11 Trong số các aflatoxin, aflatoxin B 1 được chú ý nhiều nhất do sự hiện diện rộng khắp nhất cũng như do tính độc ngắn hạn và dài hạn của aflatoxin B 1 cao hơn nhiều so với các aflatoxin khác. Từ những cơ sở trên, viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh đã tiến hành thực hiện đề tài Sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt aflatoxin B1. Giá (cột) sắc kí ái lực tạo nên đã cho hiệu quả cao trong phân tích định lượng aflatoxin B 1 . Bên cạnh đó, aflatoxin G1 là độc tố vi nấm chỉ đứng sau aflatoxin B1 về độc tính, cũng có khả năng gây hại cao cho người và vật nuôi, hơn nữa cấu trúc hoá học lại khá tương đồng với aflatoxin B1 nên cũng là một đối tượng quan trọng cần tiến hành nghiên cứu. Được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, sự hướng dẫn của PGS. TSKH Nguyễn Lê Trang - Viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh và TS. Nguyễn Ngọc Hải, tôi tiến hành đề tài “Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất”. 1.2 Mục đích Khảo sát khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch. 1.3 Yêu cầu Xác định các đặc tính của cột ái lực miễn dịch trong việc bắt aflatoxin G1:  Độ nhạy của cột  Độ lặp lại của cột 12 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cương về aflatoxin 2.1.1 Lịch sử phát hiện Năm 1960 ở Anh, một vụ dịch bệnh xảy ra làm chết 100.000 gà tây con, khi mổ xác thấy có xuất huyết hoại tử ở gan kèm tổn thương ở thận mà nguyên nhân không được biết rõ. Do đó, người ta gọi là bệnh “X” của gà tây. Sau đó, những vụ tương tự cũng được quan sát thấy trên vịt con ở Áo, gà giò ở Tây Ban Nha, cá hồi ở Mỹ, trĩ con ở Uganda…Các nhà bác học đã nhanh chóng tìm ra mối liên hệ giữa các vụ ngộ độc đó với việc cho ăn khô dầu đậu phộng và họ cũng thấy rằng bệnh này không những xảy ra đối với gia cầm mà còn với cả gia súc, đặc biệt là heo, bê, cừu… Với những cố gắng phát hiện nguồn độc tố trên các thực phẩm có liên quan, các nhà bác học đã quan sát và phân lập được loài vi nấm Aspergillus flavus trên các hạt đậu mốc và lúa mì mốc. Việc tinh chế các độc tố từ các loại hạt bị nhiễm nấm Aspergillus cho ra một loại hợp chất mà trong bản báo cáo của Forgacs và Carl xuất bản năm 1962, người ta gọi là aflatoxin (A: Aspergillus, fla: flavus và toxin có nghĩa là chất độc). Đến nay, aflatoxin được biết là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp qua con đường polyketide của một số loài nấm thuộc chủng Aspergillus flavus (khoảng 50% chủng), Aspergillus parasiticus (100% chủng) (Klick và Pitt, 1988)[4], Aspergillus nomius; ngoài ra còn có Penicillium spp, Rhizopus spp nhưng ít có vai trò gây bệnh trong thực tế. Ở A. flavus và A. parasiticus, con đường sinh tổng hợp aflatoxin liên quan ít nhất 16 phản ứng enzyme được mã hóa bởi 25 gen tập trung thành nhóm trong một vùng DNA 70 kilobase trên nhiễm sắc thể [19]. (1) (2) Hình 2.1: A. flavus (1) [20] và A. parasiticus (2) [21]. 13 Việc khám phá ra aflatoxin đã kích thích các nhà khoa học nhiều ngành tập trung nghiên cứu về tất cả các mặt của aflatoxin và ảnh hưởng của nó tới sức khoẻ của con người và động vật. 2.1.2 Phân loại Có thể nói Sargeant (1962) là người có công xác định các độc tố này. Chúng là các chất có cấu trúc hoá học rất gần nhau và có khung hoá học giống với dẫn xuất của cumarin nên gọi là flavacumarin. Phân tử aflatoxin gồm một gốc cumarin, 2 nhân furan và 1 vòng lacton [11]. Hiện người ta biết có đến 20 loại aflatoxin (Quinn, 1998)[4]. Các aflatoxin được sản xuất trong tự nhiên gồm 4 loại, kí hiệu AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 (được gọi tên do tính chất phát huỳnh quang dưới tia UV: B: Blue; G: Green). Aflatoxin nhóm B và nhóm G khác nhau ở chỗ nhóm B chỉ có 1 nhóm chức lacton trong khi nhóm G có 2 chức lacton. Các loại aflatoxin khác là do sự chuyển hoá của các aflatoxin trên trong nấm và trong cơ thể động vật.  AFB2 và AFG2 là dẫn xuất hydro hoá của AFB1 và AFG1.  AFB2a và AFG2a là dẫn xuất hemiacetal của AFB1 và AFG1.  AFM1 và AFM2 là dẫn xuất của AFB1 và AFB2 tìm thấy trong sữa, thận và gan động vật.  Ngoài ra: AFGM1, AFGM2, AFM2a, AFGM2a, AFB3 (parasiticol), dihydroaflatoxin B3, Ro (aflatoxicol), dihydoaflatoxicol, AFP1, AFQ1… O OO O O OMe AFB1 F C L P O OO O O O OMe AFG1 F C L F: Vòng furan C: Vòng cumarin L: Vòng lactone P: Vòng pentenone Hình 2.2: C ấu trúc hoá học của AFB1 v à AFG1 . 14 2.1.3 Tính chất hóa lí Aflatoxin dễ bị huỷ bởi những chất kiềm, nhưng tương đối bền với nhiệt. Ở nhiệt độ cao hơn 100 o C chỉ khử được phần nào aflatoxin. Aflatoxin ít tan trong nước, tan trong các dung môi phân cực như: chloroform, acetonitril, aceton, methanol… Aflatoxin không tan trong những dung môi hòa tan chất béo như n-hexan, ether ethylic, ether dầu hoả… Hầu hết các loại aflatoxin đều phát huỳnh quang ở khoảng bước sóng 440 nm khi kích thích bởi ánh sáng có độ dài sóng khoảng 365 nm [10]. Các đặc tính lí hóa được trình bày trong phụ lục 1. 2.1.4 Tác động sinh học Aflatoxin là chất độc nguy hiểm đối với các loài gia súc, gia cầm và con người. Tuy nhiên, mức độ độc hoàn toàn khác nhau, phụ thuộc vào giống loài, lứa tuổi, giới tính, đường xâm nhập, trạng thái sức khoẻ của cơ thể, môi trường và hàm lượng chất độc ăn phải. O O O O O OMe O OO O O O OMe O OO O O OH OMe O O O O O O OH OMe O OO O O OH OMe O OO O O OH OMe AFB2 AFG2 AFB2a AFG2a AFM1 AFM2 Hình 2.3 : Cấu trúc hoá học của các aflatoxin. 15 Hấp thu qua đường tiêu hoá là giai đoạn đầu tiên của sự xâm nhập AFB1 vào cơ thể với 3 kiểu hấp thu qua niêm mạc ruột: khuyếch tán, hoà tan trong lipid và vận chuyển nhờ protein mang. Sau đó, AFB1 được vận chuyển trong hệ tuần hoàn nhờ liên kết với các tế bào máu hoặc protein huyết tương (90% ở dạng liên kết với albumin). Sau khi vào gan qua hệ thống tĩnh mạch cửa, AFB1 tập trung chủ yếu ở gan [11]. Tại đây, AFB1 có sự chuyển hóa phức tạp: Các chất chuyển hóa được cơ thể cố gắng bài thải, như: AFM1 và AFM2 qua sữa; AFP1 và AFQ1 qua nước tiểu. Đáng kể, dưới xúc tác của hệ enzyme monooxygenase trong cytochrome P450 (CYP 450) rất phong phú ở tế bào gan, chất tạo thành là AFB1-8,9-epoxide được coi như chất biến dưỡng có hoạt tính rất cao, có thể gắn với các đaị phân tử (DNA, RNA và protein) làm rối loạn hoạt động bình thường của tế bào (Swenson, 1975). O OO O O OMe O O O O OHH OMe O OO O O O OMe O O O O O OH OH OMe O O O CH 3 O O O OO O O OH OMe O OO O O OH OMe O OO O O OH OMe Protein adducts GLUCURONIDE Conjugates DNA adducts AFB1-8,9-epoxide Aflatoxicol AFB1 AFP1 AFQ1 AFM1 AFB2a Milk AFB1-dhd Hình 2.4: Các sản phẩm chuyển hoá cuả AFB1 [13]. 16 2.1.4.1 Độc tính cấp của aflatoxin Nhiễm độc cấp tính khi ăn phải một lượng lớn aflatoxin. Thú non mẫn cảm hơn thú trưởng thành, gia cầm mẫn cảm hơn gia súc, được biểu hiện theo thứ tự sau: Vịt > gà tây > ngỗng > ngan > gà > chó > heo > bò > ngựa > cừu (Allcroft, 1962) [11]. Tính gây độc cấp thể hiện qua liều gây chết 50% (LD 50 ). Bảng 2.1: LD 50 của AFB1 cho uống một lần duy nhất trên động vật (Ciegler, 1975) [2] Loài động vật (Xếp theo thứ tự mẫn cảm) LD 50 (mg/ kg thể trọng) Vịt con 0,3-0,6 Heo 0,6 Cá hồi 0,8 Chó 1,0 Chuột lang 1,4-2,0 Cừu 2,0 Khỉ 2,2 Chuột cống 5,5-17,9 Gà 6,3 Chuột bạch 9,0 Theo bảng trên và bảng xếp loại các độc chất dựa vào liều LD 50 trên động vật (xem phụ lục 2), có thể thấy aflatoxin thuộc nhóm độc tố cực độc. Triệu chứng nhiễm độc thể hiện qua sự tổn thương ở gan và triệu chứng thần kinh như nằm liệt và co giật. Chết có thể xảy ra đột ngột sau một thời gian ngắn, thường dưới 72 giờ. Giải phẫu bệnh cho thấy hoại tử và chảy máu ở nhu mô gan, viêm tiểu cầu thận cấp, tụ máu ở phổi [11]. Nguyên nhân gây chết là do gan bị huỷ hoại rất nhanh (necrosis) theo cơ chế phân tử: 17 Ở đây, nhóm Dialdehyd phản ứng với nhóm amin của protein để tạo thành kiềm Shiff (Shiff’s base). Các kiềm Shiff có thể ức chế sinh tổng hợp DNA, RNA dẫn đến ngăn cản tổng hợp protein làm cho hoạt động ở gan bị rối loạn tạo nên tình trạng nhiễm độc cấp tính. Như vậy, AFG1 cũng có thể tạo thành kiềm Shiff do cũng mang liên kết đôi ở vị trí 8,9 ở đầu cùng trên vòng furan. Liên kết này được bão hoà trong cấu trúc của AFB2 và AFG2, do đó, không thể trực tiếp tạo thành kiềm Shiff nên mang tính độc ít hơn so với AFB1 và AFG1[5]. 2.1.4.2 Độc tính mãn Thường xảy ra nhiều hơn so với nhiễm độc cấp tính và có tác động dài hơn do cơ thể có thể chịu đựng được một mức nào đó trong khẩu phần. Khi có sự nhiễm độc mãn tính, các triệu chứng thấy được là kém ăn và chậm lớn; gan chịu ảnh hưởng nhiều nhất: gan tụ huyết, xuất huyết. Khi kiểm tra vi thể thì xuất hiện sự thoái hoá tế bào biểu mô, thoái hoá mỡ gan, tế bào lympho bị thâm nhiễm. Nhiễm độc kéo dài sẽ gây đột biến, ung thư gan. Nếu nhiễm aflatoxin trong thời kì mang thai, thai sẽ bị tật, chết hoặc sinh quái thai (Nguyễn Lê Trang, 2003) [2]. Năm 1988, IARC đã xếp AFB1 vào danh sách những tác nhân gây ung thư cho người, đặc biệt là ung thư gan [22]. Nếu hấp thu 2,5 mg aflatoxin trong 89 ngày sẽ thấy xuất hiện ung thư gan sau một năm. Tại Việt Nam đã có công trình nghiên cứu tìm O OO O O OMe O O O O O OH OH OMe enzyme Gan O O O CH O OH H C H O OMe O OMe N N H C=O CH R3 R4 N H R2 C=O O O O C H O OH H C H NC H R1 AFB1 AFB1-dhd acid base (pH=7,4) protein Di-aldehyd resonance hybrid Shiff's base Hình 2.5: Cơ chế tác dụng của AFB1 ở mức tế bào gan (Cliford and Rees, 1967) [5] 18 aflatoxin trong dịch cổ trướng bệnh nhân ung thư nguyên phát đều có hàm lượng từ 1,1 – 3,5 ppb [13]. Cơ chế phân tử của nhiễm độc mãn tính: AFB1-8,9-epoxide gắn kết đồng trị lên DNA ở vị trí N7 của một guanine. Do cầu nối glycoside mất ổn định, nhóm purine có thể bị tách khỏi DNA. Hoặc khả năng khác là vòng imidazole trong cấu trúc purine bị mở ra thành cấu trúc formamidopyrimidine (AFB1-FAPY) ổn định và tồn tại trong điều kiện sinh học. Các điểm đột biến do AFB1 thường nhận thấy là sự đảo chuyển GC TA (dị hoán). Điểm nóng của đột biến đã được phát hiện là ở vị trí thứ ba trong đơn vị mã (codon) 249 của gen p53. Gen này mã hoá cho một phosphoprotein có hoạt tính tăng cường hoặc kiềm chế phiên mã của một số gen có chức năng kiểm soát chu trình nhân lên của tế bào, để ngăn ngừa tế bào tăng sinh thành tổ chức bất thường, có thể dẫn đến hình thành u. Khi cấu trúc DNA bị biến đổi, tế bào phản ứng lại bằng cách thể hiện nhiều phosphoprotein p53 để ức chế sự sao chép của DNA bị biến đổi. Nếu thời gian sửa O OO O O O OMe O O O O N N O O OMe OH NH 2 O OPO 3 O 3 PO NH N + DNA O OH O 3 PO OPO 3 - - O O O O N N H O O OMe OH NH 2 O OPO 3 O 3 PO NH N CHO AFB1-N7-Gua AP Site AFB1-FAPY DNA Adduct AFB1-8,9-exo epoxide AFB1-N7-Gua DNA Adduct Hình 2.6: AFB1-8,9-epoxide gắn vào DNA (Smela và ctv, 2001) [14]. 19 chữa lại DNA kịp thời (do một số enzyme) trước khi DNA biến đổi được sao chép, bảo tồn di truyền được ổn định. Các chất độc di truyền tác động trực tiếp hay gián tiếp đều làm tăng mức protein p53 tế bào. Khi AFB1 tác động vào gen p53 làm protein p53 bị biến đổi, mất hoạt tính, hậu quả là tế bào tăng trưởng không kiểm soát dẫn đến hình thành khối u (Bennett và Klich, 2003) [14]. Liên quan giữa nhiễm siêu vi viêm gan B (HBV), ung thư tế bào gan và vai trò của p53 cũng đã được khảo sát và nghiên cứu nhiều. Với bệnh nhân trong nước tiểu có AFB1-N7-Gua, tỉ lệ phát ung thư tế bào gan cao hơn 3 lần so với trường hợp âm tính. Với bệnh nhân có kháng nguyên bề mặt HbsAg trong huyết thanh, tỉ lệ này là 6 lần cao hơn bệnh nhân âm tính HbsAg. Và nếu xuất hiện cả AFB1-N7-Gua và HbsAg, tỉ lệ này cao gấp 60 lần [14]. 2.1.5 Sự hiện diện của aflatoxin trong thực phẩm Theo tài liệu của FAO, không có thực phẩm nào được xem như an toàn tuyệt đối khỏi sự nhiễm độc tố vi nấm, và sự nhiễm độc tố này xảy ra ở mọi giai đoạn từ lúc cây trồng còn ở ngoài đồng đến khi thu hoạch, chế biến, bảo quản và vận chuyển. Và theo ước tính của FAO, hơn 25% sản phẩm nông nghiệp trên thế giới bị nhiễm độc tố vi nấm [4]. Hầu hết các số liệu liên quan cho thấy sự nhiễm aflatoxin thường xảy ra nhất ở đậu phộng và các sản phẩm từ đậu phộng, bắp và các loại hạt khác như gạo, lúa mì, đậu nành, hạt bông vải… Theo Carlos A. Muro-Cacho (2004), sự tiêu thụ aflatoxin của con người từ 0 – 30000 ng/kg/ngày, trung bình từ 10 – 200 ng/kg/ngày [15]. Nước ta có điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm thích hợp cho sự phát triển vi nấm và sản sinh độc tố trong thực phẩm, nhất là aflatoxin. Do đó, vấn đề an toàn thực phẩm được đặt ra nhằm hạn chế những thiệt hại về kinh tế (gây chết đàn vịt, gà, lợn…) cũng như bảo đảm an toàn thực phẩm cho người, vì những dạng chuyển hóa của aflatoxin còn độc tính vẫn có thể hiện diện trong gan, sữa, trứng, là những thức ăn hằng ngày của người. 2.1.6 Giới hạn về hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc Aflatoxin hiện diện trong thực phẩm như là một sự nhiễm bẩn tự nhiên nên con người không thể kiểm soát để ngăn chặn chúng. Dựa vào nhiều yếu tố như: số liệu giám sát, sự phân bố aflatoxin trong thực phẩm, dữ liệu về độc chất học, phương pháp phân tích và tiêu chuẩn cho phép của các quốc gia có quan hệ mua bán với nhau mà 20 từng quốc gia, từng khu vực trên thế giới ra các quy định giới hạn hàm lượng aflatoxin tổng cộng tối đa cho phép trong các loại thực phẩm và thức ăn gia súc khác nhau. Bảng 2.2: Quy định hạn chế mức nhiễm aflatoxinB1 trong thực phẩm ở Pháp [14] Loaị thực phẩm Đối tượng sử dụng Giới hạn (ppb) Sữa nước Trẻ em < 3 tuổi 0,03 Sữa bột Trẻ em < 3 tuổi 0,3 Sữa nước Thông dụng 0,05 Sữa bột Thông dụng 0,5 Dầu ăn và các chất béo 5 Thực phẩm Trẻ em và thiếu niên 1 Thực phẩm Các loaị 10 Ở Việt Nam, giới hạn về hàm lượng aflatoxin cho phép có trong thực phẩm hiện đang áp dụng theo Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực phẩm ban hành kèm theo quyết định số 867/1998 / QĐ-BYT. Bảng 2.3: Giới hạn nhiễm độc tố vi nấm trong thực phẩm ở Việt Nam STT Tên độc tố vi nấm Sản phẩm Giới hạn nhiễm tối đa cho phép (ppm) 1 Aflatoxin tổng số hoặc B1 Thức ăn 10 2 Aflatoxin M1 Sữa 0.5 3 Các độc tố vi nấm khác Thức ăn 35 Bảng 2.4: Hàm lượng tối đa aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp cho gia súc, gia cầm. Loại vật nuôi AFB1 (ppb) AFT tổng (ppb) Gà con từ 1-28 ngày tuổi  20  30 Nhóm gà còn lại  30  50 Vịt con từ 1-28 ngày tuổi Không có  10 Nhóm vịt còn lại  10  20 Lợn con theo mẹ từ 1-28 ngày tuổi  10  30 Nhóm lợn còn lại  100  200 Bò nuôi lấy sữa  20  50 . của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp. HCM sản xuất . 1 .2 Mục đích Khảo sát khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch. 1.3 Yêu cầu Xác định các đặc tính của cột ái lực miễn dịch. trên, viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh đã tiến hành thực hiện đề tài Sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt aflatoxin B1. Giá (cột) sắc kí ái lực tạo nên đã cho hiệu quả cao trong phân tích định lượng aflatoxin. công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, sự hướng dẫn của PGS. TSKH Nguyễn Lê Trang - Viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh và TS. Nguyễn Ngọc Hải, tôi tiến hành đề tài Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của