38 512 1 128 1 256 1 1024 1 64 1 32 1 16 1 4 1 8 1 2 1 Hình 4.2. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Gross + Fuld Đối chứng (+) có enzyme: dung dịch trong Đối chứng (-) không có enzyme: dung dịch đục có kết tủa trắng Qua kết quả khảo sát số lượng tế bào/ml, hoạt độ enzyme amylase, protease trên môi trường nhân giống cấp 1. Chúng tôi nhận thấy rằng môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột là môi trường tối ưu nhất trong 5 loại môi trường khảo sát. Từ đây chúng tôi quyết định chọn môi trường này là môi trường nhân giống cấp 1 thích hợp nhất để sử dụng cho môi trường nhân giống cấp 2. 4.1.2. Kết quả về khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi trường nhân giống cấp 2 Sau khi chọn được môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột là môi trường nhân giống cấp 1 tối ưu nhất chúng tôi tiến hành tìm môi trường nhân giống cấp 2. Thí nghiệm được bố trí trên 5 loại môi trường mà chúng tôi tự tổng hợp và được ký hiệu lần lượt A, B, C, D, E (thành phần môi trường xem chi tiết ở mục 1.11 phần phụ lục). Lượng giống bổ sung vào là 10%, pH = 7. Sau thời gian nuôi 72 giờ ở nhiệt độ phòng bắt đầu thu hoạch và kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn, hoạt độ enzyme amylase, protease trên từng loại môi trường này. Kết quả được ghi nhận ở bảng 4.3 và 4.4. 39 4.1.2.1. Khả năng tăng sinh khối Bảng 4.3. Số lượng tế bào B. subtilis trên từng loại môi trường nhân giống cấp 2 Môi Trường A B C D E Lặp lại (n) X (×10 10 cfu/g) SD C V % 3 345,67 a 126,595 36,62 3 155,33 b 55,229 35,55 3 11,368 c 1,362 11,98 3 13,26 c 1,623 3 12,74 c 2,619 12,24 20,56 Qua bảng 4.3 chúng tôi nhận thấy rằng môi trường A cho số lượng tế bào cao nhất là 345,67×10 10 cfu/g. Qua xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt giữa các môi trường là rất có ý nghĩa (P < 0,001). Giữa các môi trường C, D, E thì không thấy có sự khác biệt về số lượng tế bào /gam. Hình 4.3. Kiểm tra số lượng vi khuẩn B. subtilis trên môi trường A 40 4.1.2.2. Khả năng sinh enzyme amylase và protease Sau 72 giờ nuôi ở nhiệt độ phòng chúng tôi kiểm tra hoạt độ enzyme amylase và protease trên từng loại môi trường nhân giống cấp 2. Kết quả được ghi nhận trong bảng 4.4. Bảng 4.4. Hoạt độ enzyme amylase và protease trên môi trường nhân giống cấp 2 Môi trường Enzyme A B C D E Qua bảng 4.4 chúng tôi nhận thấy hoạt độ enzyme amylase và protease cao nhất ở môi trường A và B. Qua kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt giữa từng loại môi trường lên khả năng tạo enzyme của Bacillus subtilis là có ý nghĩa (P < 0,05). Sau khi khảo sát chúng tôi nhận thấy ở môi trường A và B thì có sự tương đồng về khả năng sinh enzyme amylase và protease. Tuy nhiên khi xét đến khả năng tạo sinh khối thì môi trường A là môi trường tối ưu nhất. Từ kết quả khảo sát số lượng và hoạt độ enzyme trên môi trường A, B, C, D và E. Chúng tôi quyết định chọn môi trường A làm môi trường sản xuất thích hợp nhất để sản xuất chế phẩm chứa B. subtilis. Amylase Lặp lại (n) X (W 0 /ml) SD Cv % 3 160 a 0 0 3 160 a 0 0 3 80 b 0 0 3 80 b 0 3 80 b 0 0 0 Protease Lặp lại (n) X (Hđp/ml) SD Cv % 3 80 a 0 0 3 80 a 0 0 3 80 a 0 0 3 80 a 0 3 40 b 0 0 0 41 A B 4.1.3. Kết quả kiểm tra số lượng B. subtilis và hoạt độ enzyme sau khi sản xuất chế phẩm Hình 4.4 . Sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis( màu trắng) trên môi trường A và B. Sau khi chọn được môi trường A là môi trường nhân giống cấp 2 tối ưu nhất chúng tôi tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Bacillus subtilis. Cách thực hiện giống như thí nghiệm 3.3.1.2. Lượng giống sử dụng là 10% và tiến hành nuôi ở nhiệt độ phòng, pH = 7. Sau khi thu hoạch chúng tôi tiến hành sấy trong 2 ngày ở nhiệt độ 40 - 45 0 C sao cho sản phẩm khô hoàn toàn. Sau đó đem kiểm tra, đóng gói và bảo quản. Kết quả kiểm tra số lượng tế bào, hoạt độ enzyme trong chế phẩm trước thời gian bảo quản là: Số lượng tế bào vi khuẩn: 58,9 × 10 10 cfu/g Hoạt độ enzyme amylase: 160 W o /ml Hoạt độ enzyme protease: 80 Hđp/ml 42 4.1.4. Kết quả kiểm tra chế phẩm chứa Bacillus subtilis sau thời gian bảo quản Chế phẩm sau khi sản xuất chúng tôi tiến hành đóng gói và đem bảo quản ở nhiệt độ phòng. Sau đó kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn, hoạt độ enzyme amylase, protease trong thời gian bảo quản là 10, 20 và 30 ngày. Kết quả ghi nhận được ở bảng 4.5. Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra chế phẩm Bacillus subtilis trong thời gian bảo quản Như vậy sau khi kiểm tra chế phẩm ở 30 ngày chúng tôi ghi nhận sản phẩm chứa Bacillus subtilis do chúng tôi sản xuất có số lượng tế bào là 68,9 × 10 9 cfu/g, hoạt độ amylase là 160W 0 /ml và hoạt độ protease là 80 Hđp/ml Quy đổi hoạt độ enzyme amylase và protease sang đơn vị quốc tế. Hoạt độ amylase 160 W o /g ~ 6576 UI/ml Hoạt độ protease 80 Hđp/ml ~ 572,8 UI/ml Chế độ bảo quản Thời điểm kiểm tra (ngày) Số lượng tế bào (×10 9 cfu/g) Hoạt độ amylase (W 0 /ml) Hoạt độ protease (Hđp/ml) Nhiệt độ thường 10 20 30 118 88.9 68.9 160 160 160 80 80 80 Hình 4.6. Hoạt độ protease trong chế phẩm chứa Bacillus subtilis Hình 4.5. Hoạt độ amylase trong chế phẩm chứa Bacillus subtilis 43 589 118 88.9 68.9 0 100 200 300 400 500 600 700 0102030 Số lượng cfu/g Số lượn g Thời gian (ngày) Biểu đồ 4.1. Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo quản 44 4.2. ĐỐI VỚI LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS 4.2.1. Đặc điểm của Lactobacillus acidophilus 4.2.1.1. Quan sát đại thể Sau khi phân lập Lactobacillus acidophilus từ chế phẩm chúng tôi chọn khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch đĩa MRSA có dạng tròn, nhỏ, ở giữa dày và đục hơn mép bên ngoài, xung quanh khuẩn lạc có vòng trong. Sau thời gian 48 giờ ở tâm khuẩn lạc có màu hơi vàng, đường kính khuẩn lạc từ 1 - 2 mm. Hình 4.7. Vi khuẩn L. acidophilus trên môi trường MRSA 4.2.1.2. Quan sát vi thể Sau khi quan sát hình dạng bên ngoài chúng tôi tiến hành nhuộm Gram những khuẩn lạc nghi ngờ và quan sát trên kính hiển vi với vật kính 100 (độ phóng đại là 1000 lần). Qua quan sát trên kính hiển vi chúng tôi nhận thấy vi khuẩn có dạng hình que, hai đầu tròn, kích thước trung bình từ 0,6 - 0,9 × 1,5 – 6 µm. Chúng tồn tại dạng đơn, cặp đôi hay đôi khi tạo chuỗi ngắn, bắt màu tím (Gram dương) và không có bào tử. 4.2.1.3. Đặc điểm sinh hóa Từ chủng Lactobacillus acidophilus nghi ngờ chúng tôi tiến hành tăng sinh chúng trong môi trường MRSB ở 24 giờ /37 o C. Sau đó thử các phản ứng sinh hóa để xác định vi khuẩn vừa phân lập. Kết quả được trình bày ở bảng 4.6. 45 Bảng 4.6. Kết quả thử phản ứng sinh hóa của Lactobacillus acidophilus Phản ứng Kết quả Lên men đường Kết quả Indol VP MR Citrat Nitrat Di động Catalase Khả năng đông vón sữa - - + - - - - + Lactose Sucrose Glucose Manitol Rabinose + + + - - Hình 4.8. Khả năng lên men đường của Lactobacillus acidophilus Từ kết quả 4.2.1.1, 4.2.1.2 và 4.2.1.3 chúng tôi kết luận được chủng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm đó là vi khuẩn Lactobacillus acidophilus. Từ chủng vừa phân lập được này tiến hành khảo sát khả năng đông vón sữa và kiểm tra số lượng tế bào của chúng trên hai loại môi trường sữa đặc có đường và sữa đậu nành. 46 4.2.2. Kết quả kiểm tra số lượng L. acidophilus và độ chua Therne trên từng loại môi trường 4.2.2.1. Trên môi trường sữa đặc có đường Sau khi tăng sinh trên môi trường MRSB ở 37 o C / 24 giờ chúng tôi cho lượng giống 5% này vào môi trường sữa đặc có đường với từng nồng độ là 15%, 20% và 25%. Sau thời gian nuôi 24 giờ ở nhiệt độ phòng tiến hành kiểm tra độ chua Therne và số lượng tế bào vi khuẩn có trong 1 ml dịch môi trường. Kết quả được trình bày ở bảng 4.7 và 4.8. Bảng 4.7. Khả năng tạo độ chua của L. acidophilus trên môi trường sữa đặc có đường Nồng độ sữa 15 % 20 % 25 % Lặp lại (n) X (g/100ml) Bảng 4.8. Số lượng của L. acidophilus trên môi trường sữa đặc có đường. SD C V % 3 0,8233 a 0,045 5,477 3 0,9420 b 0,059 3 1,169 c 0,046 6,361 4,009 Nồng độ sữa 15 % 20 % 25 % Lặp lại (n) X ( ×10 9 cfu/ml) SD C V % 3 8,83 a 0,317 3,59 3 11,017 b 1,086 3 21,967 c 3,350 9,86 15,25 Qua bảng 4.7 và 4.8 chúng tôi nhận thấy nồng độ sữa càng cao thì khả năng tạo độ chua và sinh khối của vi khuẩn L. acidophilus càng nhiều. Độ chua và số lượng tế bào vi khuẩn cao nhất ở môi trường có nồng độ 25% sữa. Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt giữa các nồng độ lên số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua là có ý nghĩa (P < 0,001). 4.2.2.2. Trên môi trường sữa đậu nành Tương tự như cách thực hiện trên môi trường sữa đặc có đường chúng tôi bố trí thí nghiệm trên môi trường sữa đậu nành ở từng nồng độ đậu có bổ sung từng hàm lượng đường khác nhau. Kết quả thu được trình bày ở 4.9 và 4.10. 47 Bảng 4.9. Khả năng tạo độ chua của L. acidophilus trên môi trường sữa đậu nành. 10% 15% 20% Nồng độ Kết quả NA 0 NA 10 NA 15 NA 20 NB 0 NB 10 NB 15 NB 20 NC 0 NC 10 NC 15 NC 20 3 Bảng 4.10. Số lượng của Lactobacillus acidophilus trên môi trường sữa đậu nành Qua bảng 4.9 và 4.10 cùng với kết quả xử lý thống kê chúng tôi nhận thấy nồng độ đậu và hàm lượng đường có ảnh hưởng đến khả năng tạo độ chua và số lượng tế bào của vi khuẩn L. acidophilus (với P < 0,001). Độ chua và số lượng đạt cao nhất ở môi trường NC 20 . Tuy nhiên sau khi xử lý thống kê nhận thấy không có sự khác biệt giữa môi trường NB 15 và NC 20 (P = 0,1113) hay NB 15 và NBB 20 (P = 0,1520). Như vậy xét về mặt kinh tế ở môi trường NB 15 là môi trường cho hiệu quả kinh tế cao. Như vậy qua kết quả ở trên chúng tôi quyết định chọn môi trường NB 15 làm môi trường sản xuất chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus. 4.2.3. Kết quả sản xuất thử và kiểm tra chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus Sau khi chọn được môi trường NB 15 là môi trường tối ưu nhất, chúng tôi tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa L. acidophilus. Sau khi nuôi trên môi trường NB 15 trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng chúng tôi phối trộn với bột đậu nành đã được sấy khử trùng với tỷ lệ là 1:1. Hỗn hợp được sấy khô ở 40 - 45 o C trong 2 ngày sao cho khô hoàn toàn sau đó đem kiểm tra số lượng tế bào Lactobacillus acidophilus có trong 1 gam sản phẩm và tiến hành đóng gói đem bảo quản ở nhiệt độ phòng. Kết quả kiểm tra được trình bày ở bảng 4.11. Lặp lại (n) X (g/100ml) SD C V % 3 1,05 0,035 3,38 3 1,27 0,045 3,54 3 1,32 0,047 3,57 3 1,41 0,035 2,47 3 1,0 0,017 1.61 3 1,27 0,066 5,25 3 1,6 0,017 1,08 3 1,70 0,024 1,42 3 1,13 0,055 4,08 3 1,41 0,047 3.35 3 1,61 0,034 1,8 0,025 1,39 2,15 10% 15% 20% Nồng độ Kết quả NA 0 NA 10 NA 15 NA 20 NB 0 NB 10 NB 15 NB 20 NC 0 NC 10 NC 15 NC 20 Lặp lại (n) X (× 10 10 cfu/g) SD C V % 3 1,093 0,066 6,08 3 1,126 0,267 23,75 3 1,37 0,157 11,47 3 1,45 0,088 6,12 3 3,60 0,156 4,33 3 5,68 0,682 12 3 7,316 0,301 4,11 3 7,993 0,507 6,35 3 3,61 0,19 5,26 3 6,04 0,359 5,94 3 7,596 0,175 3 8,093 0,102 2,31 1,26 . chúng tôi quyết định chọn môi trường NB 15 làm môi trường sản xuất chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus. 4.2.3. Kết quả sản xuất thử và kiểm tra chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus Sau. B. subtilis và hoạt độ enzyme sau khi sản xuất chế phẩm Hình 4.4 . Sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis( màu trắng) trên môi trường A và B. Sau khi chọn được môi trường A là môi trường nhân. lên men đường của Lactobacillus acidophilus Từ kết quả 4.2.1.1, 4.2.1.2 và 4.2.1.3 chúng tôi kết luận được chủng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm đó là vi khuẩn Lactobacillus acidophilus. Từ