BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHAN THỊ MINH PHƯƠNG XÁC ĐỊNH CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU PROTEIN KINASE HOẠT HÓA PHÂN BÀO (MAPK) TRONG UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN GIÁP LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Chuyên ngành: Miễn Dịch Mã số: 62.72.04.20 HÀ NỘI – 2010 MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng, biểu đồ Danh mục các hình vẽ, ảnh ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Tổng quan về ung thư biểu mô tuyến giáp 4 1.2. Các con đường tín hiệu và quá trình phát sinh, phát triển ung thư 8 1.3. Protein tương tác với Heparansulfate (Heparan Sulfate Interacting Protein: HIP) và vai trò của HIP trong ung thư 23 1.4. Thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (Epidermal Growth Factor Receptor: EGFR) và vai trò của EGFR trong ung thư 31 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1. Đối tượng nghiên cứu 35 2.2. Phương pháp nghiên cứu 36 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 51 2.4. Quản lý thông tin, phân tích dữ liệu 52 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53 3.1. Kết quả tách chiết và độ tinh sạch RNA 53 3.2. Kết quả nghiên cứu sự tham gia của HIP trong ung thư biểu mô tuyến giáp 54 3.3. Kết quả nghiên cứu sự tham gia của EGFR trong ung thư biểu mô tuyến giáp 67 3.4. Tương quan giữa HIP và EGFR trong mô ung thư biểu mô tuyến giáp 74 3.5. Kết quả sự hiện diện của các Protein ERK1 và ERK2 trên tế bào ung thư biểu mô nuôi cấy 75 Chương 4. BÀN LUẬN 79 4.1. Tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA 79 4.2. Vai trò của Heparansulfate Interacting Protein (HIP) trong ung thư biểu mô tuyến giáp 80 4.3. Vai trò của EGFR trong ung thư biểu mô tuyến giáp 92 4.4. Tương quan giữa HIP và EGFR trong mô ung thư biểu mô tuyến giáp 104 4.5. Sự biểu lộ của các Protein ERK1 và ERK2 trên tế bào ung thư biểu mô nuôi cấy 106 KẾT LUẬN 110 KIẾN NGHỊ 111 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ Bảng 3.1. Độ tinh sạch và nồng độ của RNA tách chiết trên mẫu nghiên cứu 54 Bảng 3.2. Mức độ sao chép của HIP ở mô bướu giáp keo và mô UTBM tuyến giáp 56 Bảng 3.3. Mức độ sao chép của HIP và kích thước u 60 Bảng 3.4. Mức độ sao chép của HIP và tình trạng di căn hạch 60 Bảng 3.5: So sánh mức độ sao chép của HIP theo giai đoạn ung thư 61 Bảng 3.6. Kết quả tách chiết protein và nồng độ protein 62 Bảng 3.7. Kết quả Western blot mức độ biểu lộ HIP 65 Bảng 3.8. Mức độ sao chép của EGFR ở mô bướu giáp keo và mô UTBM tuyến giáp 69 Bảng 3.9. Mức độ sao chép của EGFR và kích thước u 71 Bảng 3.10. So sánh mức độ sao chép của EGFR và tình trạng di căn hạch 72 Bảng 3.11. So sánh mức độ sao chép của EGFR theo giai đoạn ung thư 73 Biểu đồ 3.1: So sánh sự sao chép của HIP ở mô bướu giáp keo và mô ung thư tuyến giáp 57 Biểu đồ 3.2. So sánh mức độ sao chép của HIP ở mô bướu giáp keo và mô ung thư biểu mô tuyến giáp bằng RT-PCR định lượng 59 Biểu đồ 3.3. Mức độ biểu lộ HIP ở mô bướu giáp và mô ung thư theo loại mô học 65 Biểu đồ 3.4. Tương quan giữa mức độ sao chép và mức độ biểu lộ của HIP 66 Biểu đồ 3.5. So sánh sự sao chép của EGFR ở mô bướu giáp keo và mô ung thư tuyến giáp 70 Biểu đồ 3.6. Tương quan giữa HIP và EGFR trên mô ung thư biểu mô tuyến giáp nghiên cứu 74 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ẢNH Hình 1.1. Tuyến giáp và cấu trúc nang giáp 4 Hình 1.2. Con đường tín hiệu MAPK 13 Hình 1.3. Cấu trúc mô phỏng các vùng chức năng của HIP 25 Hình 1.4. Hoạt hóa EGFR bởi EGF 31 Hình 1.5. Con đường tín hiệu MAPK hoạt hoá bởi EGF 33 Hình 2.1. Quy trình tách chiết RNA từ mô tươi 38 Hình 2.2. Hình ảnh minh họa phương pháp Western blot 47 Hình 2.3. Sơ đồ phương pháp hoá mô miễn dịch với phức hợp Avidin-Biotin 49 Ảnh 3.1. Hình ảnh điện di kiểm tra RNA tách chiết từ mô tuyến giáp trên gel agarose 0,8%, điện thế 100V trong 10 phút 53 Ảnh 3.2. Kết quả phản ứng RT-PCR của gen HIP và GAPDH trên mô bướu giáp keo và mô ung thư biểu mô tuyến giáp. 55 Ảnh 3.3. Kết quả phản ứng RT-PCR của gen HIP và GAPDH trên mô bướu giáp keo và mô ung thư 55 Ảnh 3.4. Kết quả RT-PCR định lượng đánh giá mức độ sao chép HIP ở mô bướu giáp keo và mô UTBM tuyến giáp sử dụng kỹ thuật điện di mao quản 58 Ảnh 3.5. Kết quả sao chép mRNA của HIP theo giai đoạn ung thư 61 Ảnh 3.6. Hình ảnh nhuộm Coomasie blue sau điện di SDS-PAGE protein tổng số tách chiết từ mô ung thư và bướu giáp keo 63 Ảnh 3.7. Kết quả Western blot đánh giá mức độ biểu lộ HIP ở mô ung thư và bướu giáp keo lành tính 64 Ảnh 3.8. Kết quả Western blot đánh giá mức độ biểu lộ HIP ở mô ung thư và mô bướu giáp keo lành tính 64 Ảnh 3.9. Kết quả phản ứng RT - PCR của gen EGFR và GAPDH trên mô bướu giáp keo và mô ung thư biểu mô tuyến giáp 67 Ảnh 3.10. Kết quả phản ứng RT - PCR của gen EGFR và GAPDH trên mô bướu giáp keo và mô ung thư biểu mô tuyến giáp 68 Ảnh 3.11. Kết quả phản ứng RT - PCR của gen EGFR và GAPDH trên mô bướu giáp keo và mô UTBM tuyến giáp 68 Ảnh 3.12. Tế bào ung thư biểu mô nuôi cấy trong môi trường FBS sau 24h. 75 Ảnh 3.13. Tế bào ung thư biểu mô nuôi cấy trong môi trường FBS 76 Ảnh 3.14. Nhuộm Coomasie blue sau điện di SDS-PAGE protein tổng số tách chiết từ tế bào nuôi cấy. 77 Ảnh 3.15. Kết quả Western blot xác định sự biểu lộ hai protein ERK1 và ERK2 ở dòng tế bào ung thư biểu mô nuôi cấy 77 Ảnh 4.1. Hình ảnh các loại mô học của khối u tuyến giáp……………… 99 Các chữ viết tắt bFGF Basic Fibroblast Growth Factor (yu t phỏt trin nguyờn bo si kim tớnh) bp base pair (đơn vị đo s lng các acid nucleic) CDK Cyclin- dependent kinase (kinase ph thuc cyclin) cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid (ADN bổ sung) DNA Deoxyribonucleic Acid EGF Epidermal growth factor (yếu tố phát triển biểu mô) EGFR Epidermal growth factor Receptor (thụ thể của yếu tố phát triển biểu mô) ERK Extracellular signal regulated kinase (Kinase đợc điều hòa bởi tín hiệu ngoại bào) FBS Fetal Bovine Serum ( huyết thanh phôi bò) GAPDH Glyceraldehyd phosphate dehydrogenase GF Growth Factor (yu t phỏt trin) GFR Growth Factor Receptor (th th yu t phỏt trin ) HIP Heparansulfate Interacting Protein (protein tng tỏc vi Heparansulfate) HMDM Hoỏ min dch mụ HP/HS Heparin v Heparansulfate kD Kilo Dalton (đơn vị đo trọng lợng protein) MAPK Mitogen Activated Protein kinase (Protein kinase ho¹t hãa ph©n bµo) MEK Mitogen Activated Protein kinase kinase (Kinase cña protein kinase ho¹t hãa ph©n bµo) mRNA Message Ribonucleic Acid (ARN thông tin) RNA Ribonucleic Acid PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi) PI3K Phosphoinositide 3-Kinase PTC Papillary Thyroid Carcinoma (ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú) RAF Protein RAF RAS Protein RAS RTK Receptor Tyrosin kinase RT-PCR Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi với enzyme sao chép ngược) TF Transcription factor (yếu tố sao chép) TGF Transforming Growth factor (yÕu tè ph¸t triÓn chuyển dạng) UTBM Ung thư biểu mô WNT Protein WNT 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh ung thư ngày càng có xu hướng gia tăng trong những thập niên gần đây. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới, hàng năm trên toàn cầu có khoảng trên 10 triệu người mắc bệnh ung thư và khoảng trên 6 triệu người chết do căn bệnh này. Ở nước ta, theo ghi nhận sơ bộ ở Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh thành khác, ước tính mỗi năm có khoảng 150.000 trường hợp mới mắc và khoảng 75.000 người chết vì ung thư. Tuy nhiên, căn bệnh ung thư vẫn có thể chữa khỏi nếu được phát hiện sớm và điều trị kịp thời; người mắc bệnh ung thư có thể kéo dài thời gian sống, nâng cao chất lượng cuộc sống nếu có được phương pháp điều trị phù hợp và tận gốc [5]. Chính vì thế, việc nghiên cứu tìm hiểu cơ chế bệnh sinh ung thư để từ đó tìm ra phương pháp điều trị can thiệp là mối quan tâm hàng đầu của các nhà Y-Sinh học hiện nay. Trong khuynh hướng nghiên cứu về cơ chế bệnh sinh ung thư nói chung và ung thư tuyến giáp nói riêng, các nhà khoa học đi theo hai hướng tiếp cận chính: i) nghiên cứu về di truyền phân tử tế bào nhằm tìm ra các gen gây ung thư hay các thương tổn của hệ di truyền tế bào do các tác nhân tại chỗ hay các tác nhân bên ngoài; ii) nghiên cứu về protein trong đó các protein màng là mục tiêu chính. Các protein màng đóng vai trò quan trọng trong việc tiếp nhận, dẫn truyền tín hiệu tế bào-tế bào hay khoảng gian bào-tế bào. Các kênh tín hiệu này có chức năng quan trọng trong quá trình trưởng thành, phát triển, biệt hóa và di truyền của tế bào. Cho đến nay rất nhiều protein thuộc loại này tương ứng với nhiều kênh dẫn truyền tín hiệu khác nhau đã được phát hiện, trong đó có: thụ thể 2 của yếu tố phát triển biểu mô (EGFR) và protein tương tác với heparan sulfate (HIP). Sự thể hiện của các protein này phản ánh chặt chẽ tình trạng hoạt động của tế bào. Các thụ thể trên bề mặt màng tế bào có vai trò tiếp nhận các tín hiệu điều hoà tăng sinh, biệt hóa tế bào từ các yếu tố có trong khoảng gian bào như EGF, trophin, cytokin, hormon… Tùy theo bản chất tín hiệu đến tế bào mà chúng có thể được dẫn truyền theo nhiều kênh dẫn truyền khác nhau như: Hedgehog; Wnt; PI3K; MAPK (mitogen activated protein kinase) Nhiều nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, thông tin tín hiệu được tiếp nhận qua thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR) và protein tương tác với heparan sulfate (HIP) được truyền qua con đường tín hiệu của MAPK mà dạng nguyên mẫu của nó là các protein ERK1 và ERK2 [27], [144]. Tín hiệu này sau đó được chuyển vào nhân tế bào, qua một loạt các phản ứng dây chuyền để tác động lên quá trình sao chép DNA và qua đó tham gia điều hoà sự tăng sinh và biệt hóa tế bào. Nhiều đột biến của các yếu tố tín hiệu dọc theo con đường MAPK đã được phát hiện trong ung thư biểu mô tuyến giáp. Vì vậy ung thư biểu mô tuyến giáp là mô hình phù hợp cho việc thiết kế nghiên cứu này. Hoạt động của các con đường tín hiệu chịu sự điều hòa chặt chẽ bởi các yếu tố ở khoảng gian bào trong đó có các sản phẩm của quá trình đáp ứng miễn dịch như cytokin, interleukin, các peptid, yếu tố phát triển Chính vì vậy, việc nghiên cứu cơ chế phân tử của quá trình dẫn truyền tín hiệu trong ung thư nói chung và ung thư tuyến giáp nói riêng còn phải được đặt trong một cái nhìn tổng thể về sự điều hòa, đáp ứng miễn dịch tại chỗ hoặc toàn thân của cơ thể chủ [10]. Đồng thời nghiên cứu con đường dẫn truyền tín hiệu trong ung thư sẽ kích hoạt khả năng chọn lựa liệu pháp điều trị mới- liệu pháp [...]... cản con đường dẫn truyền tín hiệu- giúp kiểm soát ung thư trong tầm với của y học Vì vậy đề tài: Xác định con đường tín hiệu protein kinase hoạt hóa phân bào (MAPK) trong ung thư biểu mô tuyến giáp được tiến hành với các mục tiêu sau: 1 Xác định sự sao chép và biểu lộ của protein tương tác với heparan sulfate (HIP) và thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR) ở mô ung thư biểu mô tuyến giáp 2 Xác định. .. xuất hiện ung thư và trong những tình huống này con đường tín hiệu sẽ trở thành con đường tín hiệu sinh ung thư Sự hoạt động không phù hợp hoặc là sự bất hoạt của các con đường tín hiệu là yếu tố quyết định đối với sự tiến triển ung thư ở người Nhiều gen sinh ung thư và nhiều gen ức chế ung thư cũng hoạt động trong khuôn khổ con đường tín hiệu sinh ung thư này [104], [108] Các con đường tín hiệu có... EGFR ở mô ung thư biểu mô tuyến giáp 3 Xác định sự biểu lộ của protein ERK1 và ERK2 ở tế bào ung thư biểu mô nuôi cấy 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN GIÁP 1.1.1 Cấu trúc tuyến giáp Tế bào nang Chất keo Nang giáp Tuyến giáp Nhìn thẳng Nhìn nghiêng Tuyến cận giáp trên Thùy bên Eo Thùy bên Tuyến giáp Tuyến cận giáp dưới T ế Hình 1.1 Tuyến giáp và cấu trúc nang giáp. .. như sau: - Các tín hiệu ngoại bào (GF, cytokin, hormon…) - Các tín hiệu ở màng tế bào (thụ thể màng tế bào) - Các tín hiệu ở bào tương (RAS, RAF, ERK của con đường MAPK; PDK và AKT của con đường PI3K; con đường WNT…) - Các tín hiệu trong nhân tế bào (Jun, Myc…) Trong khuôn khổ của đề tài này, con đường tín hiệu protein kinase hoạt hóa phân bào (MAPK) được nhấn mạnh 1.2.1 Con đường tín hiệu MAPK (Mitogen... những tế bào lớn, hình cầu, sáng màu Hai loại tế bào nang và tế bào C đều có thể ác tính hóa để trở thành ung thư tuyến giáp với các thể loại tế bào học khác nhau [105] 5 1.1.2 Dịch tễ học ung thư biểu mô tuyến giáp Ung thư biểu mô tuyến giáp là sự ác tính của lớp tế bào biểu mô chế tiết thành các nang tuyến Với một tỷ lệ gia tăng trên khắp thế giới, ung thư biểu mô tuyến giáp đứng hàng thứ bảy trong. .. suất cao trong các loại ung thư khác khẳng định tầm quan trọng của con đường tín hiệu RASRAF-MEK-ERK trong việc khởi động bệnh sinh ung thư 1.2.3.3 Các biến đổi của con đường RAF-MEK-ERK và thể loại ung thư tuyến giáp Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy ung thư biểu mô tuyến giáp liên quan với việc hoạt hóa liên tục các yếu tố thuộc con đường tín hiệu RETRAS-RAF-MAPK, con đường được tạo nên hoặc... trên một con đường tín hiệu sinh ung thư với nhau; đồng thời cũng gợi ý rằng RAS tác động gây hoạt hóa BRAF ở các loại hình ung thư này [103], [142] Sự hoạt hóa con đường JNK MAPK (JNK: Jun kinase N tận- một con đường thành viên khác trong con đường tín hiệu MAPK) bởi RAS là một khía cạnh khác trong chức năng đa chiều của các protein này Sự tăng cường hoạt hóa của protein RAS ở tế bào bình thư ng có... con đường tín hiệu trong ung thư biểu mô tuyến giáp Sự phát triển tế bào tuyến giáp đòi hỏi tác động phối hợp của TSH, hoạt động theo hướng AMP vòng và tín hiệu của yếu tố phát triển, hoạt động chủ yếu qua MAPkinase và PI3K [69] Vì vậy, điều đó phù hợp với thực tế rằng những biến đổi của các yếu tố hiệu ứng dọc theo các con đường tín hiệu tương ứng đóng vai trò nổi bật trong bệnh sinh của ung thư tuyến. .. học bị bất hoạt thì tế bào buộc phải vận chuyển sang trạng thái phân chia hoạt động [78] 1.2.1.3 Vai trò con đường tín hiệu MAPK trong ung thư Sự hoạt hóa liên tục con đường tín hiệu RAS-MEK-ERK là phổ biến đối với nhiều loại ung thư Xấp xỉ 15% ung thư ở người có sự biến đổi hoạt động của RAS [80] và biến đổi BRAF gần đây được xác định qua sàng lọc trên phạm vi rộng các gen đột biến trong ung thư ở người... (Mitogen Activated Protein Kinase) 1.2.1.1 Các thành viên của con đường tín hiệu MAPK MAPK là một gia đình lớn của các protein kinase serine/threonine liên quan với nhiều hoạt động của tế bào như là tăng sinh, biệt hóa, chết tế bào Các protein tín hiệu ở bào tương qua con đường MAPK gồm có RAF, MEK và protein ERK Ở tế bào bình thư ng, nó tiếp nhận các tín hiệu từ sự hoạt hóa các thụ thể tyrosin kinase (Receptor . triển biểu mô (EGFR) ở mô ung thư biểu mô tuyến giáp. 2. Xác định mối tương quan của HIP và EGFR ở mô ung thư biểu mô tuyến giáp. 3. Xác định sự biểu lộ của protein ERK1 và ERK2 ở tế bào ung thư. tài: “Xác định con đường tín hiệu protein kinase hoạt hóa phân bào (MAPK) trong ung thư biểu mô tuyến giáp được tiến hành với các mục tiêu sau: 1. Xác định sự sao chép và biểu lộ của protein. EGFR trong ung thư biểu mô tuyến giáp 92 4.4. Tương quan giữa HIP và EGFR trong mô ung thư biểu mô tuyến giáp 104 4.5. Sự biểu lộ của các Protein ERK1 và ERK2 trên tế bào ung thư biểu mô nuôi