31 ctcggcgtga taagttatct atcgctgaga cactgtaaaa aggtggccat tgtatatgca ag Với primer ITS4, vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 đã đọc được là 566bp. Trình tự như sau: gtttttcacg ggggagatcc tacctgattt gagatcagat cataaaaatg tattttgtc caagtcaagt cgactattag aagcggttcg tcttgcattt accttggcca cctttttac agtgtcctca gcgatagata acttatcacg ccgagtggaa ccaagcataa cacttagag atccagctaa taaacaaaga ggcgcagggt gtgaaactgc aaagacctcc aaaaccaaa gtaagagacc gattgaatta acaaaaggtt tactttgaag atttcatgat actcaaaca ggcatgctcc aaggaatacc aaggagcgca aggtgcgttc aaagattcga tgattcact Gaattctgca attcacatta cttatcgcat ttcgctgcgt tcttcatcga tgcgagagt caagagatcc gttgttgaaa cttagtatta gatgcgttac atcaattaca ttcgtttta aatttaatag agtttgtatg ttaattgagt agacagcaaa agccaagaaa ggaggattt atttttttta atgaaactcc cccttg Sau đó chúng tôi so trình tự của 2 chuỗi DNA đã đọc được thì thu được trình tự của vùng rDNA-ITS là 468bp. Trình tự như sau: caagtgtgga gcttcattgc aaaacttttc cctccttctc ttggcttttg ctgtctactc aattaacata caaactctat taaatttaaa acgaatgtaa ttgatgtaac gcatctaata ctaagtttca acaacggatc tcttggctct cgcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca ccttgcgctc cttggtattc cttggagcat gcctgtttga gtatcatgaa atcttcaaag taaacctttt gttaattcaa tcggtctctt actttggttt tggaggtctt tgcagtttca caccctgctc ctctttgttt attagctgga tctctaagtg ttatgcttgg ttccactcgg cgtgataagt tatctatcgc tgaggacact gtaaaaaggt ggccaaggta aatgcaag Trên website (http://www.ebi.ac.uk/) chúng tôi so sánh trình tự vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 với trình tự vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani có mã số sau: AB122134 AG-IA 670 bp AB122126 AG1-ID 694 bp AB122124 AG2-1 669 bp AB122143 AG -4 672 bp AB122142 AG1-IC 651 bp Qua nhiều kết quả chúng tôi nhận thấy vùng rDNA-ITS của dòng nấm mang số hiệu AB122126 thuộc nhóm tiếp hợp AG1-ID là phù hợp nhất với trình tự 32 vùng rDNA-ITS đọc được của dòng SR-650. Tỉ lệ tương đồng trình tự đoạn rDNA- ITS đã đọc được 468bp của dòng SR650 và AB122126 là 100%. Trình tự đoạn rDNA-ITS của dòng nấm mang mã số AB1221126 là: 1 aaggatcatt attgaattta ttaatgagga gtagagttgt agctggccat ttttctggca 61 atgtgcacac tcttctcttt catccacaca cccctgtgca cctgtgagac agttacaagg 121 tcattttgga gtttggg{caa gtgtggagct tcattgcaaa acttttccct ccttctcttg 181 gcttttgctg tctactcaat taacatacaa actctattaa atttaaaacg aatgtaattg 241 atgtaacgca tctaatacta agtttcaaca acggatctct tggctctcgc atcgatgaag 301 aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt 361 gaacgcacct tgcgctcctt ggtattcctt ggagcatgcc tgtttgagta tcatgaaatc 421 ttcaaagtaa accttttgtt aattcaatcg gtctcttact ttggttttgg aggtctttgc 481 agtttcacac cctgctcctc tttgtttatt agctggatct ctaagtgtta tgcttggttc 541 cactcggcgt gataagttat ctatcgctga ggacactgta aaaaggtggc caaggtaaat 601 gcaag}acgaa ccgcttctaa tagtccattg acttggacaa aatacatttt tatgatctga 661 tctcaaatca ggtaggacta cccgctgaac ttaa Trong dấu {}là đoạn DNA tương đồng kết quả đọc được của dòng SR-650 với dòng nấm mang mã số AB122126. Đoạn tương đồng này từ vị trí nucleotide 137 đến vị trí 605 dối với dòng nấm có mã số AB122126. Đoạn này có 468 nucleotide. CLUSTAL X (1.83) multiple sequence alignment SR650 AB122126 AAGGATCATTATTGAATTTATTAATGAGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCA SR650 AB122126 ATGTGCACACTCTTCTCTTTCATCCACACACCCCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAGG SR650 CAAGTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTTG AB122126 TCATTTTGGAGTTTGGGCAAGTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTTG ******************************************* SR650 GCTTTTGCTGTCTACTCAATTAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATTG AB122126 GCTTTTGCTGTCTACTCAATTAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATTG 33 ************************************************************ SR650 ATGTAACGCATCTAATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAG AB122126 ATGTAACGCATCTAATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAG ************************************************************ SR650 AACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT AB122126 AACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT ************************************************************ SR650 GAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAATC AB122126 GAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAATC ************************************************************ SR650 TTCAAAGTAAACCTTTTGTTAATTCAATCGGTCTCTTACTTTGGTTTTGGAGGTCTTTGC AB122126 TTCAAAGTAAACCTTTTGTTAATTCAATCGGTCTCTTACTTTGGTTTTGGAGGTCTTTGC ************************************************************ SR650 AGTTTCACACCCTGCTCCTCTTTGTTTATTAGCTGGATCTCTAAGTGTTATGCTTGGTTC AB122126 AGTTTCACACCCTGCTCCTCTTTGTTTATTAGCTGGATCTCTAAGTGTTATGCTTGGTTC ************************************************************ SR650 CACTCGGCGTGATAAGTTATCTATCGCTGAGGACACTGTAAAAAGGTGGCCAAGGTAAAT AB122126 CACTCGGCGTGATAAGTTATCTATCGCTGAGGACACTGTAAAAAGGTGGCCAAGGTAAAT ************************************************************ SR650 GCAAG AB122126 GCAAGACGAACCGCTTCTAATAGTCCATTGACTTGGACAAAATACATTTTTATGATCTGA ***** SR650 AB122126 TCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAA Dấu * biểu thị trình tự của dòng SR-650 với trình tự của AB122126 khớp với nhau. Như vậy, kết quả đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR được làm tinh sạch bằng kit “GFX PCR DNA and Gel Band Purication” của công ty Amersham đã cho kết quả tốt hơn so với sử dụng kit Quantum Prep Freeze “N Squeeze DNA gel Extraction Spin Column” của BioRad. Tuy nhiên, với cùng 1 kit làm tinh sạch (của Amersham) và qui trình đọc trình tự, vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03 chi đọc được 1 đoạn ngắn. điều này cho thấy qui trình đọc trình tự với máy đọc trình tự DNA ABI 3100 của hãng Applied Biosystem có thể là chưa hoàn thiện nên kết quả không ổn định. 34 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1.Kết luận  Cải thiện được qui trình li trích DNA của nấm R. solani bằng cách thêm một khâu khử protein. DNA tổng số thu được có thể sử dụng cho phản ứng PCR mà không cần xử lí RNase.  Chọn được thành phần phản ứng PCR để khuếch đại thành công vùng rDNA-ITS của nấm R. solani.  Bước đầu đã đọc được trình tự vùng rDNA-ITS của nấm R. solani . 5.2.Đề nghị  Hoàn thiện qui trình đọc trình tự để có kết quả đọc trình tự tốt hơn.  Đọc trình tự vùng rDNA-ITS của nhiều dòng nấm để có thể đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể nấm này. 35 PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử - Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh. 2. Nguyễn Thị Huệ, 2003. Khảo sát một số đặc tính và đánh giá sự đa dạng của một số mẫu phân lập Rhizoctonia solani thu thập từ một số cây kí chủ khác nhau. Luận văn tốt nghiệp kĩ sư Nông Học đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh. 3. Nguyễn Đình Huyên, 1999. Những điều cơ bản của kĩ thuật di truyền. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh. 4. Nguyễn Việt Long, 2001. Hiệu quả phòng trừ bệnh đốm vằn trên lúa của hai chủng vi khuẩn đối kháng với nấm Rhizoctonia solani trên ruộng lúa ở Đồng Tháp. Luận văn thạc sĩ ngành Nông Học đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh. 5. Khuất Hữu Thanh, 2003. Cơ sở di truyền phân tử và kĩ thuật gen. Nhà xuất bản Khoa Học và Kĩ Thuật, Hà Nội. 6. Nguyễn Văn Uyển, 1995. Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh. Tiếng Anh 7. Banniza. S., Sy. A. A., Bridbe. P. D., Simons .S. A. and Holderness. M., 1999. Characterization of populations of Rhizoctonia solani in Paddy Rice Fields in Cote d’Ivoire. Phytopathology 89: 414 – 420. 36 8. Boysen. M., Borjia. M., Moral. C., Salazar. O., and Rubio. V., 1996. Identification at strain level of Rhizoctonia solani AG4 isolates by direct sequence or asymmetric PCR products of the ITS region. Curr. Genet. 29: 174 – 1811. 9. Butler, E. E., and Bracker, C. E, 1970. Morphology and cytology of Rhizoctonia solani. Pages 32 – 51 in J. R. Pameter, Jr.,ed. Rhizotonia solani, Biology and Pathology. University of California Press, Berkeley. 255pp. 10. Carling. D. E. and Sumner. D. R., 1992. Rhizoctonia. Pages 157 – 165 in: Method for reseach on soilborne phytopathogenic fungi. L. L. Songton, J. D. Mihail and Rush (eds). APS, St. Paul, Minnesota. 11. Hsiang. T., and Dean .J. D., 2001. DNA sequencing for anastomosis grouping of Rhizotonia solani isolates from Poa annua. International turgrass society research journal 9: 674 – 678. 12. Kuninaga. S., Natsuaki. T., Takeuchi. T., and Yokosawa. R., 1997. Sequence variation of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in Rhizotonia solani. Curr. Genet. 32: 237 – 243. 13. Lee. S. B., and Taylor. J. W., 1990. Isolation of DNA from fungal mycelia and single spore. In: Weising. K., Nybom. H., Wolff. K., and Meyer. W., 1995, DNA fingerfrinting in plants and fungi. CRC Rress, Coca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo, pages 70-71. 14. Liu. Z. L., and Sinclair, J. B, 1992. Genetic diversity of Rhizotonia solani anastomosis group 2. Phytopathology. 82: 778 – 787. 15. Matsumoto. M., Furuya. N., Takanami. Y. and Matsuyama. N., (1996). RFLP analysis of PCR – amplified 28S rDNA in Rhizoctonia solani. Mycoscience 37: 351 – 326. 16. O’brain P. A., 1998. Molecular markers in Australian isolates of Rhizoctonia solani. Mycol. Res. 98: 665 – 671. 17. Papavizas, G. C., 1957. Colonization and Growth of Rhizoctonia solani in Soil. Crops Research Divesion. Pages 108 – 122. 37 18. Schneider. J. H. M, Ssalazar. O., Rubio. V. and Keijer. J., 1997. Identification of Rhizoctonia solani associated with field-grown tulips using ITS r DNA polymorphism and pectic Zymograms. European Journal of Plant Pathology. 103: 607 – 622. 19. Sneh. B., Burpee. L., Ogoshi. A . Identification of Rhizoctonia solani Species. The American Phytopathological society. Pages 67 – 75. 20. Vilgalys, S. and Gonzales, D., 1989. Ribosomal DNA restriction Fragment length polymorphisms in Rhizoctonia solani. Phyopathology 80; 151 – 158. 21. Weising. K., Nybom. H., Wolff. K., and Meyer. W,. DNA Fingerprinting in Plants and Fungi. Methology. Pages 192 – 200. 22. White, T. J., Burns. T., Lee. S., and Taylor. L., 1991. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetic. Pages 315 – 322 in . M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky and T. J. White (ed.) PCR Protocol. A guide to method and appliffiaction. Academic Press, New York. 3. Internet 23. http://www.cals.ncsu.edu/course/pp728/Rhizoctonia/Ident01.JPG 24. http://www.uoguelph.ca/~thsiang/pubs/pdf/04daylilyrust.pdf 25. http://www.ipm.ucdavis.edu/PMG/r52100311.html#SYMPTOMS 26. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 27. http://www.ebi.ac.uk 38 PHẦN VII PHỤ LỤC Phụ lục.1. Đọc trình tự vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 với ITS4 39 Phụ lục.2. Đọc trình tựvùng rDNA-ITScủa dòng SR-650 với ITS1 40 Phụ lục.3. Đọc trình tự vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03 với ITS1 . vùng rDNA-ITS của nấm R. solani.  Bước đầu đã đọc được trình tự vùng rDNA-ITS của nấm R. solani . 5.2.Đề nghị  Hoàn thiện qui trình đọc trình tự để có kết quả đọc trình tự tốt hơn.  Đọc. với trình tự 32 vùng rDNA-ITS đọc được của dòng SR-650. Tỉ lệ tương đồng trình tự đoạn rDNA- ITS đã đọc được 46 8bp của dòng SR650 và AB122126 là 100%. Trình tự đoạn rDNA-ITS của dòng nấm. (http://www.ebi.ac.uk/) chúng tôi so sánh trình tự vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 với trình tự vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani có mã số sau: AB1221 34 AG-IA 670 bp AB122126 AG1-ID 694