28 3.4.9.2. Qui trình nhuộm 3.5. Các chỉ tiêu theo dõi 3.5.1. Trên heo Số lượng hoàng thể, nang noãn thu hoạch được trên một buồng trứng Phân loại chất lượng noãn theo phương pháp thu hoạch noãn Phân loại chất lượng noãn theo đường kính nang 3.5.2. Trên chó Số lượng hoàng thể, nang noãn thu hoạch được trên một buồng trứng Phân loạichất lượng noãn theo chiều dài buồng trứng Phân loại chất lượng noãn theo đường kính nang Tỉ lệ nang đa noãn trong một buồng trứng So sánh chất lượng noãn chó trong nang đơn noãn và nang đa noãn Ngâm trong acetol trong 15 phút Rửa noãn 3 lần trong PBS-PVA để rửa trôi môi trường nuôi cấy Chuyển noãn qua lame với một ít PBS-PVA. Đậy lamel lên thật nhẹ Ngâm trong dung dịch ethanol: acetic acid tỉ lệ 3:1 trong 48 giờ Acetol được thay bằng acetol orcein màu tím trong 10 phút. Lặp lại 3 lần Acetol orcein được thay bằng acetol glycerol đến khi màu tím được thay bằng màu trắng thì ngừng lại Cố định bằng keo dán. Xem dưới kính hiển vi Rửa noãn 3 lần trong PBS-PVA để rửa trôi môi trường nuôi cấy 29 3.5.3. Kết quả IVM Tỉ lệ thành công sau khi nuôi noãn chó lấy từ nang noãn nhỏ và lớn 3.6. Xử lý thống kê Dùng phần mềm thống kê Stagraphics 7.0 30 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát buồng trứng heo 4.1.1. Trung bình số nang noãn thu hoạch trên một buồng trứng Bảng 4.1: Số lƣợng nang noãn thu hoạch trên một buồng trứng heo Số buồng trứng Nang nhỏ (< 4 mm) Nang trung bình (4 – 6 mm) Nang lớn (> 6 mm) Tổng số nang noãn X SD X SD X SD X SD 81 15,42 9,69 6,56 4,17 0,84 1,4 22,82 15,26 Đối với giống heo ngoại nuôi thịt được khảo sát, không thấy hoàng thể, số nang nhỏ thu được nhiều nhất, nang loại lớn thu được ít nhất. Mẫu buồng trứng được lấy ở lò mổ, chủ yếu là heo thịt 4 – 5 tháng tuổi nên heo chưa tới giai đoạn động dục. Tổng số nang noãn thu được trên một buồng trứng là 22,82, tương đương với số nang noãn thu được trên một buồng trứng bò khoảng 20 nang noãn (theo Trần Đình Lý – tài liệu không công bố). Mặc dù số nang noãn trong một buồng trứng rất nhiều, số nang tối đa là 2.700.000 (Cole and Cupps, 1959) [6], nhưng số noãn lấy được rất ít so với tổng số vì chỉ lấy được nang quan sát bằng mắt thường. 4.1.2. Đánh giá noãn heo theo phƣơng pháp thu hoạch noãn Phân chia tổng số buồng trứng thành hai phần với số lượng như nhau. Mỗi phần thực hiện hai phương pháp hút và xé. Thu và đánh giá chất lượng noãn ở mỗi phần. Bảng 4.2: Phân loại chất lƣợng noãn heo theo phƣơng pháp thu hoạch noãn Chất lượng Phương pháp Loại A Loại B Loại C Tổng số noãn n % n % n % Xé Hút 41 44 49 47 29 35 35 38 14 14 16 15 84 93 p 0,49 0,56 0,71 Chất lượng noãn thu được ở hai phương pháp xé và hút không khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê. Thu noãn bằng phương pháp hút tốn ít thời gian và công sức hơn, do đó thu trứng bằng phương pháp hút tốt hơn phương pháp xé. Tuy nhiên theo Nguyễn Văn Thuận (tài liệu không công bố) lại cho rằng, thu trứng bằng phương pháp 31 xé tốt hơn hút, vì bảo đảm lực liên kết giữa noãn và tế bào hạt. Nếu dùng phương pháp hút, do áp lực hút làm giảm lực liên kết giữa noãn và tế bào hạt, nên mặc dù cũng được đánh giá loại A, nhưng những noãn này khi nuôi sẽ đạt tỉ lệ giảm phân thấp hơn. Theo Takashi (1997), noãn heo lấy bằng phương pháp hút tỉ lệ đạt GV1 (45 %) và GV4 (0 %) thấp hơn so với phương pháp xé GV1 (78 %) và GV4 (11 %) [33]. 4.1.3. Đánh giá noãn heo theo đƣờng kính nang Thu nang noãn theo từng mức đường kính nang, lấy noãn và đánh giá chất lượng noãn. Bảng 4.3: Phân loại chất lƣợng noãn heo theo đƣờng kính nang Chất lượng Đường kính Loại A Loại B Loại C Tổng số nang noãn n % n % n % Nhỏ (< 4 mm) Trung bình (4 – 6 mm) Lớn (> 6 mm) 37 50 3 41 62 41 39 22 3 43 28 38 14 8 1 16 10 21 90 80 7 p 0,0007 0,04 0,18 Chất lượng noãn thu được theo từng mức đường kính nang có sự khác biệt về mặt thống kê. Ở đường kính nang trung bình, tỉ lệ loại A thu được nhiều nhất, ở đường kính lớn loại A thu được ít nhất. Theo quan sát, mặc dù cũng được đánh giá loại A, nhưng số noãn loại A ở kích thước lớn có nhiều lớp tế bào hạt tụ hơn loại A ở kích thước nang nhỏ hơn. Nang kích thước lớn có tỉ lệ loại A tuy ít nhưng chất lượng tốt, những noãn này khi nuôi in vitro sẽ đạt tỉ lệ giảm phân cao. Phù hợp với kết quả nghiên cứu của Mao và cộng sự (2003), tỉ lệ thành công IVM trên noãn heo ở nang có kích thước 5,1 – 7 mm (33,4 %) cao hơn nang 3,1 – 5 mm (26,3 %) [17]. Ở nang nhỏ, tỉ lệ noãn loại B cao nhất, chứng tỏ chất lượng noãn thu được xấu. Nang có đường kính < 4 mm thì tương đương với nang bậc một hoặc bậc hai, noãn liên kết chặt với vỏ nang, nên nếu lấy noãn thì cần lực mạnh, có thể lực này tác động đến tế bào hạt tụ quanh noãn. Nhìn chung, ở nang trung bình và lớn, tỉ lệ noãn loại A thu được nhiều hơn loại B và C. Do đó, khi thu noãn nên thu ở kích thước này. 32 4.2. Khảo sát buồng trứng chó 4.2.1. Trung bình số hoàng thể, nang noãn thu hoạch đƣợc Bảng 4.4: Số lƣợng hoàng thể, nang noãn thu hoạch trên một buồng trứng chó Số buồng trứng Hoàng thể Nang noãn Loại nhỏ (< 2 mm) Loại lớn (> 2 mm) Tổng cộng 111 X SD X SD X SD X SD 2,68 3,1 2,22 3,5 0,56 1,56 2,78 5,1 Buồng trứng chó có nhiều hoàng thể hơn nang noãn, số nang noãn nhỏ rất nhiều hơn nang noãn lớn. Chó có thời kỳ không động dục rất dài, khi ấy nang không nổi lên bề mặt buồng trứng. Thời gian lấy buồng trứng vào tháng 5 đến tháng 7, nên có thể vào thời kỳ không động dục của chó. Do đó số nang lớn rất ít. Hơn nữa, chó ở lò mổ có lẽ là chó già, nên có nhiều hoàng thể. 4.2.2. Đánh giá noãn chó theo chiều dài buồng trứng Phân chia số buồng trứng làm hai lô theo chiều dài buồng trứng (< 2 cm và ≥ 2 cm). Thu noãn và đánh giá chất lượng noãn ở mỗi lô. Bảng 4.5: Phân loại chất lƣợng noãn chó theo chiều dài buồng trứng Chất lượng Chiều dài buồng trứng Số buồng trứng Số noãn Loại A Loại B n % n % Nhỏ (< 2 cm) Lớn (≥ 2 cm) 26 28 57 16 45 13 79 80 12 3 21 20 p 0,97 0,14 Noãn thu được trên chó có chất lượng tốt. Không có noãn loại C. Chất lượng trứng thu được ở kích thước buồng trứng khác nhau thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. 33 4.2.3. Đánh giá noãn chó theo đƣờng kính nang Thu nang noãn chó và phân làm hai lô theo đường kính nang noãn (< 2 mm và ≥ 2 mm). Thu hoạch noãn và đánh giá chất lượng noãn. Bảng 4.6: Phân loại chất lƣợng noãn chó theo đƣờng kính nang Chất lượng Đường kính nang Số buồng trứng Số lượng noãn Loại A Loại B n % n % Nhỏ (< 2 mm) Lớn (≥ 2 mm) 35 19 77 11 62 9 81 78 15 2 19 22 p 0,73 0,73 Chất lượng noãn thu được ở đường kính nang khác nhau thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Số noãn loại A thu được nhiều hơn rất nhiều so với loại B. Trên noãn chó có một đặc điểm khác noãn heo; đó là noãn chó chứa hàm lượng lipid lớn nên nội chất có vẻ như đen và đồng nhất [28]. Do đó, trong nhiều trường hợp noãn được đánh giá loại A và B nhưng có thể không tốt lắm, nang có đường kính nhỏ chất lượng noãn có lẽ xấu hơn, do kích thước nhỏ nên lấy sẽ khó, noãn bị tác động bởi lực khi lấy và dụng cụ thao tác nhiều làm ảnh hưởng đến lớp tế bào hạt tụ. 4.2.4. Tỉ lệ nang đa noãn trong buồng trứng chó Tỉ lệ nang đa noãn trong một buồng trứng là 37,7 %. Một buồng trứng thu được trung bình 2,78 nang, nên số nang đa noãn trung bình trong một buồng trứng là 1,04. Vì không phải trong chu kỳ động dục của chó, số nang nổi trên bề mặt buồng trứng ít, nên số nang đa noãn thu được ít. Nang đa noãn thu được chủ yếu có 2 noãn, điều này khác với kết quả nghiên cứu của Cole và Cupps (1959). Theo các tác giả, nang đa noãn trung bình có khoảng 3 – 5 noãn, có nang lên đến 11 noãn [6]. Điều này có thể do giống chó khác nhau nên số lượng noãn trong nang đa noãn khác nhau, Cole và Cupps (1959) khảo sát trên giống chó săn thả, chúng tôi khảo sát trên giống chó ta. 34 4.2.5. So sánh chất lƣợng noãn chó trong nang đơn noãn và nang đa noãn Bảng 4.7: Phân loại chất lƣợng noãn chó trên nang đơn noãn và đa noãn Chất lượng Loại nang Số buồng trứng Số lượng noãn Loại A Loại B n % n % Đơn noãn Đa noãn 21 21 36 22 31 18 87 82 5 4 13 18 p 0,52 0,61 Chất lượng trứng thu được ở nang đơn noãn và nang đa noãn không có sự khác biệt về mặt thống kê. Tỉ lệ noãn loại A ở nang đơn noãn và đa noãn cao hơn loại B rất nhiều. 4.3. Kết quả về IVM Do kết quả nuôi noãn heo chưa thành công nên chỉ trình bày kết quả trên chó. 4.3.1. Trên chó Số đợt thí nghiệm nuôi noãn chín là 22 đợt, trong đó có 9 đợt trên nang lớn (đường kính nang > 2 mm) và 13 đợt trên nang nhỏ (đường kính nang < 2 mm). Có 3 đợt thành công, 2 đợt thành công trên nang noãn lớn và 1 đợt thành công trên nang noãn nhỏ. Trên noãn nhỏ, được 4 noãn chín trong 54 noãn được nuôi, đạt tỉ lệ 7 %. Trên noãn lớn, 1 noãn chín trong 6 noãn được nuôi, đạt tỉ lệ 17 %. Tỉ lệ thành công khá thấp, thấp hơn so với báo cáo của Rodgigues (2003), các tác giả đạt tỉ lệ 16,4 % khi nuôi noãn chó ở giai đoạn nghỉ ngơi với cùng thành phần môi trường của chúng tôi [27]. Tỉ lệ thành công ở nang lớn cao hơn nang nhỏ, số lượng noãn thu được ít nên không đưa ra kết luận chính xác. Tuy nhiên, điều này phù hợp với kết quả của Songsasen (2004), noãn chó đạt giảm phân 14,2 % ở nang có đường kính < 0,5 mm và 30,9 % ở nang có đường kính > 2 mm [30]. Mỗi đợt thí nghiệm, bình quân số nang được thu noãn là 16,1 nang nhỏ và 0,45 nang lớn. Trên nang nhỏ, loại noãn tốt đạt 73 % và loại noãn xấu đạt 27 %. Trên nang lớn, loại noãn tốt đạt 96 % và loại noãn xấu đạt 4 %. Noãn được nuôi đều là noãn loại A, không có sự khác biệt giữa chất lượng noãn trước khi nuôi và đường kính nang, nhưng có sự khác biệt giữa chất lượng noãn sau khi nuôi với đường kính nang, điều này phù hợp với dự đoán của chúng tôi (Mục 4.2.3. trang 33). 35 4.3.2. Kinh nghiệm trong IVM Khi pha môi trường nuôi trứng chín, môi trường căn bản là TCM 199. Trước hết pha môi trường TCM 199 với nước cất hai lần khử ion, sau đó dùng môi trường này pha các chất còn lại, mỗi chất được pha riêng, chia ra từng eppendof nhỏ cho mỗi lần dùng, trữ ở nhiệt độ thích hợp. Khi lấy noãn, nên lấy ở giai đoạn noãn còn liên kết với tế bào hạt, nếu noãn ở trạng thái tự do lơ lửng trong xoang nang thì không nên lấy. Noãn được nối với nang qua một cầu nối gồm những tế bào hạt nằm dưới vỏ nang, đính vào lớp vành tia của noãn. Cầu nối này có khả năng cho những ion và trương lực điện đi qua giữa các tế bào nang với noãn ở thời kì trước xuất noãn. Quan sát in vitro nhận thấy noãn không thể tăng trưởng nếu thiếu cầu nối này. Do đó, khi thao tác, ta nên chọn nang trong suốt, màu vàng, không nên chọn nang màu hồng vì nang màu hồng có lượng máu chảy theo mạch vào nang tăng, nang chuẩn bị xuất noãn, lúc này noãn ở trạng thái tự do lơ lửng. (a) Nang không lấy (b) Nang nên lấy Hình 4.1: Nang nên lấy và không nên lấy Khi lấy nang noãn chó, không thể dùng phương pháp hút như trên heo. Vì giai đoạn yên tĩnh và không động dục trên chó cái kéo dài, kích thước nang quá nhỏ, không nhìn thấy trên bề mặt buồng trứng trong giai đoạn này. Có thể dùng phương pháp cắt với loại có mũi kéo nhỏ và mỏng. Nếu dùng dao như trên heo, có thể gây vỡ noãn. Khi thực hiện thao tác xé noãn, nên lột sạch lớp vỏ bao ngoài nang, sau đó xem dưới kính hiển vi vị trí noãn, hai tay cầm kẹp xoay nang và cố định nang ở đầu đối diện vị trí noãn. Sau đó kẹp vỏ nang xé và lộn ngược mặt trong vỏ nang ra ngoài. Noãn sẽ nổi lên trên bề mặt lớp vỏ trong đã được lộn ngược. Dùng kẹp vuốt nhẹ và lấy noãn. Tạo môi trường giọt nuôi noãn chó, vì giọt 100 µl sẽ dễ bị loang ra đĩa, nên đầu tiên tạo giọt khoảng 50 µl, phủ dầu khoáng, sau đó thêm 50 µl còn lại. 36 4.4. Kinh nghiệm trong nhuộm nhiễm sắc thể Khi chuyển noãn qua lame với một ít PBS – PVA, cho thêm dung dịch ethanol – acetic acid tỉ lệ 3:1 để noãn dính vào lame. Sau đó ngâm vào dung dịch trên trong 48 giờ. Điều này tránh cho noãn trôi ra ngoài lame. Số noãn trôi ra ngoài lame nếu ngâm lame vào dung dịch trên là 3 trong 5 noãn, nếu nhỏ vài giọt dung dịch vào lame trước khi ngâm là khoảng 1 trong 5 noãn. Trước khi đậy lamel, cho một ít chất carnoy vào bốn góc của lamel. Carnoy là chất có đặc tính đàn hồi, giúp noãn xẹp xuống dưới áp lực của lamel một cách từ từ, lamel không dính chặt vào lame ảnh hưởng tới noãn. Nhưng ở điều kiện phòng thí nghiệm không có chất carnoy nên chúng tôi thay thế bằng mỡ bò (dùng trong sửa xe), cũng có tác dụng đàn hồi. Khi hút hóa chất ra khỏi lame, dùng giấy thấm hút từ từ. Thêm hóa chất mới vào lame cũng thực hiện nhẹ nhàng. Trong quá trình nhuộm, không xê dịch lamel. Các thao tác nhuộm đều thực hiện dưới kính hiển vi và tránh noãn trôi ra ngoài lame. Nên thêm acetol vào lame sau khi đã hút hết dung dịch ethanol: acetic acid, vì nếu không sẽ có phản ứng làm bẩn lame, không thấy mẫu nhuộm được rõ. . thành công trên nang noãn lớn và 1 đợt thành công trên nang noãn nhỏ. Trên noãn nhỏ, được 4 noãn chín trong 54 noãn được nuôi, đạt tỉ lệ 7 %. Trên noãn lớn, 1 noãn chín trong 6 noãn được nuôi, đạt. giống chó săn thả, chúng tôi khảo sát trên giống chó ta. 34 4. 2.5. So sánh chất lƣợng noãn chó trong nang đơn noãn và nang đa noãn Bảng 4. 7: Phân loại chất lƣợng noãn chó trên nang. 33 4. 2.3. Đánh giá noãn chó theo đƣờng kính nang Thu nang noãn chó và phân làm hai lô theo đường kính nang noãn (< 2 mm và ≥ 2 mm). Thu hoạch noãn và đánh giá chất lượng noãn. Bảng 4. 6: