37 Sau khi điện di, gel được ngâm trong 30 phút với dung dịch ethidium bromide 1mg/ml TBE. Sau đó rửa sạch bằng nước và chụp hình gel với tia UV bằng máy chụp gel với phần mềm Quality One 2000, Bio-Rad). Các band DNA được xác định bằng cách so với các band của đối chứng dương và ladder. Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR1 EDL933: Đối chứng dương (stx1, stx2, eae, hly). Lad: Thang chuẩn. 1, 2, 3, 4: các mẫu xét nghiệm Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR2 H44: Đối chứng dương (lt-I, vt2e, stb). Lad: Thang chuẩn. 1, 2, 3, 4 là các mẫu xét nghiệm 1 2 Lad H44 3 4 lt-I (696bp) vt2e (230bp) stb (172bp) stx2 (255bp) hly (534bp) s tx1 (180bp) e ae (384bp) 1 2 EDL Lad 3 4 933 38 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân nhóm khuẩn lạc và xác định E. coli từ các khuẩn lạc phân lập được Sau khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, phân lập và phân nhóm khuẩn lạc dựa vào kiểu hình trên môi trường MAC, SMAC, CT-SMAC và thử phản ứng sinh hóa (IMViC) cho các khuẩn lạc thu được từ 8 mẫu phân bò tiêu chảy, 10 mẫu phân bê tiêu chảy, 9 mẫu phân heo cai sữa tiêu chảy và 9 mẫu bề mặt thịt bò, kết quả lần lượt được trình bày như sau: 4.1.1. Các loại khuẩn lạc trên môi trường thạch MAC, SMAC, và CT-SMAC Mẫu phân tiêu chảy được cấy ria trực tiếp trên bề mặt thạch MAC. Ủ 37 o C trong 24 giờ, quan sát và ghi nhận được chỉ một loại khuẩn lạc màu hồng điển hình của E. coli, được kí hiệu HM. MAC là môi trường chọn lọc cho vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là E. coli. Muối mật có trong môi trường ức chế vi khuẩn Gram dương. Khi vi khuẩn Gram âm lên men lactose thì tạo ra acid làm cho pH của môi trường giảm, môi trường đỏ hơn và khuẩn lạc có màu đỏ (Koneman, 1983). Mẫu phân tiêu chảy nuôi cấy trên thạch SMAC, ta quan sát 2 loại khuẩn lạc: khuẩn lạc hồng (HS) và khuẩn lạc trắng (TS). Vi khuẩn không sử dụng sorbitol sẽ cho khuẩn lạc màu trắng. Đặc biệt các mẫu bề mặt thịt bò được tăng sinh trong môi trường peptone đệm bổ sung vancomycin và cefixime, đó là hai loại kháng sinh có tác dụng ức chế các vi khuẩn gram dương và một phần vi khuẩn gram âm trong đường ruột. Sau đó, cấy chuyển vi khuẩn lên môi trường thạch CT-SMAC với mục tiêu tăng sinh nhóm STEC, vì cefixime và tellurite có tác dụng ức chế vi khuẩn gram âm và các vi khuẩn E. coli sống hoại sinh trong ống tiêu hóa (FDA, 2002). Trên môi trường thạch CT-SMAC, chỉ quan sát được 1 loại khuẩn lạc màu trắng (TC). 4.1.2. Xác định E. coli cho các khuẩn lạc được chọn Sau khi giữ gốc vi khuẩn theo từng khuẩn lạc riêng lẻ trên ống thạch NA, thử phản ứng IMViC và khẳng định các gốc phân lập được là E. coli. 39 4.2. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bò tiêu chảy Mẫu phân bò tiêu chảy được cấy ria trực tiếp trên môi trường MAC và SMAC. Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 0 C, chọn khuẩn lạc điển hình, dùng que cấy chạm nhẹ lên từng khuẩn lạc đã chọn rồi cấy chuyển vào từng ống NA riêng biệt. Những khuẩn lạc sau khi đã cấy chuyển thì phần còn lại được thu chung thành nhóm khuẩn lạc: HM (khuẩn lạc hồng trên môi trường MAC), TS (khuẩn lạc trắng trên môi trường SMAC), HS (khuẩn lạc hồng trên môi trường SMAC). Như đã đề cập ở mục 4.1.2, sau khi phân lập và xác định E. coli trong mỗi mẫu phân thì giữ gốc vi khuẩn theo nhóm khuẩn lạc (dựa vào kiểu hình) trên thạch MAC (1 nhóm) và SMAC (2 nhóm) và theo từng khuẩn lạc riêng lẻ (mỗi nhóm giữ được 6 – 10 gốc khuẩn lạc riêng lẻ). Trên cơ sở đó, chúng tôi ly trích DNA của vi khuẩn theo nhóm khuẩn lạc hoặc từng khuẩn lạc riêng lẻ. Kết quả trình bày ở mục 4.1.1 cho thấy: (1) Trên thạch MAC chỉ có một loại khuẩn lạc hồng (HM). Như vậy nhóm khuẩn lạc này đại diện cho E. coli có trong mẫu phân khảo sát. (2) Trên thạch SMAC có hai loại khuẩn lạc: HS và TS. Cả hai nhóm khuẩn lạc này được xác định là E. coli. Như vậy nhóm nào cũng đại diện được cho E. coli có trong mẫu phân khảo sát. Tuy nhiên, theo đặc điểm của những serotype E. coli không sử dụng sorbitol sẽ cho khuẩn lạc màu trắng, thuộc nhóm STEC. Do đó, nhóm khuẩn lạc trắng trên thạch SMAC (TS) là nhóm E. coli có thể sản sinh độc tố Shiga (Stx). Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập từ phân bò tiêu chảy được trình bày ở bảng 4.1. Từ bảng 4.1 ta thấy có 2/8 (25%) mẫu phân chứa E. coli mang gen độc lực. Trong đó, 2/8 (25,5%) mẫu phát hiện được E. coli mang gen stx2, 1/8 (12,5%) mẫu phát hiện được E. coli mang gen hly. Nếu phân lập vi khuẩn này trên môi trường MAC thì có 1/8 mẫu phân (12,5%) chứa E. coli mang gen stx2. Nếu phân lập trên thạch SMAC và chỉ căn cứ theo nhóm khuẩn lạc đỏ hồng (HS), có 1/8 (12,5%) mẫu chứa E. coli mang gen stx2. Nếu căn cứ theo nhóm khuẩn 40 lạc trắng (TS) thì có 2/8 (25%) mẫu chứa E. coli mang gen stx2, 1/8 (12,5%) mẫu chứa E. coli mang gen hly lẫn stx2. Bảng 4.1 Kết quả phát hiện các gen độc lực của từng nhóm khuẩn lạc đại diện cho E. coli trong phân bò tiêu chảy Mẫu Gen độc lực Thứ tự Loại khuẩn lạc stx1 stx2 eae hly lt sta stb vt2e HM TS HS 1 x - + - - - - - - x - + - - - - - - x - + - - - - - - 2 x - - - - - - - - x - + - + - - - - x - - - - - - - - 3 x - - - - - - - - x - - - - - - - - x - - - - - - - - 4 x - - - - - - - - x - - - - - - - - 5 x - - - - - - - - x - - - - - - - - x - - - - - - - - 6 x - - - - - - - - x - - - - - - - - 7 x - - - - - - - - x - - - - - - - - 8 x - - - - - - - - x - - - - - - - - Tổng 8 5 7 0 2 0 1 0 0 0 0 Tỉ lệ (%) 100 62,5 87,5 0 25% 0 12,5 0 0 0 0 41 Tóm lại, trên cùng môi trường phân lập E. coli, những mẫu phân có cùng khuẩn lạc giống nhau vẫn không chắc được rằng chúng mang các gen độc lực như nhau. Tuy nhiên, nhóm khuẩn lạc nào mà multiplex – PCR không phát hiện được gen độc lực thì nhóm đó không mang E. coli gây bệnh. Vì tiêu chảy là triệu chứng rối loạn hấp thu tại đường ruột. Nguyên nhân của triệu chứng này có nhiều nguồn gốc khác nhau. Hậu quả của biểu hiện này đều làm thay đổi hệ vi khuẩn đường ruột. Nếu xét theo nguồn gốc do E. coli thì tiêu chảy có thể do nhóm STEC, ETEC hoặc EPEC. Vì thế, từ 4 nhóm khuẩn lạc mang gen độc lực đã được xác định là 1HM, 1TS, 1HS và 2TS, chúng tôi tiến hành ly trích DNA từ các gốc khuẩn lạc riêng lẻ để xác định các gen độc lực, kết quả được trình bày ở bảng 4.2. Bảng 4.2 Kết quả phát hiện gen stx1, stx2, eae, hly của một số khuẩn lạc E. coli riêng lẻ phân lập được từ phân bò tiêu chảy Mẫu Gen độc lực Loại khuẩn lạc Thứ tự khuẩn lạc stx1 stx2 eae hly 1TS 1 - + - - 2 - + - - 3 - + - - 4 - + - - 5 - + - - 6 - + - - 7 - - - - 8 - + - - 9 - + - - 10 - + - - 1HS 1 - + - - 2 - + - - 3 - + - - 4 - + - - 5 - + - - 6 - + - - 7 - + - - 42 8 - + - - 9 - + - - 1HM 1 - + - - 2 - + - - 3 - + - - 4 - + - - 5 - + - - 6 - + - - 7 - - - - 8 - + - - 9 - + - - 2TS 1 - + - - 2 - - - - 3 - + - + 4 - - - - 5 - - - - 6 - - - - 7 + - 8 - - - Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy: (1) 9 khuẩn lạc riêng lẻ màu hồng trên môi trường MAC của mẫu số 1 (1HM), multiplex – PCR phát hiện được 8/9 (88,9%) khuẩn lạc mang gen stx2 . (2) 9 khuẩn lạc riêng lẻ màu hồng trên môi trường SMAC của mẫu số 1 (1HS), multiplex – PCR phát hiện được 9/9 (100%) khuẩn lạc mang gen stx2. (3) 10 khuẩn lạc riêng lẻ màu trắng trên môi trường SMAC của mẫu số 1(1TS), multiplex – PCR phát hiện 9/10 (90%) khuẩn lạc mang gen stx2. (4) 8 khuẩn lạc riêng lẻ màu trắng trên môi trường SMAC của mẫu số 2 (2TS), multiplex – PCR phát hiện được 3/8 (37,5%) khuẩn lạc mang gen độc lực. Trong đó, 1/8 (12,5%) khuẩn lạc mang gen stx2 và hly, 2/8 (25%) khuẩn lạc mang gen stx2. Chỉ có 1 khuẩn lạc (2TS 3 ) mang gen hly trong tổng số 8 khuẩn lạc riêng rẽ thuộc nhóm 2TS phát hiện được gen hly. 43 Tóm lại, nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ có mang gen độc lực đó. Cho nên chọn từng khuẩn lạc để nghiên cứu là công việc chi tiết cần thiết để xác định thành phần các serotype của E. coli trong phân. Nếu mục tiêu này không được đặt ra cho nhà nghiên cứu thì việc lấy nhóm khuẩn lạc đại diện để phát hiện các gen độc lực là bước đi thích hợp hơn. 4.3. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân heo tiêu chảy Tương tự như mục 4.2, kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân heo tiêu chảy trên hai môi trường MAC và SMAC lần lượt trình bày ở bảng 4.3 và bảng 4.4. Kết quả ở bảng 4.3 cho ta thấy trong 9 mẫu phân heo tiêu chảy có 8/9 mẫu (chiếm 88,89%) phát hiện được E. coli mang gen độc lực, trong đó: - 6 mẫu (66,67%) phát hiện được gen stb, chiếm tỉ lệ phát hiện cao nhất. - 5 mẫu (55,56%) phát hiện được gen lt. - 3 mẫu (33,33%) phát hiện được gen vt2e. - 2 mẫu (22,22%) phát hiện được gen hly. - 1 mẫu (11,11%) phát hiện được gen stx1. - 1 mẫu (11,11%) phát hiên được gen eae. - Không phát hiện được gen stx2 và sta của E. coli trong 9 mẫu phân heo tiêu chảy. - Gen stb của E. coli phân lập được từ phân heo tiêu chảy chiếm tỉ lệ cao nhất (66,67%). Blanco và ctv (1997) nhận thấy rằng gen stb xuất hiện với tần số cao nhất 78,4% (58/74 mẫu) so với các gen độc lực khác của E. coli phân lập được từ phân heo con tiêu chảy hoặc phù thủng. Ông kết luận rằng độc tố STb góp phần đáng kể vào triệu chứng tiêu chảy trên heo. Điều này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Moon và ctv (1986), Harel và ctv (1991), Handl và ctv (1992), Lê Thị Mai Khanh (2004). - Có 3/9 mẫu (33,33%) E. coli từ phân heo tiêu chảy mang gen vt2e. Tuy độc tố VT2e không liên quan đến bệnh trên người, nhưng nó chính là nguyên nhân gây bệnh phù thủng trên heo con cai sữa (DesRosiers và ctv, 2001). Kỹ thuật PCR trở thành phương pháp phát hiện nhanh và chính xác để phát hiện E. coli gây bệnh phù thủng (Bertschinger và Fairbrother, 1999). 44 Bảng 4.3 Kết quả phát hiện các gen độc lực của từng nhóm khuẩn lạc đại diện cho E. coli trong phân heo tiêu chảy Mẫu Gen độc lực Thứ tự Loại khuẩn lạc stx1 stx2 eae hly lt sta stb vt2e HM TS HS 1 x - - - - - - - - x - - + + - - - - x - - + + - - - - 2 x - - - - - - - - x - - - - - - - - x + - - + - - - - 3 x - - - - - - + - x - - - - - - + - 4 x - - - - - - + - x - - - - + - + - x - - - - + - + + 5 x - - - - - - - - x - - - - + - + + 6 x - - - - + - + + x - - - - + - + - x - - - - - - + + 7 x - - - - + - + - x - - - - - - - - x - - - - - - - - 8 x - - - - + - + - x - - - - - - - - x - - - - - - - - 9 x - - - - - - - - x - - - - - - - - x - - - - - - - - Tổng 7 9 9 1 0 1 2 5 0 6 3 Tỷ lệ (%) 77,78 100 100 11,11 0 11,11 22,22 55,56 0 66,67 33,33 45 - Khác với bò, ở heo nhóm ETEC chiếm đa số trong mẫu phân tiêu chảy (stb (66,67%), lt (55,56%)). Phân bò được biết là nguồn lưu cữu tự nhiên của nhóm EHEC còn heo thì không. - Môi trường SMAC chọn lọc nhóm STEC, kết quả ở bảng 4.3 ta thấy các mẫu 1HS, 1TS, 2HS hiện diện các gen stx1, eae, hly; các mẫu 1HM, 2HM âm tính. Do kinh phí của đề tài có hạn, đối với phân heo tiêu chảy, các nhóm khuẩn lạc mang gen độc lực thì chúng tôi chỉ chọn ngẫu nhiên khoảng 2 – 3 khuẩn lạc riêng lẻ để ly trích DNA và chạy multiplex – PCR phát hiện các gen gây độc. Kết quả được trình bày ở bảng 4.4. Kết quả ở bảng 4.4 cho thấy (1) 4 khuẩn lạc riêng lẻ màu hồng trên MAC được lấy ngẫu nhiên, multiplex – PCR chỉ phát hiện được 1/4 số khuẩn lạc đó mang gen stb (25%). (2) 14 khuẩn lạc riêng lẻ màu hồng trên môi trường SMAC, multiplex – PCR phát hiện được 1/14 khuẩn lạc mang gen eae (7,1%); 4/14 khuẩn lạc mang gen lt (28,57%); 3/14 khuẩn lạc mang gen stb (21,43%); 4/14 khuẩn lạc mang gen vt2e (28,57%). (3) 9 khuẩn lạc riêng lẻ màu trắng trên môi trường SMAC, multiplex – PCR phát hiện được 3/9 khuẩn lạc mang gen lt (33,33%); 4/9 khuẩn lạc mang gen stb (44,44%) và 1/9 khuẩn lạc mang gen vt2e (11,11%). . phân lập được là E. coli. 39 4.2. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bò tiêu chảy Mẫu phân bò tiêu chảy được cấy ria trực tiếp trên môi trường MAC và. nghiên cứu thì vi c lấy nhóm khuẩn lạc đại diện để phát hiện các gen độc lực là bước đi thích hợp hơn. 4.3. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân heo tiêu chảy Tương. SMAC, CT-SMAC và thử phản ứng sinh hóa (IMViC) cho các khuẩn lạc thu được từ 8 mẫu phân bò tiêu chảy, 10 mẫu phân bê tiêu chảy, 9 mẫu phân heo cai sữa tiêu chảy và 9 mẫu bề mặt thịt bò, kết quả