1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay trong lĩnh vực chăn nuôi, một thành tựu đánh dấu sự tiến bộ vượt bậc của kĩ thuật nuôi cấy tế bào sinh dục là khả năng tạo được hợp tử bên ngoài cơ thể mẹ thông qua sự kết hợp tinh trùng và noãn trong điều kiện in vitro. Ở động vật, nguồn phôi dồi dào có thể phục vụ cho các mục đích khác nhau như: tạo động vật chuyển gen, khai thác nguồn tế bào mầm, nhân bản động vật, tạo đàn thú có điều kiện thí nghiệm tương đương nhau phục vụ nghiên cứu khoa học… Nhưng dù với mục đích gì, cũng cần phải qua khâu tạo nguồn noãn chín đồng loạt. Đó là bước căn bản trong thao tác liên quan đến khoa học về sinh sản. Ngày 24/04/2005, các nhà khoa học của đại học quốc gia Seoul đã thành công khi cho sinh sản vô tính một giống chó săn Afganistan (trích báo tuổi trẻ số ra ngày 05/08/2005). Trên thế giới, công nghệ sinh học trong lĩnh vực sinh sản nói chung và việc tạo noãn chín in vitro nói riêng rất phổ biến, nhưng ở Việt Nam vẫn còn rất hạn hẹp. Noãn heo là nguồn noãn dồi dào và có thể giúp hoàn thiện thao tác lấy noãn và nuôi noãn. Trên chó có một số giống quý hiếm nhưng chu kỳ sinh sản của chúng rất dài và tỉ lệ nuôi thành công rất thấp, do đó chọn nuôi trứng trên chó rất có ý nghĩa. Vì những lý do trên, đề tài “Áp dụng qui trình nuôi chín noãn in vitro trên heo và chó” được tiến hành. 1.2. Mục tiêu và yêu cầu Mục tiêu Góp phần xây dựng hệ thống qui trình nuôi cấy phôi trong điều kiện Việt Nam. Yêu cầu Phân loại nang noãn trên buồng trứng heo và chó. Áp dụng phương pháp nuôi chín noãn heo và chó. Áp dụng phương pháp nhuộm nhiễm sắc thể và thể cực của noãn chín. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Buồng trứng 2.1.1. Cấu tạo [1] Buồng trứng phát triển từ miền vỏ của tuyến sinh dục, gồm một đôi được treo ở cạnh trước dây chằng rộng và nằm trong xoang chậu. Bên ngoài là lớp màng liên kết sợi chắc như màng bao dịch hoàn. Bên trong buồng trứng chia làm hai miền: miền vỏ và miền tủy, hai miền được cấu tạo bằng lớp mô liên kết sợi xốp, tạo một chất đệm cho buồng trứng. Miền tủy có mạch máu nhiều hơn và lớp mô liên kết cũng dày hơn. Miền vỏ là nơi xảy ra sự chín noãn và rụng noãn. Bên dưới lớp màng là noãn nguyên thủy. Khi nang noãn chín, tế bào nang bao quanh noãn phân chia thành nhiều tầng tế bào hạt. Nang noãn càng phát triển thì tế bào nang phân hủy tạo ra một xoang chứa dịch. Khi trở nên chín, nang noãn được bao bọc bởi một lớp màng mỏng. Tổ chức liên kết ngoài buồng trứng lúc này dày lên để bảo vệ nang noãn chín, giữa màng liên kết và màng nang noãn là tổ chức mạch quản dày đặc. Lúc nang noãn đã thành thục thì màng bọc nang và màng bao liên kết của buồng trứng tách ra, noãn rời buồng trứng cùng với dịch nang để đi vào vòi Fallop. Màng nang noãn rách rồi liền lại ngay, các tế bào hạt trong xoang phân chia nhanh thành một khối tế bào lớn để lấp kín xoang nang noãn và trở thành thể vàng. 2.1.2. Chức năng nội tiết của buồng trứng [1], [2] Hormon được tiết ra từ nang noãn và thể vàng. Hormon từ nang noãn là estrogen, từ thể vàng là progesteron. Hàm lượng hormon liên quan đến các giai đoạn trong chu kì động dục. Hàm lượng progesteron trong thể vàng tăng sau xuất noãn và thấp khi thoái triển. Có relaxin trong pha thể vàng của chu kì nhưng pha nang noãn thì không có relaxin. Relaxin cũng không xuất hiện trong buồng trứng heo cái tơ. Nang noãn thành thục thì tế bào hạt trong biểu mô tiết ra nhiều estrogen. Estrogen làm gia súc biểu hiện động dục. Estrogen gồm estradiol và sản phẩm hóa học của nó là estrol và estriol. Estrogen liên quan đến đặc tính sinh dục thứ 3 cấp của gia súc cái, làm âm đạo tiết nhiều dịch nhầy, sừng tử cung và ống dẫn trứng được tăng cường dòng máu, tuyến vú phát triển, vỏ não hưng phấn. Hình 2.1: (a) Estradiol (b) Estriol Sau khi xuất noãn, nguyên sinh chất bên trong nang noãn tích tụ sắc tố thể vàng. Thể vàng tiết hormon progesteron. Progesteron vào máu, ức chế phân tiết gonadotropin từ tuyến yên và ức chế sự chín của nang noãn, kích thích sự hoạt động của niêm mạc tử cung để trứng được thụ tinh về nơi làm tổ và phát triển, ức chế co bóp của tử cung, giảm hormon thùy sau của tuyến yên trong thời gian gia súc có chửa và thúc đẩy tuyến vú phát triển. Hình 2.2: Progesteron 2.1.3. Buồng trứng heo và chó 2.1.3.1. Buồng trứng heo [6] Buồng trứng heo hình chùm dâu, có màu hồng vân, nằm hai bên hốc bụng. Trọng lượng buồng trứng tăng từ ngày thứ 3 đến ngày 12 sau động dục vì thể vàng phát triển. Đường kính thể vàng đạt tối đa 11 mm vào ngày 15 và giảm dần do thoái hóa. Màu và cấu trúc thể vàng thay đổi theo thời gian. Thể vàng có màu đỏ sậm vào ngày thứ 3, tím tái vào ngày 15 và màu kem hơi vàng và trắng dần vào ngày 15 – 18. Ngày thứ 3 có cục máu đỏ sậm ở giữa thể vàng, ngày thứ 6 cục máu được thay thế bởi mô liên kết hoặc bởi dịch hơi vàng, đến ngày 16 – 18 có nhiều mạch máu. Lúc bắt đầu động dục của chu kỳ tiếp theo thể vàng thoái hóa, đường kính của thể vàng chỉ còn 50 % và mất đi vào ngày 40. Số nang tối đa là 2.700.000, số nang lúc sinh 135.000, số nang mất trong quá trình phát triển là 95 %. Kích thước nang xoang là 8 – 10 mm, kích thước nang noãn thành thục là 8 – 12 mm. 4 2.1.3.2. Buồng trứng chó [6] Buồng trứng được bao bởi một túi. Khi lột bỏ túi, kích thước của buồng trứng là 1,7  0,9  0,4 cm ở chó beagle. Buồng trứng chó già tương tự như bề mặt bông cải, có kẽ hở sâu để phân chia các thùy với kích cỡ khác nhau. Khi ấy buồng trứng chứa các nang noãn tịt, mô liên kết dày đặc, vết sẹo của thể vàng, thành phần của sườn gian bào vùng tủy. Tế bào biểu mô mầm trở nên hình trụ giả với mảng lồi giống như tiêm mao. Ở chó không mang thai thể vàng thoái hóa vào ngày 20 sau động dục. Chó cái có khoảng 700.000 nang noãn lúc mới sinh, còn 350.000 lúc thành thục, trong số này khoảng 1200 – 1300 nang xoang. Khả năng thụ tinh không giảm đến khi chó được 5 tuổi. 2.2. Nang noãn 2.2.1. Đặc điểm hình thái [1] Noãn là tế bào lớn nhất cơ thể, có dạng hình cầu. Thể tích tế bào trứng lớn hơn tinh trùng nhiều lần và dài gấp 2 lần. Cấu tạo noãn gồm 3 phần:  Phần nguyên sinh chất gồm các thành phần chủ yếu là nước, vật chất hữu cơ, muối khoáng và vật chất khác.  Nhân gồm lưới nhiễm sắc thể và nhiều hạt.  Màng bao gồm 3 lớp: lớp ngoài, lớp giữa và lớp trong. Màng ngoài gồm nhiều tế bào hình nang hay hình chóp. Những tế bào này được phân bổ khắp noãn nên còn gọi là màng phóng xạ hay màng tia. Các tế bào này được gắn với nhau bởi acid hyaluronic. Khi tinh trùng gặp trứng, men hyaluronidase ở phần acrosom được tiết ra để phân giải acid hyaluronic làm màng phóng xạ tan ra và tạo điều kiện thụ tinh. Màng giữa gồm nhiều tế bào, được sinh ra từ tế bào nang, là lớp nuôi dưỡng noãn. Màng giữa gọi là màng trong suốt. Màng này đảm bảo dinh dưỡng cho noãn trong buồng trứng. Trong màng chứa enzym zonalizin – men đặc hiệu chủng loài có tác dụng ngăn ngừa tinh trùng khác loài đi vào nhân noãn trong quá trình thụ tinh. Màng trong là lớp màng mỏng bao quanh phần nguyên sinh chất gọi là màng noãn hoàng hay màng nguyên sinh chất. Màng này có tác dụng nuôi 5 dưỡng noãn đã thụ tinh. Giữa màng trong suốt và màng noãn hoàng có khoảng trống dày 14 – 25 µm, pH 3 – 5, chứa dịch có nồng độ ion cao. 2.2.2. Các giai đoạn phát triển của nang noãn và noãn Quá trình hình thành nang noãn xảy ra ở lớp vỏ buồng trứng, từ những nang noãn nguyên thủy phân bố ở vùng ngoại biên. Ở thời kì sau thai, nang noãn không ngừng được hình thành và phát triển từ biểu mô phôi thai. Quá trình hình thành noãn gồm 7 bước: sinh tế bào mầm nguyên thủy (PGC – primordial germ cells); di chuyển PGC tới tuyến sinh dục; định vị PGC trong tuyến sinh dục; biệt hóa PGC thành noãn nguyên bào; tăng số lượng noãn nguyên bào; bắt đầu giảm phân; dừng ở giai đoạn nhân đôi prophase I [26]. Từ PGC trở thành nang noãn được bọc bằng tế bào dẹt, nó biến thành nang quá độ. Song song với quá trình giảm phân, nang quá độ nổi lên từ vùng vỏ và chứa một noãn được bao quanh bởi một lớp tế bào sinh dưỡng, gọi là tiền tế bào hạt. Tế bào sinh dưỡng miền vỏ có nguồn gốc từ tế bào biểu mô bề mặt di chuyển ngược vào buồng trứng và tế bào hạt có nguồn gốc từ tế bào trung thận di chuyển xuyên qua buồng trứng (Sawyer và cs, 2002) [29]. Ở cừu, noãn quá độ có đường kính 25 – 53 µm, noãn đang biệt hóa là 17 – 22 µm và noãn nguyên bào 13 – 17 µm, điều đó chứng tỏ tế bào mầm tăng trưởng trước, trong và sau quá trình tạo nang noãn (Mc Natty và cs, 2000) [20]. Từ nang quá độ phát triển thành nang bậc một. Nang bậc một chỉ chứa một lớp tế bào hạt bao quanh, giai đoạn chuyển thành nang bậc một chậm hơn so với quá trình tăng trưởng của nang. Từ nang bậc một phát triển thành nang bậc hai, có từ 2 lớp tế bào hạt trở lên. Khi noãn tăng trưởng, tế bào hạt tăng sinh dày, lớp tế bào vỏ hình thành xung quanh tế bào hạt. Giai đoạn này tăng RNA, protein, ribosom, ti thể và một số chất hữu cơ khác. Từ nang bậc hai tạo nang xoang, chứa nhiều dịch và nhiều tế bào hạt bao quanh. Dịch có vai trò điều hòa các chất từ máu hoặc chất tiết trong tế bào nang như: gonadotropin, steroid, yếu tố tăng trưởng, enzym, proteoglycan, lipoprotein. Dịch tăng lên nhờ sự phát triển mao quản và dòng máu vận chuyển trong nang. Noãn lúc này được bọc bởi tế bào hạt tụ (cumulus), tạo phức hợp COC (cumulus oocyte complex). 6 Sau quá trình tăng trưởng, noãn tồn tại ở giai đoạn tiền kỳ. Sau đỉnh LH, để hoàn thành giảm phân, các noãn đã tăng trưởng đầy đủ này xuất hiện màng trong suốt tạo cầu nối giữa noãn và tế bào hạt tụ. Quá trình trưởng thành là khoảng thời gian sau đỉnh LH và xuất noãn. Quá trình này có hai biến đổi lớn: trưởng thành nhân và trưởng thành tế bào chất [3]. Trưởng thành nhân là thuật ngữ chỉ sự phục hồi quá trình phân bào giảm nhiễm và những chuyển biến đến giai đoạn MII (metaphase II). Trưởng thành tế bào chất là thuật ngữ liên quan đến các sự kiện khác: sự chuẩn bị cho trứng thụ tinh và phát triển trước làm tổ, định vị lại các tiểu thể của bào tương và các tế bào hạt. Trưởng thành nhân kéo dài 44 giờ trên heo, gồm 2 quá trình phân chia liên tục ở thời kì MI và MII, sau đó noãn dừng lại tại MII chờ thụ tinh. Ở giai đoạn này, noãn đáp ứng đỉnh LH tạo nhiều hormon steroid từ tế bào hạt, tạo nhiều hyaluronan từ tế bào hạt tụ, tiết dịch nhầy và tăng kích thước của tế bào hạt tụ. Hình 2.3 : Các giai đoạn phát triển của nang noãn [37] 2.2.3. Biến đổi đại thể của nang noãn 2.2.3.1. Nang noãn heo [6] Đường kính trung bình của nang noãn lớn tăng dần đến ngày thứ 18 của chu kì, đạt tối đa 9 mm. Nang noãn lớn có thể được thấy vào 18 giờ sau khi bắt đầu động dục nhưng sau đó sự thay đổi kích thước lại biến động. Kích thước của nang chưa đủ đánh giá vì đường kính nang khá biến động lúc xuất noãn. Nang noãn bậc 3 Nang bậc hai Nang bậc hai Nang bậc ba 7 Màu của nang noãn trưởng thành là màu hồng vỏ sò, do mạng mạch máu nằm dưới bề mặt nang noãn. Vùng trong suốt của đỉnh nang noãn là nơi xuất noãn. Khi xuất noãn, thành nang noãn vỡ và dịch hơi đỏ xuất hiện ở bề mặt nang noãn. Điểm vỡ vẫn có thể thấy được vào ngày 12 sau động dục. Động mạch xung huyết và tràn máu vào nang noãn dẫn tới noãn xuất huyết, hiện tượng này thường xuất hiện trên heo. Khi xuất noãn, nang nhuộm đỏ và đứt mạch máu, thành nang xẹp xuống và xuất hiện dịch đỏ trên bề mặt. Khoảng 2 – 3 ngày trước động dục, nang noãn lớn nhanh, lúc này có sự triển dưỡng của lớp màng bao trong của nang noãn và hòa tan một phần tế bào hạt tụ nên noãn ở trạng thái tự do lơ lửng. Noãn tự trải qua giai đoạn giảm nhiễm đầu tiên, nhân di chuyển về phía ngoại vi của tế bào và thể cực thứ nhất được tạo ra. Lúc xuất noãn, thể cực thứ nhất được đẩy ra và trục của thể cực thứ nhì được tạo nên. 2.2.3.2. Nang noãn chó [6] Nang noãn bậc một có một lớp tế bào hình lập phương còn nang noãn bậc hai gia tăng kích thước do tăng tế bào hạt và tạo xoang nang. Thông thường nang noãn bậc hai có 2 noãn hoặc nhiều hơn. Nhiều báo cáo cho thấy nang noãn đa noãn có 11 noãn, thông thường là 3 – 5 noãn. Kích thước nang noãn gia tăng vào giai đoạn tiền động dục nên giai đoạn này được xem là giai đoạn nang noãn trưởng thành. Vì phần lớn nang noãn nhỏ thoái hóa, chỉ có một số nang noãn có kích thước > 2 mm. Những nang noãn 3 – 4 mm có khoảng 8 – 10 lớp tế bào hạt, lớp màng bao trong tăng mạch quản và mô liên kết. Nang noãn 4 – 6 mm hơi phồng lên trên bề mặt buồng trứng. Một đặc tính thống nhất của nang noãn trưởng thành ở chó là nếp gấp sâu của lớp tế bào hạt, trong đó có cuộn mao quản ăn sâu vào lớp màng bao trong và chuẩn bị tạo chất vàng. Vào đầu giai đoạn động dục, nhiều nang noãn xuất noãn. Lúc thú bắt đầu chịu đực, thể cực thứ nhất chưa được tạo. Noãn được phóng thích qua lỗ nhỏ như lỗ đinh kim mà không có hiện tượng vỡ bao noãn. Noãn được phóng thích có kính thước khoảng 77  99 μm, nếu kể cả vùng trong suốt thì khoảng 95  110 μm, chứa những hạt có tính khúc xạ cao và nhiều hạt mỡ. 8 2.2.4. Nội tiết của nang noãn Sự tăng trưởng, thành thục, xuất noãn và thể vàng hóa của nang phụ thuộc vào nhiều yếu tố: kiểu chế tiết thích hợp, hàm lượng đủ và tỉ lệ phù hợp của FSH (follicle stimulating hormone) và LH (luteinizing hormone) trong huyết thanh. FSH giữ vai trò chủ đạo cho việc khởi đầu sự hình thành xoang nang, kích thích quá trình nguyên phân của tế bào hạt và quá trình hình thành dịch nang. Ngoài ra, FSH tăng khả năng cảm ứng của tế bào hạt đối với LH bằng cách tăng số lượng các thụ thể LH. Ở heo, các thụ thể LH tăng từ 300 (trong các nang bé) và lên 10.000 (trong các nang lớn trước xuất noãn). Tăng LH chuẩn bị cho quá trình thể vàng hóa của tế bào hạt. Trong giai đoạn tạo nang bậc hai, sự tăng kích thước, tăng số tế bào hạt và số nang noãn tịt bị ảnh hưởng bởi lượng kích dục tố. FSH kích thích tạo cầu nối ở tế bào hạt. LH quan trọng hơn FSH trong phát triển nang bậc hai vì qua thụ thể LH ở tế bào bao nang, khởi động sinh tổng hợp androgen để kích thích tạo thụ thể FSH ở tế bào hạt, do đó tăng ảnh hưởng FSH lên nang bậc hai [34]. Ở giai đoạn này, người ta cũng phát hiện GH (growth hormone) làm tăng sự phát triển in vitro của nang bậc hai trên chuột (Liu và cs, 1998) [14]. Trong giai đoạn tạo nang xoang, nang xoang giai đoạn sớm có thụ thể FSH ở tế bào hạt nhưng chưa phụ thuộc vào kích dục tố. Ở giai đoạn này tế bào bao nang tăng tiết steroid, trong khi tế bào hạt mất aromatase (loại enzyme biến đổi androgen thành estrogen). Điều này chứng tỏ rằng progesteron và androgen mà không phải estrogen là những hormon steroid được tạo bởi nang xoang giai đoạn sớm. Trong nang xoang giai đoạn sau, có hiện tượng giảm FSH, nang noãn tiết nhiều estradiol và inhibin và có khả năng xuất noãn. Những nang còn lại phát triển bất thường và trở thành nang tịt. Trong giai đoạn nang noãn trưởng thành, tuyến yên tiết LH tối đa và nang có khả năng xuất noãn. 9 Hình 2.4: Nội tiết nang [36] 2.2.5. Sự trƣởng thành của noãn 2.2.5.1. Quá trình trƣởng thành Trên heo, noãn nguyên bào bắt đầu giảm phân tạo noãn bậc hai, noãn bậc hai tiếp tục phát triển đến giai đoạn nhân đôi nhiễm sắc thể và dừng lại đến khi thú cái thành thục về tính. Khi heo cái xuất noãn, noãn tiếp tục phát triển đến MII và chờ thụ tinh. Trên chó, noãn rụng trước khi tạo thể cực thứ nhất. Sự tạo thể cực thứ nhất hoàn tất khoảng 48 – 60 giờ sau khi xuất noãn. Nếu được thụ tinh, noãn sẽ hoàn thành giảm phân và phát triển phôi. Quá trình noãn phát triển đến metaphase gọi là quá trình trưởng thành. Gồm 4 sự kiện xảy ra theo thứ tự như sau: nhiễm sắc thể (NST) cô đặc, nhân con biến mất, vỡ màng nhân, hình thành trục. (1) Cô đặc NST Đây là bước đầu tiên và quan trọng để phân phối đúng số NST vào noãn và thể cực. Hirano và cs (1994) phát hiện một protein gọi là condensin liên quan đến sự cô đặc NST [11]. Condensin làm tăng cấu trúc siêu xoắn của DNA. Sutani và cs (1999) khẳng định rằng condensin được phosphoryl hóa và được hoạt hóa bởi MPF (maturation promoting factor) [32]. Tuy nhiên, theo Hong Thuy Bui và cs (2004), giai đoạn này không liên quan đến MPF mà liên quan đến histon H3 (Ser 10) kinase [12]. Như ta biết, đơn vị cơ bản của NST là nucleosome tức một đoạn DNA khoảng 200 bp bao quanh protein histon; histon gồm 2 trong số 4 phân tử H2A, H2B, H3, H4. Đầu N của histon H3 liên quan đến khả năng giữ ổn định sợi NST, bị phosphoryl hóa ở vị trí serine 10, Pha nang noãn . hệ thống qui trình nuôi cấy phôi trong điều kiện Việt Nam. Yêu cầu Phân loại nang noãn trên buồng trứng heo và chó. Áp dụng phương pháp nuôi chín noãn heo và chó. Áp dụng phương pháp nhuộm. thấp, do đó chọn nuôi trứng trên chó rất có ý nghĩa. Vì những lý do trên, đề tài Áp dụng qui trình nuôi chín noãn in vitro trên heo và chó được tiến hành. 1. 2. Mục tiêu và yêu cầu Mục. hạn hẹp. Noãn heo là nguồn noãn dồi dào và có thể giúp hoàn thiện thao tác lấy noãn và nuôi noãn. Trên chó có một số giống quý hiếm nhưng chu kỳ sinh sản của chúng rất dài và tỉ lệ nuôi thành