41 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN - DNA ly trích từ cơ tinh sạch và đạt năng suất cao hơn DNA ly trích từ lông. - DNA ly trích từ gốc lông có độ tinh sạch cao hơn DNA ly trích từ ngọn lông. - Qui trình PCR với chu trình nhiệt I (tăng thời gian của phản ứng) và Taq ABgene 1,5 UI có thể xác định giới tính thành công trên ba giống ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan với tỷ lệ thành công 100%. - Mức độ làm khô DNA trong giai đoạn thu hồi DNA ảnh hưởng đến hiệu quả PCR xác định giới tính. - Sử dụng DNA ly trích từ lông trong PCR xác định giới tính cho hiệu quả thấp hơn so với sử dụng DNA ly trích từ cơ. 5.2 ĐỀ NGHỊ - Thiết lập qui trình ly trích DNA từ lông (nhất là ngọn lông) để được lượng DNA lớn và tinh sạch. - Theo dõi về thời gian và biểu hiện khô của DNA trong quá trình thu hồi DNA sau ly trích. - Áp dụng qui trình PCR xác định giới tính lên phôi bò của ba giống ta Vàng, lai Sind, sữa Hà Lan. 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu tiếng Việt 1. Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003. Ứng dụng kỹ thuật thụ tinh in vitro và dùng pcr xác định giới tính phôi trên heo. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002. Sinh Học Phân Tử (Khái Niệm - Phương Pháp - ứng Dụng). Tái bản lần 2, NXB Giáo Dục, Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr. 122 – tr. 129 và tr. 190 - tr. 197. 3. Phạm Thành Hổ, 2000. Sinh Học Đại Cương. NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr. 274. 4. Nguyễn Thị Thu Lan, 2002. Thiết lập qui trình xác định giới tính heo (sus scrofa domestica) bằng kỹ thuật pcr (polymerase chain reaction). Khóa luận tốt nghiệp cử nhân sinh học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Phan Kim Ngọc và Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000. Sinh Học Của Sự Sinh Sản. Tái bản lần thứ nhất, NXB Giáo Dục. Tr. 50 – tr. 64. 6. Nguyễn Phước Nhuận, Phan Thế Đồng, Lê Thị Phương Hồng, Đỗ Hiếu Liêm, Đinh Ngọc Loan, 2003. Giáo Trình Sinh Hóa Học (Phần I). NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr. 68 – tr. 73. 7. Lê Thị Mỹ Phước, Nguyễn Thị Mỹ Lan, Lê Văn Bình, Bùi Thị Hồng Hạnh, 2002. Hóa Học Phục Vụ Công Nghệ Sinh Học II. Giáo trình thực tập Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr. 36. 8. Lê Thị Thu Phương, 2004. Phát hiện gen halothane, gen thụ thể estrogen và mối liên quan giữa hai gen này đến năng suất sinh sản của heo nái. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. 9. Nguyễn Trọng Tiến, Nguyễn Xuân Trạch, Mai Thị Thơm, Lê Văn Ban, 2001. Giáo Trình Chăn Nuôi Trâu Bò. NXB Nông Nghiệp. Tr. 23 – tr. 30. *Tài liệu nước ngoài 10. AIP Congress, 2002. Semiconducting photoactive biopolymers. AIP Congress, Queensland University, Australia. 20 pages. 43 11. Alves A. C. B., Hossepian de Lima M. F. V., Teixera M. C., Moreira-Filho A. C., 2003. Use of primers derived from a new sequence of the bovine Y chromosome for sexing Bos taurus and Bos indicus embryos. Theriogenology 59: 1415-1419. 12. Bondioli K. R., et al., 1989. The use of male – specific chromosomal DNA fragments to determine the sex of bovine preimplantation embryos. Theriogenology 31: 95-104. 13. Bredbacka P., et al., 1994. Survival of biopsied and sexed bovine demi embryos. Theriogenology 41: 1023-1031. 14. Burgoyne, 1998. The mammalian Y chromosome: a new perspective. BioEssay 20: 363-366. 15. Chen C. M., Hu C. L., Wang C. H., Hung C. M., Wu H. K., Choo K. B., and Cheng W. T. K., 1999. Gender determination in single bovine blastomere by polymerase chain reaction amplification of sex - specific polymorphic fragments in the Amelogenin gene. Molecular reproduction and development 54: 209-214. 16. Chen C. Y., Huang L. S., Cheng J. B., Ding N. S., Zhou L. L., and Xiao H. X., 2004. Establishing and optimizing the system for sex determination of bovine preimplantation embryos. China Journal of Agricultural Biotechnology 1(1): 13-16. 17. Delbrigde L. M. and Marshall Graves A. J., 1999. Mammalian Y chromosome evolution and the male – specific functions of Y chromosome – borne genes. Journal of Reproduction and Fertility 4: 101-109. 18. Eldridge E. F., 1985. Cytogenetics of livestock. Avi publishing company, Wesport, Connecticut, USA. p.115 – p. 122. 19. Frandson D. R., 1969. Anatomy and physiology of farm animals. Lea and Febiger, Philadelphia, USA. Chapter 28, p. 386 – p. 389. 20. Haqq M. C. and Donahoe K. P., 1998. Regulation of sex dimorphism in Mammals. Physiol. Rev. 78: 1-33. 21. Josso N., Rey R. and Gonzalès J., 2003. Sexual differentiation. Ho Chi Minh city, Viet Nam, March 2005. <URL: http://www.endotext.org/pediatrics/pediatrics7/pediatrics7.htm> 22. Kitiyanant Y., Saikhun J., Siriaroonrat B., and Pavasuthipaisit K., 2000. Sex determination by polymerase chain reaction and karyotyping of bovine embryos at first cleavage in vitro. Science Asia 26: 9-13. 23. Page D. C., Mosher R., Simpson E., Fisher E. M. C., Mardon G., Pollack J., Mc Gillivray B., De la chapelle A., and Brown L. G., 1987. The sex determing region of the human Y chromosome encodes a finger protein. Cell 36: 1091-1104. 44 24. Pomp D., Good A. B., Geisert D. R., Corbin J. C., and Conley J. A., 1995. Sex identification in mammals with polymerase chain reaction and its use to examine sex effects on diameter of day-10 or -11 pig embryos. J. Anim., Sci. 73: 1408- 1415. 25. Sambrook Joseph and Russell W. David, 2001. Molecular cloning (A laboratory manual). 3 rd edition, Cold Spring Harbor laboratory press, New York, USA. Vol.2: p. 8.23, Vol.3: p. A8.13. 26. Sauer S., Lechner D., Berlin K., Plancon C., Heuermann A., Lehrach H., and Gut G. I., 2000. Full flexibility genotyping of single nucleotide polymorphisms by the GOOD assay. Nucleic Acids Research Vol.28, No.23. 27. Schoder A., Miller R. J., Thomsen D. P., Roschlau K., Avery B., poulsen H. P., Schmitt M., and Swerin M., 1990. Sex determination of bovine embryos using the polymerase chain reaction. Animal Biotechnology 1(2): 121-133. 28. Takara Bio Inc. CycleavePCR TM Bovine Sexing Kit. Ho Chi Minh city, Viet Nam, June 2005. <URL:http://www.takara-bio.co.jp> 29. Van Vliet A. R., Gibbins V. M. A., and Walton S. J., 1989. Livestock embryo sexing: a review of current methods, with emphasis on Y- Specific DNA probes. Theriogenology 32(3): 421-438. 45 PHỤ LỤC * Hoá chất dùng trong đề tài - Hoá chất ly trích DNA + Đệm ly trích cơ và lông (chỉnh pH đến 8) Tris - HCl 50 mM NaCl 20 mM EDTA (Ethylene diamine tetra - acetic acid) 1 mM SDS (Sodium dodecyl sulfate) 1 % + Proteinase K 20 mg / ml + Sodium acetate 2 M; 0,2 M + Phenol: chloroform: isoamyl alcohol 25:24:1 + Ethanol 100%; 70% + TE 1X (pH = 8) Tris - HCl 10 mM Na 2 EDTA 1 mM - Hoá chất PCR PCR buffer 1 X MgCl 2 1,5 mM Taq polymerase tùy phản ứng dNTP 200 µM / mỗi loại H 2 O cất 2 lần, khử ion, vô trùng, chiếu tia UV 15 phút, pH 6,8 – 7,0 - Hoá chất điện di sản phẩm PCR + Agarose 1,5% + TBE 0,5 X (Tris borate EDTA, pH = 8,3) Tris - base 44,5 mM Acid boric 44,5 mM Na 2 EDTA 1,5 mM + Loading dye 6 X Bromophenol blue 0,25 % Sucrose 40 % 46 TE 1 X vừa đủ 100 % + Ladder TAE 0,5 X (Tris acetate EDTA) 65 % Ladder 100 bp gốc 15 % Loading dye 6 X 20 % + Ethidium bromide 30 µl / 300 ml TBE 0,5 X * Dụng cụ dùng trong đề tài - Pipetman loại 100 - 1000 µl; 10 - 100 µl; 0,5 - 10 µl - Đầu tip tương ứng với các loại pipetman - Eppendorf loại 0,2 ml; 1,5 ml - Các chai lọ đựng hoá chất, vật mẫu - Kéo, kẹp, chày, cối, bao nilông… * Thiết bị được sử dụng trong đề tài - Máy vortex (IKA Works) - Máy ly tâm (Sigma, Hettich) - Máy PCR (Eppendorf) - Bộ điện di (Biorad) - Máy chụp gel (Biorad) - Tủ ấm (Memmert) - Tủ trữ mẫu, hoá chất (Reetech, Brandt, Sanyo) - Microwave (Electrolux) - Cân (explorer- OHAUS) - Tủ sấy (Jencons - PLS) - Water bath (Memmert) - Máy cất nước, khử ion (Barnstead) - Autoclave (Tommy) - Quang phổ kế (Hewlett Packard) - Máy đo pH . ảnh hưởng đến hiệu quả PCR xác định giới tính. - Sử dụng DNA ly trích từ lông trong PCR xác định giới tính cho hiệu quả thấp hơn so với sử dụng DNA ly trích từ cơ. 5. 2 ĐỀ NGHỊ - Thiết lập. qui trình PCR xác định giới tính lên phôi bò của ba giống ta Vàng, lai Sind, sữa Hà Lan. 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu tiếng Việt 1. Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003. Ứng dụng kỹ thuật thụ. ly trích từ ngọn lông. - Qui trình PCR với chu trình nhiệt I (tăng thời gian của phản ứng) và Taq ABgene 1 ,5 UI có thể xác định giới tính thành công trên ba giống ta Vàng, lai Sind và sữa Hà