46 Bảng 4.4 Kết quả phát hiện các gen độc lực cho một số khuẩn lạc E. coli riêng lẻ phân lập được từ phân heo tiêu chảy Mẫu Gen độc lực Loại khuẩn lạc khuẩn lạc được chọn stx1 stx2 eae hly lt sta stb vt2e 1HS (Eae, hly) 1 - - - - - - - - 2 - - + - - - - - 3 - - - - - - - - 1TS (Eae, hly) 2 - - - - - - - - 3 - - - - - - - - 4 - - - - - - - - 2HS (stx1, hly) 4 - - - - - - - - 5 - - - - - - - - 6 - - - - - - - - 3HS 2 - - - - - - - - (stb) 5 - - - - - - - - 3TS (stb) 3 - - - - - - - - 4 - - - - - - - - 4HM (stb) 1 - - - - - - + - 3 - - - - - - - - 4HS (stb) 5 - - - - + - + + 6 - - - - - - + - 4TS (lt, stb) 1 - - - - + - + + 2 - - - - - - + - 6TS (lt, stb) 3 - - - - + - + - 4 - - - - + - + - 6HS (stb, vt2e, lt) 1 - - - - - - - + 6 - - - - + - + - 5HS (lt, stb, vt2e) 2 - - - - + - - + 6 - - - - + - - + 8HM (lt, stb) 1 - - - - - - - - 6 - - - - - - - - 47 4.4. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bê tiêu chảy Bảng 4.5 Kết quả phát hiện các gen độc lực của từng nhóm khuẩn lạc đại diện cho E. coli trong phân bê tiêu chảy Mẫu Gen độc lực Thứ tự Loại khuẩn lạc stx1 stx2 eae hly lt sta stb vt2e HM TS HS 1 x - - - - - - - - x - - - - - - - - 2 x - - - - - - - - x - - - - - - - 3 x - - - - - - - - x - - - - - - - - 4 x + - - - - - - - x + - - - - - - - 5 x - - - - - - - - x - - - - - - - - 6 x + - + + - - - - x + - + + - - - - 7 x + + - - - - - x + + - - - - - - 8 x - - - - - - - - x - - - - - - - - 9 x - - - - - - - - 10 x - - - - - - - - Tổng 8 3 7 3 1 1 1 0 0 0 0 Tỉ lệ(%) 80 30 70 30 10 10 10 0 0 0 0 Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ 10 mẫu phân bê tiêu chảy được trình bày ở bảng 4.5. - Trong tổng số 10 mẫu phân có 3/10 (30%) mẫu phát hiện được E. coli mang gen độc lực, trong đó: 48  3/10 (30%) mẫu phân phát hiện được E. coli mang gen stx (stx1 hoặc/và stx2).  1/10 (10%) mẫu phân phát hiện được E. coli mang gen eae.  1/10(10%) mẫu phân phát hiện được E. coli mang gen hly. - Trong 10 mẫu phân bê tiêu chảy, không phát hiện được E. coli mang gen độc lực của nhóm ETEC, chỉ phát hiện được E. coli mang gen của nhóm STEC. Theo Beutin và ctv (1993), Chapman và ctv (1997), STEC được tìm thấy nhiều trong phân của bò, bê. Một vài dòng STEC có khả năng gây tiêu chảy cho bò, đặc biệt là bê (Smith và Scoland, 1998; Gyles, 1992). - Các gen stx1, stx2, eae, hly được phát hiện, trong khi gen vt2e thì không được phát hiện ở bất kì nhóm khuẩn lạc E. coli phân lập từ 10 mẫu phân bê tiêu chảy. Kết quả này là hoàn toàn hợp lý vì gen vt2e chỉ được tìm thấy trong nhóm STEC ở heo (Beutin và ctv, 1995). Theo Blanco và ctv (1997), gen vt2e là một biến chủng của gen stx2, biến chủng này chỉ được phát hiện ở những dòng E. coli gây phù thủng trên heo. Có 3 mẫu phát hiện được E. coli mang gen độc lực là mẫu 4, 6, 7.  Ở mẫu phân 4 có 2 loại khuẩn lạc HS và HM. Cả hai loại khuẩn lạc này đều mang gen stx1.  Ở mẫu phân 6 có hai loại khuẩn lạc HS và HM. Cả hai loại khuẩn lạc này đều mang gen stx1, eae, hly. Việc phát hiện nhiều gen độc lực trên cùng một mẫu sẽ tăng nguy cơ gây bệnh. Độc tố Hly gây xuất huyết ruột (Botteldoorn và ctv, 2003), gen hly có thể phát hiện cùng với gen stx1, stx2, eae trong phân của những bệnh nhân HUS (Paton và Paton, 1998 a ).  Ở mẫu phân 7 có 2 loại khuẩn lạc HS và HM. Cả hai loại khuẩn lạc này đều mang gen stx1, stx2. - Như vậy, trên cùng một mẫu phân bê tiêu chảy được phân lập trên 2 loại môi trường SMAC, MAC đều cho kết quả phát hiện gen độc lực giống nhau. Điều này chứng tỏ không có sự khác biệt về khả năng phát hiện gen độc lực giữa các loại khuẩn lạc (Hồng trên MAC hoặc hồng trên SMAC). 49 * Tổng kết việc phát hiện gen độc lực của E. coli từ những mẫu phân tiêu chảy trên, ta có những nhận xét sau: - Khả năng phát hiện các gen độc lực của E. coli từ những mẫu phân tiêu chảy lần lượt là 25% trên phân bò tiêu chảy, 30% trên phân bê tiêu chảy, 88,89% trên phân heo tiêu chảy. 4.5. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập từ mẫu bề mặt thịt bò Như đã trình bày ở phần 4.1.1, chúng tôi chỉ thu được nhóm khuẩn lạc trắng trên môi trường CT-SMAC (kí hiệu TC). Bảng 4.6 Kết quả phát hiện các gen độc lực của nhóm khuẩn lạc đại diện cho E. coli trong mẫu bề mặt thịt bò Mẫu Gen độc lực stx1 stx2 eae hly lt sta stb vt2e 1 - - - - - - - - 2 - - - - - - - - 3 - - - - - - - - 4 - - - - - - - - 5 - - - - - - - - 6 - - - - - - - - 7 - - - - - - - - 8 - - - - - - - - 9 - - - - - - - - Tổng 0 0 0 0 0 0 0 0 Tỷ lệ (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 Qua bảng 4.6, kết quả phát hiện các gen độc lực stx1, stx2, eae, hly, lt, sta, stb, vt2e từ nhóm khuẩn lạc TC phân lập từ mẫu bề mặt thịt bò là âm tính. Kết quả này có thể giải thích như sau: - Có thể do số mẫu xét nghiệm ít. - Do quy trình giết mổ đảm bảo vệ sinh. - Do mẫu xét nghiệm âm tính thật sự vì bò lấy mẫu không mang dòng E. coli gây độc. 50 4.6. Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli trên các mẫu khảo sát Với 36 mẫu khảo sát gồm 8 mẫu phân bò tiêu chảy, 9 mẫu phân heo tiêu chảy, 10 mẫu phân bê tiêu chảy, và 9 mẫu bề mặt thịt bò, tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli trên các mẫu khảo sát được trình bày ở bảng 4.7 và biểu đồ 4.1 Bảng 4.7 Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli trên các mẫu khảo sát Mẫu N n Gen độc lực stx1 stx2 eae hly lt-I sta stb vt2e Phân bò tiêu chảy 8 (%) 2 25 0 0 2 25 0 0 1 12,5 0 0 0 0 0 0 0 0 Phân heo tiêu chảy 9 (%) 8 88,89 1 11,11 0 0 1 11,11 2 22,22 5 55,56 0 0 6 66,67 3 33,33 Phân bê tiêu chảy 10 (%) 3 30 3 30 1 10 1 10 1 10 0 0 0 0 0 0 0 0 Bề mặt thịt bò 9 (%) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Tổng 36 13 4 3 2 4 5 0 6 3 % 36,1 11,11 8,33 5,56 11,11 13,89 0 16,67 8,33 N: Số lượng mẫu khảo sát n: Số lượng mẫu phát hiện E. coli có mang gen độc lực 51 Như vậy, qua bảng 4.7 và biểu đồ 4.1, trong 36 mẫu khảo sát gồm 27 mẫu có nguồn gốc từ bò (8 mẫu phân bò tiêu chảy, 10 mẫu phân bê tiêu chảy, và 9 mẫu bề mặt thịt bò), và 9 mẫu phân heo tiêu chảy. Ở phân bò tiêu chảy phát hiện được E. coli mang gen stx2 (25%) và hly (12,5%). Ở phân bê tiêu chảy, phát hiện được E. coli mang gen stx1 (30%), stx2 (10%), eae (10%), hly (10%). Như vậy ở các mẫu khảo sát có nguồn gốc từ bò chỉ phát hiện được nhóm STEC. Điều này hợp lí so với kết quả nghiên cứu của Beutin và ctv (1993). Ông cho rằng phân bò là nguồn lưu cữu chủ yếu của nhóm STEC. Ở phân heo tiêu chảy, phát hiện được E. coli mang gen stb (66,67%), lt-I (55,56%), vt2e (33,33%), hly (22,22%), stx1 (11,11%), eae (11,11%). Như vậy, ở phân heo tiêu chảy phát hiện được E. coli nhóm STEC và ETEC. Biểu đồ 4.1 Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli trên các mẫu khảo sát 52 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ những kết quả thu nhận được trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi rút ra những kết luận sau: (5) E. coli trên môi trường thạch MAC chỉ xuất hiện 1 loại khuẩn lạc hồng (HM), trên môi trường thạch SMAC xuất hiện 2 loại khuẩn lạc trắng (TS) và hồng (HS), trên môi trường thạch CT-SMAC xuất hiện 1 loại khuẩn lạc trắng. (6) Nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ có mang gen độc lực đó. (7) Tần số phát hiện các gen độc lực của E. coli từ những mẫu phân tiêu chảy lần lượt là: 25% trên phân bò tiêu chảy (stx2, hly), 30% trên phân bê tiêu chảy (stx1, stx2, hly, eae), 88,89% trên phân heo tiêu chảy (stb, lt, vt2e, hly, stx1, eae). (8) Điều này chứng tỏ rằng trên cả 3 nhóm đối tượng trên, E. coli mang các gen độc lực có thể là nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy. (9) 9 mẫu bề mặt thịt bò chưa phát hiện được vi khuẩn E. coli mang gen độc lực (10) Chưa phát hiện được gen sta trong E. coli phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, bê và heo. 5.2. Đề nghị (1) Có thể ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện gen độc lực của những dòng E. coli gây bệnh, góp phần chẩn đoán bệnh cho gia súc và người, kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm. (2) Tăng số lượng mẫu khảo sát, định serotype bằng kháng huyết thanh chuẩn (antisera). 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo dục Thành phố Hồ Chí Minh. 2. Lê Thị Mai Khanh, 2004. Phát hiện một số gen độc lực của Escherichia coli phân lâp được từ phân và thịt của bò, heo bằng kỹ thuật multiplex – PCR. Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp. Trường đại học Nông Lâm TP. HCM. 3. Trần Thanh Phong, 1996. Bệnh truyền nhiễm do vi trùng trên heo. Tủ sách Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM. TIẾNG NƯỚC NGOÀI. 4. Barrett T. J., Kaper L. B., Jerse A. E., and Wachsmuth I. K., 1992. Virulence factors in Shiga-like toxin producing Escherichia coli isolated from humans and cattle. J. Infect. Dis. 165: 970-980. 5. Bertschinger H. U. and Fairbrother J. M.,1999. Escherichia coli infections. In Diseases of swine (Eds. B. E. Straw, S. D’ Allaire, W. L. Mengeling, and D. J. Taylor). Iowa State University Press, Iowa, USA. 6. Beutin L., Montenegro M. A., Orskov I., Orskov F., Prada J., Zimmermann S., and Stephan R., 1989. Close association of verotoxin (shiga-like toxin) producing Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 27:2559-2564. 7. Beutin L., Geier D., Steinruck S., Zimmermann S., and Scheutz F., 1993. Prevalence and some properties of verotoxin (Shiga-like-toxin)-producing Escherichia coli in seven different species of healthy domestic animals. J. Clin. Microbiol. 31:2483-2488. 8. Beutin L., Aleksic S., Zimmermann S., and Scheutz F., 1994. Virulence factors and phenotypic traits of verotoxigenic Escherichia coli isolated from human patients in Germany. Med. Microbiol. Immunol. (Berlin) 183:13-21. 9. Beutin L., Geier D., Zimmermann S., and Karch H., 1995. Virulence markers of Shiga like toxin producing Escherichia coli strains originating from healthy domestic animals of different species. J. Clin. Microbiol. 33:631-635. 10. Black R. E., Merson H. M., Huq I., Aleim A. R. M., and Yunus N., 1981. Incidence and severity of rotavius and Echerichia coli in rural Banglades. Lancet I:141-143. 54 11. Blanco M., Blanco J. E., Gonzalez E. A., Mora A., Jansen W., Gomes T. A. T., Zerbini L. F., Yano T., de Castro A. F. P., and Blanco J., 1997. Gene coding for enterotoxins and Verotoxins in Porcine Escherichia coli strains belonging to different O:K:H serotype: relationship with phenotype. J. Clin. Microbiol. 35:2958-2963. 12. Botteldoorn N., Heydrick M., Rijpens N., Herman L., 2003. Detection and characterization of verotoxigenic Escherichia coli by a VTEC/EHEC multiplex – PCR in porcine faeces in pig carcass swabs. Res. Microbiol. 154:97-104. 13. Brown T. A., 1994. Gene cloning and introduction. 3 rd edition. UMIST, Manchester, UK 14. Butler D., 1996. Novel pathogens beat food safety check. Nature 384:397. 15. Calderwood S. B., Acheson D. W. K., Keuch G. T., Barrett T. J., Griffin P. M., Strockbine N. A., 1997. Proposed new nomenclature for SLT (VT) family. ASM News 1997:118-119. 16. Cebula T. A., Payne W. L., and Fegn P., 1995. Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype 0157:H7 and their Shiga-like toxin type by Mismatch amplification mutation assay multiplex – PCR. J. Clin. Microbiol. 33:28-250. 17. Cerna J. F., Nataro J. P, and Garcia T. E., 2003. Multiplex – PCR for detection of three plasmid borne genes of enteroaggregative Escherichia coli strains. J. Clin. Microbiol. 42:2138-2140. 18. Chalmers R. M., Salmon R. L., Willshaw G. A., Cheasty T., Looker N., Davies I., and Wray C., 1997. Verocytotoxin-producing Escherichia coli O157 in a famer handling horses. Lancet 349:1816. 19. Chapman P. A., and Siddons C. A., Cerdan Malo A. T., and Harkin M. A., 1997. A 1 – year study of Escherichia coli in cattle, sheep, pigs and poultry. Epidemiol. Infect. 119:245-250. 20. Cocolin L., Manzano M., Cantoni C., Comi G., 2000. A multiplex-PCR method to detect enterohemorrhagic (EHEC) and enteropathogenic (EPEC) Escherichia coli in arttificially contaminated foods. Int. J. Hyg. Environ. Health. 203:159-164. 21. DesRosiers A., Fairbrother J. M., Johnson R. P., Desautels C., Letellier A. Qeessy S., 2001. Phenotypic and genotypic characterization of Escherichia coli verotoxin-producing isolates from humans and pigs. J. Food Protect. 64:1904-1911 . thịt bò chưa phát hiện được vi khuẩn E. coli mang gen độc lực (10) Chưa phát hiện được gen sta trong E. coli phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, bê và heo. 5.2. Đề nghị (1) Có thể ứng. mẫu phân bò tiêu chảy, 10 mẫu phân bê tiêu chảy, và 9 mẫu bề mặt thịt bò) , và 9 mẫu phân heo tiêu chảy. Ở phân bò tiêu chảy phát hiện được E. coli mang gen stx2 (25%) và hly (12,5%). Ở phân. năng phát hiện các gen độc lực của E. coli từ những mẫu phân tiêu chảy lần lượt là 25% trên phân bò tiêu chảy, 30% trên phân bê tiêu chảy, 88,89% trên phân heo tiêu chảy. 4.5. Kết quả phát hiện