28 nhau. Số lượng của một mRNA trong tế bào chính là sự phản ảnh về khả năng hoạt động của gen cha mẹ. Vì thế, sự xác định số lượng của mRNA tạo ra những thay đổi trong sự biểu hiện gen để chúng có thể được kiểm soát. 2.2.5.4. PCR được sử dụng để so sánh các genome khác nhau Sự khuếch đại ngẫu nhiên (random amplification) với các primer ngắn là kỹ thuật hữu dụng trong phát sinh chủng loại, khu vùng nghiên cứu liên quan đến sự tiến hóa và suy vong của các loài hay các nhóm sinh vật khác. Hai sinh vật có quan hệ thân tộc sẽ có nhiều band giống nhau hơn hai sinh vật có quan hệ thân tộc kém (Brown, 1994). 2.2.6. Các hạn chế của phương pháp PCR Do độ nhạy rất cao của PCR đồng thời với thao tác đơn giản, người ta có khuynh hướng sử dụng phương pháp này để giải quyết nhiều vấn đề. Tuy nhiên, ta không thể quên rằng phương pháp có nhiều hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng đặc biệt khi tiến hành thí nghiệm cũng như khi phân tích kết quả. Có thể kể ba vấn đề lớn khi sử dụng phương pháp PCR: 2.2.6.1. Trong thực nghiệm, kích thước các đoạn cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với các DNA có độ dài dưới 1,5 kb cho kết quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm. 2.2.6.2. Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao đối với phương pháp này Vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoán vì hậu quả rất nghiêm trọng. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước. Người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp các ống nghiệm sau những lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín trong phòng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết bị dung cụ…rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó. Có thể khắc phục một phần vấn đề này bằng một số biện pháp sau: 29 - Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân tích các sản phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau. - Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette) không sử dụng cho các thao tác khác. Đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm vào đầu micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng. - Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trước. - Tất cả các thành phần phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ, tính toán sao cho 1, 2 lần thao tác. 2.2.6.3. Các sai sót gây ra do Taq polymerase Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai khá cao (10 -4 , nghĩa là cứ 10000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide). Đặc tính này không nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhưng có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotide của DNA. Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai khác này mà chỉ có thể giảm bớt; ví dụ như đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, xác định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đi đến trình tự chính thức,… 30 Phần 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1. Thời gian: Từ tháng: 2/2005 - 7/2005 3.1.2. Địa điểm - Mẫu phân bò khảo sát được lấy từ hộ hoặc trại chăn nuôi ở Đồng Nai; mẫu phân heo được lấy ở Tiền Giang; mẫu bề mặt thịt bò được lấy ở lò mổ Dĩ An – Bình Dương. - Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại phòng thực hành Kiểm nghiệm Thú sản và Môi trường, khoa Chăn nuôi – Thú y, Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. - Xác định các gen độc lực được thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa sinh Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM. 3.2. Nội dung - Thu thập mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò. - Nuôi cấy, phân lập E. coli trên môi trường MAC, SMAC, CT-SMAC. - Chọn khuẩn lạc điển hình của E. coli / nhóm E. coli. - Giữ gốc khuẩn lạc riêng lẻ trên ống thạch NA - Ly trích DNA của E. coli phân lập được. - Thực hiện phản ứng multiplex – PCR để phát hiện gen gây độc của E. coli. 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Lấy mẫu - Mẫu phân tiêu chảy Được lấy từ trực tràng bằng tăm bông rồi cho vào môi trường vận chuyển Carry Blair. Bảo quản ở 4 – 8 0 C cho đến khi tiến hành xét nghiệm (mẫu được giữ tối đa 24 giờ). - Mẫu bề mặt thịt Dùng gạc y tế tẩm nước muối sinh lý quét đều lên bề mặt thịt, cho vào chai có sẵn 50 ml nước peptone đệm. Sau đó đậy chặt chai, cho vào túi ny lông buộc kỹ. Bảo quản 4 - 8 0 C, chuyển về phòng thí nghiệm. 31 - Số lượng mẫu: Số lượng mẫu khảo sát được tính là số mẫu đã phân lập được vi khuẩn E. coli từ các mẫu đã lấy. Bảng 3.1 Số lượng mẫu 3.3.2. Nuôi cấy, phân lập và ly trích DNA của vi khuẩn E. coli 3.3.2.1. Môi trường nuôi cấy - Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn: Mac Conkey (MAC), Sorbitol- SMAC, thạch dinh dưỡng (NA), peptone đệm, Cefixime-Tellurite-SMAC (CT- SMAC), hóa chất thử IMViC… 3.3.2.2. Nuôi cấy và phân lập (1) Mẫu phân tiêu chảy được cấy trực tiếp trên đĩa thạch MAC và SMAC để có những khuẩn lạc rời rạc sau 24 giờ ở 37 o C. Mẫu bề mặt thịt được làm đồng đều trong 125 ml peptone đệm phosphate có bổ sung kháng sinh cefixime với nồng độ 0,0125 mg/l, vancomycin với nồng độ 8 mg/l (FDA, 2002). Ủ 24 giờ ở 37 o C, cấy sang môi trường CT-SMAC. Vi khuẩn E. coli nhóm STEC phát triển tạo khuẩn lạc không màu hoặc xám với tâm đục, E. coli khác cho khuẩn lạc hồng giống như trên môi trường MAC. (2) Chọn khuẩn lạc điển hình của E. coli - Quan sát các loại khuẩn lạc hiện diện trên bề mặt thạch MAC, SMAC, CT- SMAC. - Mỗi nhóm khuẩn lạc chọn 6 – 10 khuẩn lạc rời rạc đại diện E. coli của mẫu khảo sát. Các nhóm khuẩn lạc như sau:  6 – 10 khuẩn lạc hồng MAC (Ký hiệu HM).  6 – 10 khuẩn lạc trắng SMAC (Ký hiệu TS).  6 – 10 khuẩn lạc đỏ hồng SMAC (Ký hiệu HS). STT Đối tượng mẫu Số lượng 1 Phân tiêu chảy Phân bò 8 2 Phân bê 10 3 Phân heo 9 4 Thịt Bò 9 Tổng cộng 36 32  6 – 10 khuẩn lạc trắng CT – SMAC (Ký hiệu TC). (3) Tăng sinh, giữ gốc khuẩn lạc riêng lẻ trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA). - Mỗi khuẩn lạc được chọn cấy chuyển vào ống thạch NA. Phần khuẩn lạc còn lại của mỗi nhóm được thu gom chung vào 1 eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5ml nước cất khử ion vô trùng để ly trích DNA nhóm khuẩn lạc (DNA tổng). (4) Thử sinh hóa - Sau khi nuôi cấy, mỗi khuẩn lạc rời rạc trên được thử phản ứng IMViC để xác định E. coli. 3.2.2.3. Ly trích DNA khuẩn lạc Sau khi đã thu nhóm khuẩn lạc trong ống eppendorf và giữ gốc từng khuẩn lạc riêng lẻ. Mỗi gốc được cấy sang đĩa NA. Sau 24 giờ ở 37 o C, thu 6 – 10 khuẩn lạc cho vào eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5ml H 2 O cất khử ion vô trùng. Tiếp theo, chúng tôi tiến hành ly trích DNA đại diện nhóm khuẩn lạc và từng khuẩn lạc riêng lẻ. Dựa theo Cebula và ctv (1995), kết hợp với phương pháp ly trích DNA từ E. coli của Cerna và ctv (2003) và Botteldoorn và ctv (2003) để tiến hành ly trích DNA từ vi khuẩn E. coli phân lập được bằng phương pháp nhiệt như sau: đun sôi 10 phút rồi chuyển vào tủ -70 o C để trong 10 phút, rã đông rồi ly tâm 13000 vòng/phút trong 3 phút. Thu phần nổi làm DNA khuôn mẫu (DNA xét nghiệm). - Quy trình phân lập vi khuẩn E. coli như sau: 33 Sơ đồ 3.1 Phân lập, xác định E. coli và phát hiện gen độc lực Mẫu Phân Thịt Peptone (vancomycin, cefixime) (37 o C/24h) MAC (37 o C/24h) SMAC (37 o C/24h) CT - SMAC (37 o C/24h) Thu tất cả phần còn lại của những khuẩn lạc đã chọn để cấy qua ống NA theo từng nhóm riêng, cho vào eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5ml H 2 O cất khử ion 2 lần Cấy từng khuẩn lạc được chọn vào từng ống NA nghiêng (37 o C/24h) Chọn 6-10 khuẩn lạc đỏ hồng Chọn 6-10 khuẩn lạc trắng và / hoặc đỏ hồng Chọn 6-10 khuẩn lạc trắng và / hoặc đỏ hồng Ly trích DNA (DNA nhóm khuẩn lạc) Multiplex - PCR Ly trích DNA riêng theo từng ống NA Loại bỏ các ống NA đã giữ gốc (+) Multiplex- PCR (-) Thử IMViC(+/-;+;-;-) 34 3.3.3. Xác định các gen stx1, stx2, eae, hly, stx2e, sta, stb, lt-I của E. coli phân lập được bằng multiplex - PCR - Việc phát hiện các gen độc lực của E. coli được thực hiện bằng 2 phản ứng multiplex – PCR với máy luân nhiệt (thermal cycler):  Multiplex – PCR1: Phát hiện các gen eae, hly, stx1, stx2.  Multiplex – PCR2: Phát hiện các gen stx2e, sta, stb, lt-I. - Trong quá trình thực hiện phản ứng multiplex – PCR, mẫu đối chứng dương (EDL933 hoặc H44) được thực hiện đồng thời với mẫu khảo sát.  EDL933 là đối chứng dương với các gen eae, hly, stx1, stx2.  H44 là đối chứng dương với các gen stx2e, stb, lt-I. Hai mẫu đối chứng dương này được cung cấp từ Trường đại học Thú y Toulouse (Pháp).  Multiplex – PCR1 * Trình tự các primer sử dụng trong multiplex – PCR1 Gen độc lực Primer Trình tự đoạn primer (5’ 3’) Kích cỡ đoạn DNA khuếch đại (bp) stx1 Stx1-F Stx1-R ATAAATCGCCATTCGTTGACTAC AGAACGCCCACTGAGATCATC 180 stx2 Stx2-F Stx2-R GGCACTGTCTGAAACTGCTCC TCGCCAGTTATCTGACATTCTG 255 eaeA Eae-F Eae-R GACCCGGCACAAGCATAAGC CCACCTGCAGCAACAAGAGG 384 hlyA HlyA-F HlyA-R GCATCATCAAGCGTACGTTCC AATGAGCCAAGCTGGTTAAGCT 534 (Dẫn liệu của Paton & Paton, 1998 a ) * Các thành phần của phản ứng multiplex – PCR1: PCR buffer 1X: Tris-HCl (pH 8,8 ở 25 o C) 750 mM, (NH 4 ) 2 SO 4 200 mM, 0,1 % Tween 20; MgCl 2 2mM; dNTP 200  M; mỗi loại primer 250 mM. Taq – polymerase AB gene 0.5UI; DNA khuôn mẫu 1  l; nước cất 2 lần khử ion vừa đủ 50  l. 35 * Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex – PCR1 (Paton và Paton, 1998 a ): Bước 1 95 0 C / 1 phút 65 0 C / 2 phút 10 chu kỳ 72 0 C / 1,5 phút Bước 2 95 0 C / 1 phút 64 0 C / 2 phút 1 chu kỳ 72 0 C / 1,5 phút Bước 3 95 0 C / 1 phút 63 0 C / 2 phút 1 chu kỳ 72 0 C / 1,5 phút Bước 4 95 0 C / 1 phút 62 0 C / 2 phút 1 chu kỳ 72 0 C / 1,5 phút Bước 5 95 0 C / 1 phút 61 0 C / 2 phút 1 chu kỳ 72 0 C / 1,5 phút Bước 6 95 0 C / 1 phút 60 0 C / 2 phút 10 chu kỳ 72 0 C / 1,5 phút Bước 7 95 0 C / 1 phút 60 0 C / 2 phút 11 chu kỳ 72 0 C / 2,5 phút 36  Multiplex – PCR2 * Trình tự các đoạn primer được sử dụng trong multiplex – PCR2: (Dẫn liệu của Blanco và ctv, 1997) *Các thành phần của phản ứng multiplex – PCR2: PCR buffer 1X: Tris-HCl (pH 8,8 ở 25 o C) 750 mM, (NH 4 ) 2 SO 4 200 mM, 0,1 % Tween 20; MgCl 2 2mM; dNTP 200  M; primer: LTa-F 150 ng, LTa-R 150 ng, STa-F 150 ng, STa-R 150ng, STb-F 45 ng, STb-R 45 ng, Vt2e-F 225 ng, Vt2e-R 225 ng; Taq - polymerase AB gen 0.5UI; DNA khuôn mẫu 3,5  l; nước cất 2 lần khử ion vừa đủ 50  l. * Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex – PCR2 (Nguyen Ngoc Hai, 2002): 3.3.4. Điện di trên gel aragose và đọc kết quả điện di Sau phản ứng multiplex - PCR, 6  l sản phẩm PCR cùng với 1,2  l loading dye được điện di trên gel agarose 1,4% trong TBE 0,5X. Ladder cũng được điện di đồng thời. Thời gian điện di là 30 – 35 phút ở 100V, 250mA. Gen độc lực Primer Trình tự đoạn primer (5’ 3’) Kích cỡ đoạn DNA khuếch đại (bp) lt-I LT-F LT-R GGCGACAGATTATACCGTGC CCGAATTCTGTTATATATGTC 696 sta STa-F STa-R TTAATAGCACCCGTACAAGCAGG CTTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC 147 stb STb-F STb-R ATCGCATTTCTTCTTGCATC GGGCGCCAAAGCATGCTCC 172 vt2e Vt2e-F Vt2e-R CCTTAACTAAAAGGAATATA CTGGTGGTGTATGATTAATA 230 94 0 C / 5 phút 95 0 C / 45 giây 60 0 C / 45 giây 25 chu kỳ 72 0 C / 1 phút 72 0 C / 10 phút . độc lực của E. coli được thực hiện bằng 2 phản ứng multiplex – PCR với máy luân nhiệt (thermal cycler ):  Multiplex – PCR 1: Phát hiện các gen eae, hly, stx1, stx2.  Multiplex – PCR 2: Phát hiện. DNA của E. coli phân lập được. - Thực hiện phản ứng multiplex – PCR để phát hiện gen gây độc của E. coli. 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Lấy mẫu - Mẫu phân tiêu chảy Được lấy từ trực. 36  Multiplex – PCR2 * Trình tự các đoạn primer được sử dụng trong multiplex – PCR 2: (Dẫn liệu của Blanco và ctv, 1997) *Các thành phần của phản ứng multiplex – PCR 2: PCR buffer 1X: Tris-HCl