dịch chiết xuất thô của xoan chịu hạn thành các dạng hạt, cám, dạng bột ẩm hoặc dạng cô đặc nhũ hóa (emulsifiable concentrate) để tăng hiệu quả sử dụng. Trong thực tế, dịch chiết của nhân hạt xoan chịu hạn trong nước có thể phối chế với xà bông để dễ sử dụng với các bệnh ngoài da [31]. Phối chế liên quan đến việc bổ sung phụ gia vào dịch chiết xoan chịu hạn và đôi khi làm thay đổi cấu trúc hóa học của hoạt chất sinh học từ xoan chịu hạn. Phối chế nhằm làm gia tăng sự ổn định của chế phẩm, làm cho nó dễ sử dụng, dễ bảo quản hoặc thích hợp cho qui mô sản xuất lớn. Việc phối chế cũng nhằm làm giảm độc tính của chế phẩm đối với thực vật (đối với những loài mẫn cảm). Nhóm các chất phụ gia thường được sử dụng là những chất ức chế sự phân hủy do tia UV như dầu mè, leucithin và para – aminobenzoic acid và chất chống oxi hóa [33]. Việc phối chế dịch chiết từ xoan chịu hạn với phụ gia có thể làm tăng khả năng tác dụng của nó lên từ 10 đến 20 lần. Người ta còn sử dụng dịch chiết từ xoan chịu hạn kết hợp với các thuốc diệt côn trùng tổng hợp nhằm làm gia tăng hoạt lực của nó, đặc biệt là để ức chế sự phục hồi quần thể sâu hại. Thí dụ, hiệu quả của dịch chiết từ xoan chịu hạn được tăng cường bằng việc phối chế với vi khuẩn diệt côn trùng Bacillus thuringiensis (Bt) tạo ra một loại thuốc diệt sâu hại đa tác dụng. [33]. Đối với nấm gây bệnh cây, việc phối chế dầu xoan chịu hạn với chất nhủ hóa như acetic acid, citric acid làm tăng hiệu quả ức chế Sarocladium oryzea gây bệnh thối 22 vỏ lúa và nấm Helminthosporium oryzea, Pyricularia oryzea gây bệnh mất màu ở lúa trong điều kiện in vitro và làm tăng năng suất lúa ở các lô thí nghiệm trên đồng ruộng. Hiệu quả này được duy trì sau 9 tháng bảo quản [41; 44]. 2.6.3 Sử dụng sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn Có thể sử dụng sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn bằng nhiều hình thức khác nhau: ở dạng dịch phun, dạng bột, dạng tẩm hoặc pha loãng với nước tưới cây. Ngoài ra, có thể sử dụng sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn thông qua việc tiêm trực tiếp vào cây hoặc sử dụng cục bộ chế phẩm dạng bụi mịn hoặc dạng phun. Hoặc có thể cho chế phẩm vào mồi để thu hút côn trùng [33]. 2.6.4 Ƣu điểm của các dịch chiết từ xoan chịu hạn So với thuốc trừ sâu tổng hợp, ưu điểm của thuốc trừ sâu gốc thảo mộc là khả năng làm chậm sự phát triển tính kháng ở tác nhân gây dịch hại. Trong số các thuốc gốc thảo mộc đã phổ biến, dịch chiết từ cây xoan chịu hạn phong phú hơn cả về thành phần hoạt chất. Pyrethrin (sản phẩm chiết xuất từ cây hoa cúc Chrysanthemum cinerariaefolium) chỉ chứa 4 loại este và Rotenone (sản phẩm chiết xuất từ cây thuốc lá Derris spp. và Lonchocarpus spp.) chỉ chứa khoảng 6 loại isoflavonoid có hoạt tính diệt côn trùng. Còn ở cây xoan chịu hạn, riêng nhóm azadirachtin đã gồm khoảng 9 loại đồng dạng khác nhau, trong đó nhóm azadarachtin được cho là có hoạt tính kháng côn trùng mạng nhất. Ngoài ra, chưa kể các loại limonoid khác cũng có hoạt tính cao như salanin, meliantriol có mặt trong vỏ và lá xoan chịu hạn. Hoạt lực của các dịch chiết từ xoan chịu hạn được tạo thành từ sự phối hợp tương tác phức tạp của nhiều thành phần hoạt tính, nhờ đó làm giảm tính kháng của các loài dịch hại và sự nhạy cảm về tập tính (Isman, 1997). Thí nghiệm chọn lọc trong điều kiện phòng thí nghiệm trên loài rệp Myzus persicae nhận thấy rằng: khi xử lý azadirachtin tinh sạch lên cây thì tính kháng của loài rệp này tăng lên 9 lần sau 40 thế hệ, nhưng xử lý bằng dịch chiết hạt xoan chịu hạn (chứa hàm lượng azadirachtin tương đương) thì không làm xuất hiện tính kháng của M. persicae sau chừng ấy thế hệ. Có thể chính sự đa dạng về thành phần hoạt chất của dịch chiết hạt xoan chịu hạn đã làm phân tán tiến trình chọn lọc thích nghi của đối tượng dịch hại, nhờ đó làm chậm sự phát triển tính kháng của chúng. Tuy nhiên, cũng như bao nhiêu thuốc thảo mộc khác, các sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn dễ bị phân hủy về mặt sinh học, không bền 23 vững trong môi trường tự nhiên do dễ bị oxy hóa, không làm hại thiên địch và không gây độc hại đối với người [18]. 2.6.5 Một số sản phẩm thƣơng mại của xoan chịu hạn Trên thị trường hiện nay có bán một số sản phẩm thương mại có nguồn gốc từ xoan chịu hạn, được dùng để kiểm soát côn trùng gây hại. Một số sản phẩm của Mỹ (Margosan-O) [40]; của Đức (NeemAzal – F, NeemAzal T/S) [34; 38] đã được thử nghiệm nghiêm ngặt, được chuẩn hóa và khảo sát độc tính. Một số sản phẩm thương mại có nguồn gốc từ xoan chịu hạn được trình bày trong Bảng 2.3 Bảng 2.3: Một số sản phẩm thƣơng mại có nguồn gốc từ xoan chịu hạn [36] Quốc gia Tên thương mại Thành phần Việt Nam TP – Kim Thiên Dịch thảo mộc neem (Azadirachtins) và chất hữu cơ Etofenprox Ấn Độ Repelin Wellgro Neemguard Neemmark Neem 2100 Neemrich I Neemrich II, III Xoan chịu hạn, karanja, quả na và dầu caster Dạng chế phẩm rắn Sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn Azadirachtin EC Dịch huyền phù nhân hạt xoan chịu hạn trong nước Dạng cô đặc nhủ hóa Dạng cô đặc nhủ hoá Mỹ Margosan – O Sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn trong ethanol chứa 3000 ppm azadirachtin Thái Lan Instar Neemix Jarvan Advantage Xoan chịu hạn Thái Lan, cây sả chanh, cây riềng nếp Xoan chịu hạn Thái Lan, và các thực vật khác dùng trong y học Dầu xoan chịu hạn Thái Lan Xoan chịu hạn Thái Lan Đức NeemAzal – F NeemAzal T/S Dạng cô đặc hòa tan trong nước, chứa 50.000 ppm azadirachtin Dạng cô đặc hòa tan trong nước, chứa 10.000 ppm azadirachtin 24 Hình 2.5: Cây Neem Hình 2.6: Rừng Neem Ninh Thuận Hình 2.7: Nuôi cấy mô cây Neem Hình 2.8: Hạt và nhân hạt neem . Bactrocera cucurbitae và Bactrocera dorsalis. Azadirachtin và năm loại dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn gồm: dịch chiết trong nước, dịch chiết trong ethanol, dịch chiết trong hexane, dịch chiết. tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia đã đánh giá được hiệu quả gây chết c a chế phẩm phối trộn gi a dầu neem và Bt (Bacillus thuringiensis) đối với sâu xanh (Heliothis armigera) và sâu. Mariappan, 19 93) . Dịch chiết từ lá xoan chịu hạn có tác dụng ức chế sự sinh tổng hợp độc tố c a hai loại nấm A. flavus và A. parasiticus (Hampden và ctv, 19 93) . 2.4 .3 Đối với tuyến trùng [ 23]