31 Chƣơng 3 VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP Thời gian tiến hành: từ tháng 3 năm 2005 đến tháng 7 năm 2005. Địa điểm nghiên cứu: Phòng 118, phòng kiểm dịch côn trùng và phòng 105, khu Phượng Vĩ, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. 3.1 Nuôi sùng trắng  Nguồn sùng trắng Sùng trắng được lấy từ trại phân của khoa Nông Học, Đại học Nông Lâm thành phố HCM và ở Tiền Giang Phân trộn đất lấy tại trại phân nơi sùng sống. Sơ dừa.  Thiết bị và vật tƣ Các dụng cụ cần thiết như hộp nuôi sùng, khay nhựa và vật tư trong phòng côn trùng.  Điều kiện nuôi Nhiệt độ: Sùng được nuôi ở nhiệt độ phòng (28 o C). Độ ẩm: độ ẩm của môi trường tương đối giống với môi trường sống của sùng trong tự nhiên.  Tiến hành - Chuẩn bị hộp nuôi: hộp tròn hình trụ có đường kính đáy 10cm, đường kính miệng hộp 12cm, chiều cao hộp 12cm. Mỗi hộp nuôi 1 con sùng. - Cho môi trường đất phân vào hộp với độ cao hỗn hợp khoảng 8cm. Sau đó thả sùng vào. Cứ 2 tuần thì thay môi trường cho sùng một lần. Chúng ta có thể tăng cường dinh dưỡng cho sùng bằng cách thêm vào hộp nuôi một lát cam hoặc táo vào mỗi lần thay môi trường. Trong trường hợp môi trường quá khô thì ta có thể phun nước để độ ẩm của môi trường không khác biệt với môi trường sống của sùng trong tự nhiên. 32 3.2 Nhân giống nấm Metarhizium anisopliae  Nguồn nấm Nấm Metarhizium anisopliae với các dòng BDLA8, BDTN15, BXĐTV3, BXDLA8, RBC-Q9-3, SCLLLA4, Ma2, Ma11, Ma13 được phân lập từ bọ dừa, bọ xít đen ở Long An, bọ dừa ở Tây Ninh, rầy bông cúc ở quận 9, sâu cuốn lá lúa ở Long An, bọ xít đen ở Trà Vinh và chế phẩm Ma của Viện Luá Đồng Bằng Sông Cửu Long (CP MA).  Thiết bị và vật tƣ Các dụng cụ và vật tư cần thiết trong phòng thí nghiệm như que cấy, dụng cụ cắt thạch, mũi mác, bịch nylon, đĩa petri, bình tam giác, buồng đếm hồng cầu, tủ sấy, máy lắc, nồi hấp autoclave, cân phân tích, bếp điện, khay nhựa và các dụng cụ khác. Các hoá chất cần thiết như glucose, agar,… - Môi trường nuôi cấy: Môi trường PGA (Potato Glucose Agar): Khoai tây: 200 g Agar: 15 g Đường:20 g Nước cất: 1000 ml Môi trường lỏng: Bã bia: 20 g Glucose: 20 g Nước cất: 1000 ml Có thể thay glucose bằng mật rỉ. - Môi trường nhân giống Môi trường cơm  Qui trình lên men xốp nhân giống Metarhizium anisopliae Có thể sử dụng phương pháp lên men xốp tạo chế phẩm vi sinh vật diệt sâu, côn trùng có hại từ vi nấm, trong đó sau khi bổ sung dịch dinh dưỡng vào các cơ chất khác nhau như bột đậu nành, bã đậu phụ, cám, gạo, lúa, mày ngô,… người ta tiến 33 hành nhiễm giống nấm và cho lên men. Khi sinh khối nấm đạt cực đại tiến hành thu hồi sinh khối, xử lý và tạo sản phẩm chứa cả bào tử và hệ sợi nấm. Sơ đồ 3.1 Qui trình lên men xốp tạo chế phẩm nấm diệt sau và côn trùng gây hại  Tiến hành - Chuẩn bị môi trường: rửa sạch gạo, ngâm trong nước cất, để qua đêm. Sau đó hấp môi trường ở 121 o C trong 30 phút. Hai ngày sau hấp lại cũng ở 121 o C trong 30 phút. Để môi trường qua 1 đêm rồi cấy nấm vào. Môi trường dịch thể, lắc 200 vòng/phút, nuôi t o = 28 – 30 o C Môi trường xốp trong bình 250 ml, nuôi 4 – 5 ngày ở t o = 28 – 32 o C Môi trường xốp trong chậu thủy tinh so sánh (khử trùng 100 o C trong 30 – 40phút) + 10% giống. Nuôi 10 ngày ở t o C = 28 – 30 o C. Độ ẩm khoảng 90 – 95%. Làm khô ở nhiệt độ phòng. Có quạt. Độ ẩm 10% hoặc sấy ở 40 o C. Nghiềm nhỏ. Đóng bao nhãn. Kiểm tra chất lượng. Bảo quản ở 5 – 10 o C trong tối và sử dụng. Ống giống 5 – 7 ngày 34 - Chuẩn bị nấm: Nấm Metarhizium anisopliae 6 ngày sau khi cấy trên môi trường PGA, khi tảng nấm đã phát triển. - Cấy nấm Nấm 6 ngày sau khi cấy trên môi trường PGA từ đĩa petri được băm nhuyễn rồi cho vào bình tam giác chứa 75 ml môi trường. Sau đó đem lắc 170 vòng/phút ở 28 O C trong 3 ngày để chuẩn bị nhân nấm trên môi trường xốp (môi trường cơm). Cho một ít môi trường cơm đã chuẩn bị vào bịch nylon. Hút 5ml dịch nấm trong bình tam giác cho vào mỗi bịch nylon, buộc kín miệng, xoi những lỗ nhỏ trên bịch nylon. Khi nấm phủ xanh hết bề mặt, phơi khô rồi sử dụng ray lọc bào tử nguyên chất ta được bột bào tử. Tính bào tử nấm trong 1 g bột nấm: Pha 1 g bột nấm trong 10ml nước cất vô trùng. Công thức tính số lượng bào tử trong 1g bột nấm: 4000 x 1000 x a x 10 -n D = b D: Số bào tử trong 1 g bột nấm. a: Số bào tử đếm được. n: Nồng độ pha loãng. b: Số ô nhỏ của buồng đếm hồng cầu. 3.3 Khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae 3.3.1 Phƣơng pháp khảo sát độc tính Phương pháp 1: Bột bào tử nấm Metarhizium anisopliae với lượng khác nhau được trộn đều trong đất. Sau đó thả sùng vào môi trường và theo dõi. Phương pháp 2: Pha bào tử thu được với nước đến nồng độ mong muốn. Sau đó phun dung dịch nấm lên đất và lên sùng rồi theo dõi.  Phương pháp 3: Gây vết thương nhẹ trước khi gây nhiễm nấm lên sùng theo theo phương pháp 1 hoặc 2. - Theo dõi sùng: 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày sau khi gây nhiễm. 35 Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ chết. 3.3.2 Bố trí thí nghiệm Giai đoạn 1: Gây nhiễm sùng theo phương pháp 1 với các dòng BDTN 15, BDLA 8, BXĐTV 3, BXĐLA 8 và nghiệm thức đối chứng là sùng để nguyên. Bảng 3.1 Bảng bố trí nghiệm thức theo phương pháp 1 STT Nghiệm thức Số mẫu 1 BDTN 15 5 2 BDLA 8 5 3 BXĐTV 3 5 4 BXĐLA 8 5 5 Đối chứng 5 Giai đoạn 2: Gây nhiễm theo phương pháp 2 với các dòng MA 2, CP MA và 2 nghiệm thức đối chứng. Đối chứng 1 là môi trường bã bia + mật rỉ, đối chứng 2 là nước. Bảng 3.2 Bảng bố trí nghiệm thức theo phương pháp 2 STT Nghiệm thức Số mẫu 7 MA 2 5 8 CP MA 5 9 Đối chứng 1 5 10 Đối chứng 2 5 Giai đoạn 3: Gây nhiễm theo phương pháp 3 với các dòng BDTN 15, BDLA 8, BXĐTV 3, BXĐLA 8, SCLLLA 4, RBC – Q9 – 3, MA 11, MA 13 và nghiệm thức đối chứng là sùng gây vết thương. 36 Bảng 3.3 Bảng bố trí nghiệm thức theo phương pháp 3 STT Nghiệm thức Số mẫu 11 BDTN 15 5 12 BDLA 8 5 13 BXĐTV 3 5 14 BXĐLA 8 5 15 SCLLLA 4 5 16 RBC – Q9 – 3 5 17 MA 11 5 18 MA 13 5 19 Đối chứng 5 37 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Giai đoạn nuôi sùng Sùng được nuôi trong mỗi hộp nhựa riêng biệt và giữ ổn định trong ít nhất 2 tuần (Hình 4.1). Hình 4.1 Sùng được nuôi trong điều kiện thí nghiệm 1. Hộp nhựa có các kích thước: đường kính miệng hộp 12 cm; đường kính đáy 10cm, chiều cao 12 cm; 2. Sùng trắng tuổi 3 dài 3 cm; 3. hỗn hợp đất phân (môi trường sống và nguồn thức ăn của sùng trắng). Rồi từ sau 2 tuần nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm mới có thể cho gây nhiễm với nấm vì khoảng thời gian từ lúc đem mẫu sùng về nuôi đến lúc nuôi ổn định sùng có thể chết vì nhiều nguyên nhân, có thể chết do shock môi trường, do nhiệt độ thay đổi, do độ ẩm không phù hợp hay do bị thương trong quá trình thu mẫu và vận chuyển về phòng thí nghiệm… Cũng có thể chết trong lúc nuôi do môi trường thiếu dinh dưỡng hoặc do không khéo léo trong khi thay môi trường làm sùng bị thương. Nếu trong giai đoạn này đem gây nhiễm với nấm thì kết quả sẽ không chính xác. Do vậy ta cần nuôi sùng ổn định ít nhất 2 tuần để đảm bảo khi gây nhiễm sùng hoàn toàn khỏe mạnh. 4.2 Giai đoạn nhân nấm Nấm sau 6 ngày cấy trên đĩa petri (Hình 4.2a) được chuyển vào bình tam giác 250 ml chứa môi trường bã bia + glucose + nước cất và lắc trong 3 ngày ở 28 o C sẽ được nhân trên môi trường xốp (Hình 4.2b). 3 1 2 38 a Nấm M.anisopliae trên môi trường PGA (potato glucose agar) Nấm M.anisopliae trên môi trường cơm Hình 4.2 Hình thái nấm Metarhizium anisopliae trên môi trường PGA và trên môi trường cơm a. Nấm M.anisopliae trên môi trường PGA sau 9 ngày cấy trên đĩa petri; b. Nấm M.anisopliae trên môi trường cơm sau 9 – 11ngày nuôi cấy. Số lượng bào tử của các dòng nấm M.anisopliae khác nhau là khác nhau. Nhờ buồng đếm hồng cầu, số lượng bào tử của các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong 1g bột nấm thu được từ môi trường xốp (Bảng 4.1)  Phương pháp nhân nấm trên môi trường xốp Trong phương pháp nhân nấm, chúng tôi nhân nấm trên môi trường lỏng rồi mới đưa sang môi trường xốp. Trên thực tế chúng ta có thể đưa thạch trực tiếp từ môi trường thạch sang môi trường xốp. Tuy nhiên thời gian để nấm mọc xanh hết bề mặt môi trường rất lâu (khoảng 11 – 14 ngày) và tốn công cho nhiều lần băm thạch. Thêm vào đó do thời gian tiếp xúc với môi trường không khí lâu (tốn thời b 39 gian nhiều trong việc băm thạch) nên rất dễ nhiễm. Trong khi đó, nếu sử dụng sinh khối nấm từ môi trường lỏng để nhân trên môi trường xốp, thời gian để nấm lên xanh hết bề mặt môi trường là 9 – 10 ngày và chỉ mất thời gian cho một lần băm thạch. Bảng 4.1 Số lượng bào tử của các dòng nấm trong 1g bột nấm Dòng nấm Số lượng bào tử trên 1 g Số lượng bào tử trên 1 ml BDTN 15 3,47 x 10 10 BDLA 8 6,88 x 10 10 BXĐTV 3 4,25 x 10 10 BXĐLA 8 8,44 x 10 9 RBC – Q9 – 3 1,11 x 10 10 SCLLLA 4 2,54 x 10 10 MA 2 5 x 10 9 MA 11 5,47 x 10 9 MA 13 8,11 x 10 9 CP MA 5 x 10 9 Mặt khác, khi áp dụng phương pháp nhân nấm trên môi trường xốp, ta có thể thu được chế phẩm khô (tức bột nấm) để thuận tiện cho quá trình gây nhiễm nấm theo phương pháp gây nhiễm khô. Môi trường xốp được sử dụng là môi trường cơm vì môi trường cơm dễ dàng lọc bào tử tinh không chứa môi trường. Nguyên nhân của cách làm này chính là để tránh hiện tượng sùng chết vì môi trường xốp trong quá trình gây nhiễm.  So sánh với phương pháp nhân nấm trên môi trường lỏng. Như chúng ta đã biết, nhân nấm trong môi trường lỏng có ưu điểm là rất dễ làm, thời gian lên men ngắn, lượng nấm đưa vào rất ít trong khi lượng nấm thu được lại rất lớn và dễ phát hiện khi dung dịch nhiễm khuẩn (môi trường nhiễm khuẩn bị đục) tuy nhiên chúng ta không thể sử dụng để gây nhiễm vì bào tử thu được là bào tử chồi nên thời gian lưu trữ ngắn, sức chống chịu kém dễ bị mất hoạt tính trong khi thời gian theo dõi sự nhiễm bệnh lại dài (21 ngày) trong khoảng thời 40 gian đó bào tử nấm có thể đã mất hoạt tính hoặc đã chết trong môi trường chứa hệ sinh vật đất. Trong khi đó phương pháp lên men xốp nấm M.anisopliae mặc dù thời gian lên men dài nhưng hiệu quả lên men cao, lượng nấm đưa vào ít nhưng lượng nấm thu được là khổng lồ, nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền và rất dễ làm. Mặt khác, bào tử nấm thu được là bào tử đính nên có thể lưu trữ lâu và khả năng chịu đựng môi trường bất thuận tốt hơn. Do đó phù hợp với thí nghiệm gây nhiễm nấm phải theo dõi một thời gian dài tuy rằng trong quá trình nhân nấm phương pháp này có một nhược điểm là khó kiểm soát sự nhiễm tạp. 4.3 Khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae 4.3.1 Phƣơng pháp gây nhiễm 1 và 2 4 nghiệm thức ứng với 4dòng nấm BDTN 15, BDLA 8, BXĐTV 3, BXĐLA 8 cho gây nhiễm theo phương pháp 1 và nghiệm thức đối chứng (sùng để nguyên) được kết quả như sau: Bảng 4.2 Kết quả gây nhiễm nấm Metarhizium anisopliae trên sùng trắng theo phương pháp 1 Nghiệm thức Tỷ lệ sùng chết (%) Thời gian chết(ngày) BDTN 15 0 _ BDLA 8 0 _ BXĐTV 3 0 _ BXĐLA 8 0 _ Đối chứng 0 _ Qua bảng 4.2, các nghiệm thức trên đều cho kết quả tỷ lệ sùng chết là 0%. Điều này đưa chúng tôi đến các giả định như sau: Có thể các dòng nấm M.anisopliae đem gây nhiễm không có khả năng diệt sùng trắng (hay còn gọi là không có độc tính). Nguyên nhân này rất hay gặp phải trong các nghiên cứu vì rất khó tìm được một dòng gây độc tính trên sùng trắng. Cũng có thể phương pháp gây nhiễm chưa phù hợp, có thể do nồng độ gây nhiễm chưa cao? Tuy nhiên nguyên nhân này không không thuyết phục vì nồng độ bào tử gây nhiễm là rất cao hoặc do khi gây nhiễm, nấm được trộn với đất, nấm có thể bị . nhỏ của buồng đếm hồng cầu. 3.3 Khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae 3.3.1 Phƣơng pháp khảo sát độc tính Phương pháp 1: Bột bào tử nấm Metarhizium anisopliae với lượng khác nhau. nhân nấm phương pháp này có một nhược điểm là khó kiểm soát sự nhiễm tạp. 4. 3 Khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae 4. 3.1 Phƣơng pháp gây nhiễm 1 và 2 4 nghiệm thức ứng với 4dòng nấm. Hình 4. 2 Hình thái nấm Metarhizium anisopliae trên môi trường PGA và trên môi trường cơm a. Nấm M .anisopliae trên môi trường PGA sau 9 ngày cấy trên đĩa petri; b. Nấm M .anisopliae trên môi