39 Những ô để trống Nƣớc cất Buffer Đối chứng dƣơng Đối chứng âm Mẫu ly trích Hình 3.1: Sơ đồ bố trí phản ứng ELISA 3.4.2 Chẩn đoán TSWV bằng RT – PCR 3.4.2.1 Giai đoạn ly trích RNA theo Kit ly trích của Biorad  Bƣớc 1: Cân khoảng 60 mg mẫu lá ớt đã qua chẩn đoán ELISA cho kết quả dƣơng tính. Cho mẫu vào cối (đã qua xử lý với NaOH, EDTA, rửa lại bằng nƣớc cất siêu sạch, bọc giấy bạc rồi đem hấp khử trùng ở 121 o C trong 20 phút, sấy khô trong một ngày đêm) nghiền thành bột mịn với nitơ lỏng. Thêm nitơ lỏng thƣờng xuyên, không để cho mẫu bị nóng lên.  Bƣớc 2: Lấy muỗng cho vào hết trong tube ly tâm 2ml có nắp đậy (không có RNase). Hòa tan mẫu bằng dung dịch ly giải (lysis solution) có bổ sung PVP 2% (hỗn hợp này đã đƣợc trộn trƣớc: 14µl PVP 2% + 700µl dung dịch ly giải cho mỗi mẫu)  Bƣớc 3: Cho 700µl dung dịch đã đƣợc trộn ở bƣớc trên vào tube chứa mẫu, trộn thật kỹ bằng pipet khoảng 10 lần  Bƣớc 4: Ly tâm 13000 vòng trong 3 phút. Chuyển toàn bộ dịch nổi vào tube ly tâm 2ml mới.  Bƣớc 5: Thêm 700 µl ethanol 70%, hoà tan bằng pipet cho đến khi không còn sự phân lớp  Bƣớc 6: Ủ ấm dung dịch hoà tan (elution solution) trong bồn ủ ở 70 o C (để chuẩn bị cho bƣớc 15). Đặt RNA binding column (RNAbc) vào tube 2ml không nắp. 40  Bƣớc 7: Cho 700µl dung dịch ở bƣớc 5 vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 60 giây, loại bỏ dịch lọc. Thực hiện tƣơng tự cho đến hết phần dịch còn lại.  Bƣớc 8: Dịch rửa low stringency từ 5X pha loãng bằng ethanol 95 – 100% xuống còn 1X  Bƣớc 9: Cho 700µl dung dịch low stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây, loại bỏ dịch lọc  Bƣớc 10: Pha Dnase I với 250µl Tris 10mM pH 7.5. Hoà tan bằng pipet.  Bƣớc 11: Trộn 5µl Dnase I với 75µl dung dịch Dnase dilution trong tube 1.5ml, cho vào RNAbc. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, ly tâm 30 giây. Loại bỏ dịch lọc.  Bƣớc 12: Cho 700µl high stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây, loại bỏ dịch lọc.  Bƣớc 13: Thực hiện tƣơng tự nhƣ bƣớc 12 nhƣng với dung dịch low stringency.  Bƣớc 14: Ly tâm 12000 vòng trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa.  Bƣớc 15: Chuyển RNAbc vào tube 1.5ml có nắp đậy, cho vào 80µl dung dịch hoà tan ở bƣớc 6. Để 1 phút, ly tâm 12000 vòng trong 2 phút để thu RNA tổng số. Bảo quản ở 4 o C. 3.4.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của RNA bằng điện di  Bƣớc 1: Các mẫu sau khi ly trích xong, hút 2µl để chạy điện di, thấy xuất hiện các vệt băng.  Bƣớc 2: Xử lý với RNase: hút 1µl RNase cho vào tube chứa 2µl mẫu RNA tổng số vừa ly trích 3.4.2.3 Lựa chọn cặp Primer chạy RT – PCR  Primers (mồi): Dƣới đây là một số cặp primer đƣợc sử dụng trong PCR để khuếch đại một đoạn gen trong genome của virút TSWV L1 TSWV R 5’-AAT TGC CTT GCA ACC AAT TC-3’ L2 TSWV F 5’-ATC AGT CGA AAT GGT CGG CA-3’ (J.Morris) TSWV-CP–17F TSWV 5’ – CTCTTGATGATGCAAAGTCTGTGA– 3’ TSWV-CP–100RTSWV5’–TCTCAAAGCTATCAACTGAAGCAATAA-3’ 41 (J.Morris) TSWV723 CAC AAG GCA AAG ACC TTG AG 2698-2717b 620 TSWV722 GCT GGA GCT AAG TAT AGC 2098-2118c 5’ATGTCTAAGGTTAAGCTC-3 5 TTAAGCAAGTTCTGTGAG-3 )(protein vỏ)(800bp) (P. Sreerama Kumar, 2000)  Tiến trình PCR là một tiến trình rất nhạy, nếu các primer không đƣợc kiểm tra trƣớc về độ đặc hiệu (tức là ngoài sản phẩm chính theo mong đợi thì nó còn có thể khuếch đại với các loài khác gây ức chế phản ứng PCR), ngoài ra còn phải kiểm tra có bao nhiêu vị trí trên genome mà primer có thể bắt cặp đƣợc. Chính vì lý do này mà chúng ta phải kiểm tra để chọn ra cặp primer thích hợp cho việc khuếch đại bằng PCR. Công việc này đƣợc thực hiện bởi phần phần mềm Blast hiện có trên mạng Internet. Các bƣớc thực hiện nhƣ sau:  Bƣớc 1: Vào trang chủ NCBI  Bƣớc 2: Vào Folder Blast  Bƣớc 3: Nhập trình tự của cả hai primer vào  Chú ý: Nhập nhƣ sau: Primer1 nnnnnnnnnnnnn Primer2 (lấy bổ sung và đảo đầu đối với primer2 này vì genome của con virút TSWV là RNA sợi đơn) 3.4.2.4 Khuếch đại bằng RT – PCR RT – PCR hai bƣớc Bƣớc 1: Reverse transcription  Thành phần hoá chất  Thể tích RNA tổng số chạy thí nghiệm: 2µl; 4µl; 6µl; 8µl; 10µl  iScript Reaction Mix 4µ  iScript Reverse Transcriptase 1µ  Nuclease-free water 13µ  RNA khuôn mẫu 2µ Tổng thề tích 20µ 42  Chu trình nhiệt 5 phút ở 25 o C 30 phút ở 42 o C 5 phút ở 85 o C Giữ ở 4 o C Bƣớc 2: Khuếch đại bằng PCR  Thành phần hoá chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối iTaq buffer 10X 5µl 1X MgCl 2 50mM 1.5µl 1.5mM dNTP mix 10mM 1µl 200µM iTaq DNA polymerase 0,25µl 1,25units primer 1 2µl 0,1pmol primer 2 2µl 0,1pmol Nuclease-free-water 33,25µl DNA đã qua Reverse 2µl Tổng thể tích 50µl  Chu trình nhiệt cho phản ứng 1 chu kỳ 5 phút ở 94 o C 30 chu kỳ 1 phút ở 94 o C 1 phút ở 55 o C 1 phút ở 72 o C 1 chu kỳ 10 phút ở 72 o C Giữ ở 4 o C trong 15 phút  Chú thích: Trên đây là protocol chuẩn (J.Morris), nhƣng trong quá trình tiến hành chúng tôi thấy không cho kết quả nên đã có một số thay đổi mang tính chất thí nghiệm để tìm ra qui trình phù hợp, một số thay đổi nhƣ sau:  Hạ nhiệt độ bắt cặp từ 55 o C xuống 50 o C; 48 o C; 46 o C  Hạ nhiệt độ bắt cặp kết hợp với tăng chu kỳ từ 30 chu kỳ lên 35 chu kỳ; 45 chu kỳ 43  Hạ nhiệt độ bắt cặp, tăng chu kỳ kết hợp với tăng nồng độ primers từ 5pmol lên 50pmol (đã qua tham khảo thầy cô và bạn bè)  Tăng nồng độ MgCl 2 từ 1,5µl lên 2µl; 2,5µl  Ly tâm nhẹ RNA tổng số để mong thu đƣợc nồng độ cao hơn  Tăng nồng độ Taq DNA polymerase từ 1,25U lên 2,5U RT – PCR hai bƣớc  Thành phần hoá chất Dung dịch đ ệm AMV/Tfl 5X 10µl 1X dNTP mix (10mM m ỗi lo ại dNTP) 1µl 0,2mM MgSO 4 25mM 2µl 1mM Primer xuôi 50pmol 1µM Primer ngƣợc 50pmol 1µM AMV Reverse Transcriptase (5u/µ) 1µl 0,1u/µl Tfl DNA polymerase (5u/µl) 1µl 0,1u/µl RNA tổng số 5µl Nuclease-free Water 28µl Tổng thể tích 50µl  Chú thích: có chạy kèm đối chứng dƣơng của công ty Promega để kiểm tra thao tác và hoạt động của máy.  Chu trình nhiệt 1 chu kỳ 45 o C trong 45 phút 1 chu kỳ 94 o C trong 2 phút 45 chu kỳ 94 o C trong 30 giây 50 o C trong 1 phút 72 o C trong 1 phút 1 chu kỳ ở 72 o C trong 10 phút 1 chu kỳ ở 4 o C trong 15 phút 3.4.2.5 Phƣớng pháp đổ gel agarose điện di  Bƣớc 1: Chuẩn bị gel agarose 1-2%  Bƣớc 2: Làm nguội agarose đã đƣợc nấu chín đến 50-60 o C, sau đó đổ vào khuôn đã đƣợc đặt lƣợc vào trƣớc 44  Bƣớc 3: Lấy lƣợc ra, cho gel vào 1×TBE.  Bƣớc 4: Hút 2µl loading dye trộn với 4µl mẫu  Bƣớc 5: Bơm vào các giếng một cách cẩn thận 4µl mẫu + dung dịch đệm.  Bƣớc 6: Chạy điện di ở 100V/40mA, cho đến khi thuốc nhuộm cách đầu tận cùng của gel là 1cm.  Bƣớc 7: Lấy gel ra và ngâm vào dung dịch ethidium bromide (0,5Ug/ml) trong 20 phút.  Bƣớc 8: Rửa nhẹ gel với nƣớc đã qua chƣng cất.  Bƣớc 9: Đọc kết quả dƣới tia UV, thẩm định kết quả với marker.  Bƣớc 10: Chụp bản gel để lƣu lại kết quả 45 Phần IV Kết quả Thảo luận 4.1 Mức độ nhiễm bệnh TSWV ở 3 xã đại diện cho 3 huyện qua chẩn đốn ELISA 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra Bảng 4.1: Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV tại các xã: Nhuận Đức, Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng 12,1 12,5 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Tỉ lệ (%) Xã Nhuận Đức Phước Thạnh Lộc Hưng Đồ thị 4.1: Tỷ lệ nhiễm virút TSWV tại các xã: Nhuận Đức,Phƣớc Thạnh, Lộc Hƣng.  Qua kết quả trên chúng tơi thấy rằng tỉ lệ nhiễm TSWV trên các địa bàn xã tại hai huyện Củ Chi (12,1%) và Châu Thành (12,5%) còn ở mức thấp, trái lại trên địa bàn xã Lộc Hƣng huyện Trảng Bàng tỉnh Tây Ninh chƣa thấy mầm mống của virút TSWV (0%). Địa bàn Số mẫu điều tra Số mẫu nhiễm TSWV % mẫu nhiễm TSWV Nhuận Đức 91 11 12,1 Phƣớc Thạnh 32 4 12,5 Lộc Hƣng 12 0 0 46 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo từng giống ớt  Hiện tại theo nghiên cứu này chúng tôi chƣa xác định đƣợc tỷ lệ bệnh nhiễm vào từng giống ớt là do yếu tố khách quan vì rất ít hộ nông dân nắm vững tên của giống ớt mà họ đang trồng. Đa số ngƣời dân chỉ biết là mua ớt tại công ty nào thôi, chứ ớt giống gì thì bà con hầu nhƣ chƣa quan tâm lắm. Dƣới đây là một số giống ớt theo chẩn đoán là đã bị nhiễm virút TSWV Hình 4.1: Ớt Ba tri (tên ngƣời dân thƣờng gọi) bị nhiễm TSWV Hình 4.2: Ớt hiểm Bungari (tên ngƣời dân thƣờng gọi) bị nhiễm TSWV 47 4.1.3 Tỷ lệ nhiễm virút TSWV theo triệu chứng Triệu chứng bệnh trên cây ớt là rất nhiều nhƣng qua quá trình tham khảo tài liệu cùng với phán đoán chủ quan thì chúng tôi ghi nhận lại các triệu chứng nhƣ sau:  Lá khảm vàng xanh, cong. Hình 4.3: Ớt có triệu chứng lá khảm vàng xanh, cong (hình chụp tại vƣờn của chủ hộ Nguyễn Văn Bảnh, ấp Bầu Tròn - Nhuận Đức - Củ Chi ngày 21 tháng 3 năm 2005)  Lá chấm vàng xanh, nhăn nheo,co lại, dày, giòn Hình 4.4: Ớt có triệu chứng lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn (hình chụp tại vƣờn ông Cần, ấp Phƣớc Thuận - Phƣớc Thạnh – Châu Thành - Tiền Giang ngày 3 tháng 4 năm 2005) 48  Khảm nặng có chấm đen, lủng lỗ Hình 4.5: Ớt có triệu chứng khảm nặng,chấm đen, lủng lỗ (hình chụp tại vƣờn ông Huỳnh Ngọc Đạt, ấp Phƣớc Thuận – Phƣớc Thạnh – Châu Thành – Tiền Giang ngày 3 tháng 4 năm 2005)  Khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ Hình 4.6: Ớt có triệu chứng khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ (hình chụp tại vƣờn bà Nguyễn Thị Liễu, ấp Bầu Tròn - Nhuận Đức ngày 15 tháng 3 năm 2005) . đại bằng PCR. Công việc này đƣợc thực hiện bởi phần phần mềm Blast hiện có trên mạng Internet. Các bƣớc thực hiện nhƣ sau:  Bƣớc 1: Vào trang chủ NCBI  Bƣớc 2: Vào Folder Blast  Bƣớc 3:. Hình 3. 1: Sơ đồ bố trí phản ứng ELISA 3.4.2 Chẩn đoán TSWV bằng RT – PCR 3.4.2.1 Giai đoạn ly trích RNA theo Kit ly trích của Biorad  Bƣớc 1: Cân khoảng 60 mg mẫu lá ớt đã qua chẩn đoán ELISA. Phƣớng pháp đổ gel agarose điện di  Bƣớc 1: Chuẩn bị gel agarose 1-2 %  Bƣớc 2: Làm nguội agarose đã đƣợc nấu chín đến 5 0 -6 0 o C, sau đó đổ vào khuôn đã đƣợc đặt lƣợc vào trƣớc 44  Bƣớc 3: