Ly trích/tách chiết RNA AA(A) n Tổng hợp cDNA Primer đặc hiệu Primer oligo dT Random hexamer primer AA(A) n AA(A) n GSP AA(A) n Oligo dT N 6 N 6 AA(A) n AA(A) n AA(A) n Chu kỳ I của PCR Chu kỳ I của PCR Chu kỳ I của PCR AA(A) n AA(A) n AA(A) n Primer xuôi Primer xuôi Primer xuôi AA(A) n AA(A) n AA(A) n Chu kỳ II của PCR Chu kỳ II của PCR Chu kỳ II của PCR Primer ngược Primer xuôi Tiếp tục chu kỳ nhiệt Sơ đồ 2.1. Quá trình hoạt động của các primer trong phiên mã ngược(13) 19 Phần III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian thực hiện khoá luận tốt nghiệp kéo dài từ ngày 01/03/2005 đến ngày 15/08/2005 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.2. Nội dung nghiên cứu Xây dựng quy trình RT-PCR phát hiện virus PRRS từ ba nguồn Taq khác nhau. Xây dựng quy trình điện di để phát hiện RNA tổng số. Ly trích RNA từ dịch nuôi cấy tế bào và huyết thanh của heo nghi nhiễm PRRSV bằng cách sử dụng hai phương pháp ly trích theo bộ kit và sử dụng TRIzol. Chẩn đoán virus PRRS từ mẫu thu nhận bằng quy trình RT-PCR đã thiết lập. 3.3. Vật liệu và hoá chất 3.3.1. Mẫu xét nghiệm Mẫu RNA chuẩn được cung cấp từ Trung tâm chẩn đoán xét nghiệm Ploufragan (Pháp). Mẫu nuôi cấy tế bào (trước đó đã kiểm tra cho kết quả ELISA dương tính) được cung cấp từ Trung Tâm Thú Y Vùng Thành Phố Hồ Chí Minh: 10 mẫu Mẫu huyết thanh và mẫu phổi được thu nhận từ các trại heo: 71 lượt mẫu. Trong đó mẫu huyết thanh là 41 mẫu, mẫu phổi là 6 mẫu. 3.3.2. Cặp primer trong phản ứng RT-PCR Cặp primer theo tác giả Rovira được thiết kế dựa vào trình tự của vùng đọc mở số 7 (ORF7) của virus PRRS giống Olot/91 (Rovira và cộng sự) và được cung cấp bởi công ty sản xuất primer: Proligo Primers and Probe. Đây là primer đặc hiệu cho virus PRRS, chúng có khả năng khuếch đại đặc hiệu một đoạn có kích thước khoảng 400bp. Cặp primer P1, P2 theo tác giả Meritxel Donadeu, 1999 được thiết kế có khả năng khuếch đại đoạn có kích thước 271bp đối với chủng PRRSV Châu Âu và 280bp đối với chúng PRRSV Châu Mỹ. Trình tự các cặp primer này như sau: 20 Bảng 3.1. Các cặp primer sử dụng trong phản ứng Tên Trình tự nucleotide (5’ đến 3’) Vị trí trên genome P1 CCA GCC AGT CAA TAC RCT GTG 14647 đến 14667 (Lelystad) 2948 đến 2968 (VR2332) P2 GCG AAT CAG GCG CAC WGT ATG 14938 đến 14918 (Lelystad) 3248 đến 3228 (VR2332) Rovira 1 CCT CGT CAA GTA TGG CCG GTA Độ dài đoạn gene nhân lên: 400bp Rovira 2 GAC TGT CAA ATT AGC TTG CAC CC 3.3.3. Vật liệu và hóa chất cho chiết tách RNA a. Bộ kit chiết tách RNA của công ty QIAGEN: QIAamp ® Viral RNA Mini Kit b. Vật liệu và hóa chất trong phương pháp Sử dụng TRIzol - Chất phản ứng TRIzol (Tripure Isolation Reagent, Boehringer Mannheim) - Chloroform - Glycerol - Isopropanol - Ethanol 75 % - Nước cất hai lần khử ion và khử RNase bằng cách xử lý với DEPC (diethyl pyrocarbonate) 3.3.4. Vật liệu và hóa chất điện di RNA - Gel biến tính - Dung dịch biến tính và đặt mẫu - Dung dịch MOPS dùng cho điện di RNA 3.3.5. Vật liệu và hóa chất sử dụng cho RT-PCR - Nước không có RNase - TaqBeat ™ Hot Start Polymerase wax beads (Promega) - Taq polymerase (Biorad) - Taq DNA Polymerase (ABgene) - dATP, dTTP, dGTP, dCTP (Promega ) - Cặp mồi - RNA mẫu chuẩn 21 - RNA thu được từ mẫu ly trích - AMV reverse transcriptase (Promega) - MgCl 2 (Promega) - Recombinant RNasin ® Ribonuclease Inhibitor (Promega) - Reverse transcription 10X buffer (Promega) 3.3.6. Vật liệu và hoá chất cho điện di sản phẩm RT - PCR - Agarose (Biorad) - TBE 0.5X (Tris HCl, acid boric, Na 2 EDTA, Nước cất hai lần khử ion đã hấp khử trùng) - Loading dye (Bromophenol blue, sucrose, TE) - Ladder 100bp - Ethidium bromide 3.4. Thiết bị và dụng cụ - Tủ cấy vô trùng - Máy ly tâm (Mikro Z2K/ Sigma 3K30C) - Tủ -70 0 C ( Sanyo Ultra Low) - Tủ - 20 0 C ( CFC Free Sanyo Brandt) - Tủ mát 4 0 C - Máy vi sóng (Electrolux) - Máy chụp gel (Biorad) - Máy PCR (BioRad) - Máy vortex - Bộ nguồn và bồn điện di - Micropipet, đầu tip và eppendorf 3.5. Các phƣơng pháp 3.5.1. Bảo quản mẫu dịch nuôi cấy tế bào Quá trình nuôi cấy tế bào giúp gia tăng số lượng virus nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình ly trích và thu nhận RNA. Dịch nuôi cấy tế bào được thu nhận từ Trung Tâm Thú Y Vùng sau khi rã đông nhiều lần để giải phóng virus ra khỏi tế bào nuôi cấy. Dịch nuôi cấy được giữ ở -70 0 C cho đến khi tiến hành quá trình ly trích. 22 3.5.2. Chuẩn bị và bảo quản mẫu huyết thanh Mẫu máu được thu nhận từ những heo có biểu hiện lâm sàng nghi nhiễm virus PRRS (sẩy thai, heo con sinh ra chết). Sau đó, mẫu máu được để đông tự nhiên và thu lấy phần huyết thanh bên trên. Phần huyết thanh được trữ đông ở -70 0 C cho đến khi ly trích. 3.5.3. Phƣơng pháp tách chiết RNA virus từ huyết thanh và từ dịch nuôi cấy tế bào theo TRIzol Bước 1: Đồng nhất mẫu, phá vỡ tế bào - Cho 100 l huyết thanh/dịch nuôi cấy tế bào vào ống eppendorf, sau đó cho thêm 1 ml chất phản ứng TRIzol vào ống. - Vortex để trộn đều, sau đó để ổn định trong 5 phút ở điều kiện nhiệt độ phòng. Bước 2: Phân tách và tinh sạch RNA - Thêm 0.2 ml chloroform và vortex để trộn đều. Để ổn định trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. - Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 15 giây ở 4 0 C để phân tách thành các phần khác nhau. Bước 3: Kết tủa RNA - Thu lấy phần dịch không màu bên trên và cho vào một eppendorf mới. Thêm 0.5ml isopropanol và 1µl glycerol vào eppendorf có chứa dịch thu được. - Vortex để trộn đều, sau đó để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 0 C. Loại bỏ phần dịch nổi và thu lấy phần tủa có chứa RNA. Bước 4: Rửa RNA - Cho 500μl ethanol 75 % vào phần tủa, tiến hành đảo nhẹ và đều khắp ống. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 0 C. - Loại bỏ phần dịch bên trên, cố gắng loại bỏ hết ethanol. Làm khô khối RNA trong không khí trong 5 đến 10 phút sao cho bốc hơi hết ethanol . Bước 5: Hòa tan RNA - Hoà tan khối RNA trong 10 l nước không có chứa RNase. Giữ ở -20 0 C cho đến khi sử dụng 23 3.5.4. Điện di RNA trên gel biến tính Dung dịch dùng đặt mẫu 2X Dung dịch dùng đặt mẫu là một dung dịch có màu xanh với các thành phần bromophenol blue 0,1 %, EDTA 1,6mM, formaldehyde 0,36M, glycerol 8 %, formamide 12,04 %, FA (formaldehyde agarose) gel buffer 1,6M. Dung dịch này có thể giữ trong 3 tháng ở điều kiện 2 0 C - 8 0 C. Dung dịch điện di Dung dịch sử dụng cho điện di là dung dịch MOPS 1M, bao gồm FA gel buffer 1X, formaldehyde 2,5M, nước không có RNase, pH = 7. Chuẩn bị gel biến tính cho quá trình điện di Cân 0,3 g agarose, cho thêm 16 ml nước cất hai lần khử ion đã được xử lý với DEPC, đun trong lò vi sóng ở mức sóng 650W cho đến khi agarose tan hoàn toàn (thông thường trong khoảng 2,5 phút). Để nguội khoảng 60 0 C, tiếp tục cho vào 4ml FA gel buffer và 360μl formaldehyde 37 – 40 %, lắc đều. Sau đó tiến hành đổ gel vào giá nằm ngang có sẵn lược. Chờ gel đông đặc trong khoảng 45 phút, rút lược ra khỏi gel và cho vào dung dịch điện di sẵn sàng cho việc đặt mẫu. Tiến hành điện di Cho 5 l dịch mẫu thu nhận được sau quá trình ly trích vào 5 l dung dịch buffer biến tính 2X. Ủ hỗn hợp trên trong 5 phút ở 65 0 C Cho nhanh hỗn hợp dung dịch trên vào nước đá trong khoảng 1 phút. Cho 0,5 l ethidium bromide 10 mg/ml vào hỗn hợp trên và để ổn định trong khoảng 1 phút. Đặt mẫu vào gel biến tính đã được cho sẵn vào dung dịch điện di trong 15 phút. Tiến hành quá trình điện di với hiệu điện thế 30 volt cho đến khi buffer đặt mẫu di chuyển khoảng 3/4 gel. Quan sát kết quả điện di dưới tia UV nhờ phần mềm Quantity one của công ty Biorad. 24 3.5.5. Kỹ thuật RT-PCR trên RNA của virus Để thực hiện phản ứng phiên mã ngược và khuếch đại đoạn cDNA sau phiên mã ngược với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chúng tôi sử dụng kỹ thuật RT-PCR một bước nhằm hạn chế sự lây nhiễm. Trong phản ứng này, đầu tiên mồi Rovira 2 sẽ tiến hành phiên mã ngược để tổng hợp cDNA nhờ vào enzyme AMV reverse transcriptase, sau đó tiến hành sự khuếch đại đoạn cDNA vừa được tạo ra. Thành phần và chu kỳ nhiệt cho phản ứng được trình bày sau đây. Thành phần phản ứng RT-PCR: Thành Phần DDung dịch gốc Thể tích Nồng độ cuối TaqBeat ® Hot Start MgCl 2 dNTPs RNAsin ® inhibitor AMV reverse transcriptase Reverse transcriptase buffer Primer Rovira 1 Primer Rovira 2 Nước không chứa RNase RNA mẫu 1,25 U/viên 25 mM 10 mM 20 U/µl 50 U/µl 10 X 5 µM 5 µM 1 viên 2,5 µl 0,75 µl 0,5 µl 0,25 µl 2,5 µl 0.2 µl 0,2 µl 13,1 µl 5.0 µl 1,25 U/viên 2,5 mM 0,3 mM 10 U 12,5 U 1 X 0.04 µM (1 pmol) 0.04 µM (1 pmol) Tổng thể tích 25 µl Ngoài ra, chúng tôi còn thay thế TaqBeat ® Hot Start bằng Taq DNA polymerase của công ty Biorad và Taq DNA polymerase của công ty ABgene để chạy cùng một quy trình nhiệt. Bảng 3.2. Thành phần phản ứng RT-PCR 25 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR Bảng 3.3: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR Bƣớc Hoạt động Nhiệt độ Thời gian 1 Phiên mã ngược 48 0 C 30 phút 2 Tiền biến tính 95 0 C 10 phút 3 Biến tính 95 0 C 15 giây 4 Bắt cặp và kéo dài 60 0 C 2 phút 5 lặp lại bước 3 và 4 trong 40 chu kỳ 6 Hoàn thành 72 0 C 7 phút 7 Giữ sản phẩm 4 0 C Sau khi thiết kế thành công quy trình RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn, chúng tôi đã sử dụng quy trình trên để phát hiện sự hiện diện của virus PRRS trong các mẫu RNA ly trích được. 3.5.6. Điện di sản phẩm RT-PCR Hoá chất dùng đặt mẫu vào gel (loading dye) Hóa chất dùng để đặt mẫu vào gel là một dung dịch có màu xanh với các thành phần bromphenol blue (0,25 %), sucrose (40 %), TE vừa đủ. Dung dịch điện di Dung dịch sử dụng cho điện di là dung dịch TBE 0,5X, bao gồm Tris HCl (3,94 mg), acid boric (1,39g), Na 2 EDTA (93,06mg), nước cất vô trùng (500ml). Dung dịch được điều chỉnh đến pH = 8.3 với NaOH 0,1 %. Dung dịch nhuộm gel Dung dịch nhuộm gel gồm có TBE (1X), ethidium bromide (10mg/ml) Chuẩn bị gel cho quá trình điện di Dùng điện di ngang với gel agarose có nồng độ 1 %. Cách chuẩn bị gel như sau: Cân 0,25g agarose, thêm 25ml TBE (0,5X), đun trong lò vi sóng ở mức sóng 650W cho đến khi agarose tan hoàn toàn (thông thường đun trong 2 phút). Để nguội đến khoảng 60 0 C (đến khi nào cầm được mà không quá nóng) thì đổ gel vào giá nằm ngang có sẵn lược. Chờ gel đông đặc (khoảng 30 phút), rút lược ra khỏi gel và cho vào dung dịch TBE sẵn sàng cho việc đặt mẫu. 26 Tiến hành điện di Trộn dung dịch gồm 10µl mẫu và 2µl loading dye 6X. Cho dung dịch này vào giếng trên gel. Điện di trong 30 phút với cường độ dòng điện là 250mA và hiệu điện thế 100V. Nhuộm mẫu Sau khi điện di, gel được lấy ra khỏi buồng điện di và ngâm vào dung dịch ethidium bromide trong khoảng 30 phút. Quan sát kết quả điện di Kết quả điện di được quan sát dưới tia UV nhờ vào máy chụp ảnh DNA, được quan sát nhờ phần mềm Quantity one của công ty Biorad 27 . 24 3.5.5. Kỹ thuật RT- PCR trên RNA của virus Để thực hiện phản ứng phiên mã ngược và khuếch đại đoạn cDNA sau phiên mã ngược với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chúng tôi sử dụng kỹ thuật. phản ứng TRIzol vào ống. - Vortex để trộn đều, sau đó để ổn định trong 5 phút ở điều kiện nhiệt độ phòng. Bước 2: Phân tách và tinh sạch RNA - Thêm 0.2 ml chloroform và vortex để trộn đều. Để. công ty ABgene để chạy cùng một quy trình nhiệt. Bảng 3.2. Thành phần phản ứng RT- PCR 25 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT- PCR Bảng 3. 3: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT- PCR Bƣớc Hoạt