41 Bảng 4.2: Đặc điểm sinh hóa của các chủng L. sporogenes phân lập đƣợc từ chế phẩm Glucose + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Sucrose + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Fructose + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Mannito l + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Maltose + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Lactose + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Sorbitol + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Dextrin + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Catalase + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Di động + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Sinh hóa Chủng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 42 Qua Bảng 4.2, chúng tôi nhận thấy đặc điểm sinh hóa của các chủng phân lập phù hợp với tính chất sinh hóa của vi khuẩn L. sporogenes. 4.5. Khả năng sinh acid lactic 4.5.1. Định tính Từ 20 chủng L. sporogenes đã thử sinh hóa, chúng tôi tiếp tục tiến hành xác định khả năng sinh acid lactic của chúng. Kết quả ghi nhận đƣợc trình bày ở Bảng 4.3. Bảng 4.3 Khả năng sinh acid lactic của các chủng L. sporogenes đã thử sinh hóa Số chủng thử nghiệm Số chủng có khả năng sinh acid lactic 20 Số lƣợng Tỷ lệ (%) 20 100 Dựa vào Bảng 4.3, chúng tôi nhận thấy 20 chủng phân lập đƣợc đều có khả năng sinh acid lactic. Để đánh giá thêm về lƣợng acid lactic do L. sporogenes sản xuất, chúng tôi tiếp tục tiến hành thí nghiệm đo độ chua Therner và định lƣợng acid lactic. Hình 4.3: Phản ứng lên men một số loại đƣờng của vi khuẩn L. sporogenes 43 4.5.2. Định lƣợng Sau khi thực hiện nuôi cấy các chủng L. sporogenes phânlập đƣợc trong môi trƣờng sữa đặc có đƣờng, chúng tôi nhận thấy: tất cả 20 chủng đều có khả năng làm đông vón sữa. Từ giá trị độ chua thu nhận đƣợc, chúng tôi tính đƣợc lƣợng acid lactic do các chủng L. sporogenes sản xuất. Kết quả đƣợc trình bày trong Bảng 4.4. Bảng 4.4: Giá trị độ Therner và lƣợng acid lactic do vi khuẩn L. sporogenes sản xuất Chủng Thể tích NaOH 0.1N cần dùng (ml) Độ Therner (T) Số gam acid lactic trong 100ml dịch lên men (g/100ml) Hình 4.4: Thí nghiệm tạo acid lactic của vi khuẩn L. sporogenes Ghi chú: ĐC (-): 2,5ml nƣớc cất + 2,5 ml thuốc thử Uffelman ĐC (+): 2,5ml acid lactic 96% + 2,5 ml thuốc thử Uffelman Mẫu: 2,5ml dịch lên men (đã qua chiết tách) + 2,5 ml thuốc thử Uffelman 44 1 2,4 24 0,216 2 2 20 0,18 3 2,9 29 0,261 4 2 20 0,18 5 1,9 19 0,171 6 2 20 0,18 7 2 20 0,18 8 2,2 22 0,198 9 1,9 19 0,171 10 2,5 25 0,225 11 2 20 0,18 12 1,9 19 0,171 13 2,1 21 0,189 14 2 20 0,18 15 1,6 16 0,144 16 3 30 0,27 17 1,7 17 0,153 18 1,8 18 0,162 19 3,8 38 0,342 20 3,2 32 0,288 Qua bảng 4.4, chúng tôi nhận thấy độ Therner biến động từ 1,6 - 3,8 tƣơng ứng với lƣợng acid lactic do vi khuẩn L. sporogenes sinh ra là 0,144 - 0,342 g/100ml. Loài Lactobacillus khác nhƣ L. bulgaricus sản xuất đƣợc 0,684 g acid lactic/100 ml dịch sữa 10% đƣợc lên men ở 37 0 C/5 giờ [1]. Nhƣ vậy, 20 chủng vi khuẩn L. sporogenes chúng tôi đang khảo sát có khả năng sinh acid lactic nhƣng yếu hơn những loài Lactobacillus khác. Nguyên nhân của điều này có thể vì điều kiện nuôi cấy hay lên men chƣa phù hợp hay vì đặc tính di truyền của các chủng L. sporogenes đang khảo sát. Ngoài ra, chúng tôi không tìm thấy một tài liệu nào ghi nhận rõ ràng về lƣợng acid lactic mà vi khuẩn L. sporogenes sinh ra. 45 Trong 20 chủng khảo sát, chúng tôi nhận thấy 3 chủng 16, 19, 20 có khả năng sản xuất acid lactic mạnh nhất. Khả năng tạo acid lactic có ý nghĩa nhất định trong việc ứng dụng vi khuẩn L. sporogenes làm chế phẩm. Acid lactic giúp vi khuẩn L. sporogenes ức chế những vi khuẩn gây bệnh trong đƣờng ruột vật chủ và mang những lợi ích về mặt sinh lý cho vật chủ (xem mục 2.2.5.1. phần 2). Vì vậy, chúng tôi chọn 3 chủng 16, 19, 20 để tiếp tục khảo sát khả năng tạo bào tử, từ đó có thể khảo sát tiếp sự tồn tại của bào tử khi trộn vào chế phẩm. 4.6. Khảo sát khả năng hình thành bào tử Sau khi khảo sát trên 2 loại môi trƣờng, 2 điều kiện nhiệt độ - thời gian hình thành bào tử với 3 chủng khác nhau, chúng tôi thu nhận đƣợc số liệu về lƣợng bào tử trong mỗi nghiệm thức (xem Bảng 4.5) Bảng 4.5 Số lƣợng bào tử L. sporogenes thu đƣợc trong 12 nghiệm thức đƣợc khảo sát Điều kiện nhiệt độ - thời gian 37 0 C/6 ngày 50 0 C/2 giờ  70 0 C/2 giờ Môi trƣờng Chủng MRSA GYE MRSA GYE Bào tử /ml (N) LogN Bào tử /ml (N) LogN Bào tử /ml (N) LogN Bào tử /ml (N) LogN 16 X 1,43.10 11 11,14 1,48.10 11 11,16 1,6.10 11 11,20 1,82.10 11 11,23 SD 0,09 0,09 0,05 0,18 CV% 0,83 0,84 0,51 1,64 19 X 2,43.10 11 11,34 1,95.10 11 11,25 2,35.10 11 11,34 2,32.10 11 11,35 SD 0,23 0,21 0,18 0,10 CV% 0,28 1,89 1,58 0,92 20 X 1,74.10 11 11,22 1,99.10 11 11,28 1,93.10 11 11,27 2,13.10 11 11,31 SD 0,13 0,10 0,12 0,12 CV% 1,16 0,95 1,09 1,09 Chú ý: mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần Chúng tôi xử lý thống kê trên số liệu logarit (LogN) đƣợc chuyển đổi từ số bào tử thu đƣợc ở dạng số liệu nguyên (Bào tử/ml). Dựa vào bảng ANOVA (xem phụ lục 7.1), chúng tôi nhận thấy: mức độ ý nghĩa sự khác biệt giữa các chủng là 0,07; giữa các môi trƣờng nuôi cấy là 0,81; giữa các điều kiện nhiệt độ - thời gian là 0,32. Vậy, không có sự khác biệt về ảnh hƣởng của các chủng, các môi trƣờng nuôi cấy và những điều kiện thời 46 gian – nhiệt độ khác nhau lên khả năng hình thành bào tử vi khuẩn L. sporogenes (P>0,05). Tuy nhiên, trong bảng ghi nhận sự khác biệt giữa các chủng (xem phụ lục 7.2), chúng tôi nhận thấy chủng 19 có khả năng tạo bào tử nhiều hơn chủng 16. Sự khác biệt không đáng kể nên có thể quy cho sai số trong lƣợng sinh khối thu đƣợc lúc đầu. Ngoài ra, mức độ ý nghĩa về sự tƣơng tác giữa các yếu tố khảo sát đều lớn hơn 0,05 (xem phụ lục 7.1) nên có thể kết luận rằng không có sự tƣơng tác giữa các yếu tố này lên khả năng hình thành của bào tử. Từ kết quả trên, chúng nhận thấy rằng để sản xuất bào tử vi khuẩn L. sporogenes nhằm trộn vào chế phẩm, có thể sử dụng môi trƣờng GYE hay MRSA đều đƣợc. Tuy nhiên, môi trƣờng GYE có thành phần đơn giản và ít tốn chi phí hơn môi trƣờng MRSA. Ngoài ra, để tiết kiệm thời gian, ta nên sử dụng điều kiện nhiệt độ - thời gian hóa bào tử là 50 0 C/2 giờ rồi chuyển qua 70 0 C/2 giờ sau khi đã nuôi sinh khối ở 37 0 C/2 ngày thay vì nuôi cấy tạo bào tử ở 37 0 C/6 ngày. 47 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Chúng tôi phân lập đƣợc 20 chủng với những đặc điểm hình thái vi/đại thể và sinh hóa đặc trƣng của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes. Khả năng sinh acid lactic của 20 chủng đều thấp hơn những loài Lactobacillus khác. Môi trƣờng nuôi cấy (MRSA và GYE) và điều kiện nhiệt độ - thời gian hóa bào tử (37 0 C/6 ngày và 37 0 C/2 ngày → 50 0 C/2 giờ → 70 0 C/2 giờ) ảnh hƣởng không có ý nghĩa lên sự hình thành bào tử của các chủng L. sporogenes khảo sát. 5.2. Đề nghị Khảo sát thêm các loại môi trƣờng nuôi cấy, các mức nhiệt độ, pH, thời gian thích hợp cho L. sporogenes sinh acid lactic và tạo sinh khối tối ƣu. Khảo sát thêm môi trƣờng và thời gian bảo quản bào tử trong chế phẩm. 48 PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lý Thành Kiệt, 2002. Bước đầu nghiên cứu phân lập và nhân giống 2 chủng vi khuẩn Lactic Streptococcus thermophilus và Lactobacillus bulgaricus để cung cấp giống cho chế biến yogurt ở quy mô nhỏ. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ thực phẩm, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Lã Văn Kính, 1998. Những tiến bộ khoa học kỹ thuật trong công nghệ sản xuất thức ăn gia súc và vai trò của probiotic đối với động vật. Báo cáo khoa học, Trung tâm Thông tin khoa học và công nghệ, Sở khoa học công nghệ và môi trƣờng TPHCM, trang 1 – 9. 3. Lê Thị Tài, 1996. Kết quả thử nghiệm Biosubtyl trong điều trị loạn khuẩn đường ruột gia sức non. Tạp chí Nông nghiệp, Công nghệ thực phẩm. Trang 263 – 264. 4. Trần Thị Thu Thủy, 2003. Khảo sát tác dụng thay thế kháng sinh của Probiotics trong phòng ngừa tiêu chảy do E. coli trên heo con. Luận văn thạc sĩ, khoa Chăn nuôi – Thú y, trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, 85 trang. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 5. Amer, M.A. and Lammending, A.M., 1983. Health Maintenance benefits of cultured dairy products. Cultured Dairy Products J. 18 : 6-19. 6. Barefoot and Klaehammer, 1984. Purification and characterisation of Lactobacillus acidophillus bacteriocin lactacin B. Antimicrobiological agents chemotheraphy, 26 (3): 324 – 328. 7. Bernet et al., 1994. Lactobacillus acidophillus LA 1 binds to cultured human intestinal cells and inhibits cell attachment and cell invasion by enterovirulent bacteria, 35: 483 – 489. 8. Buchnan, R.E. & Gibbons, N.E. ed., 1974. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 577. 9. B. P. Dey and C. P. Lattuada, 1998. USDA/FSIS Microbiology Laboratory Guidebook. 3rd Edition. Volume 2. Pages 33 – 5 and 33 – 6. 10. Friend, B.A. and Shahani, K.M., 1984. Nutritional and therapeutic aspects of lactobacilli. J. Appl. Nutr. 36: 125-33. 49 11. Gandhi, A.B. and Nagarathnam, T., 1990. Probiotics for veterinary use. Poultry Guide, 27(3) : 43-47. 12. Gandhi, A.B., 1995. Personal communication. 13. Gandhi, A.B., 1998. Lactobacillus sporogenes, an advancement in Lactobacillus therapy. The Eastern Pharmacist, 41-43. 14. Gilliland, S.E. and Speck, M.L., 1977. Deconjugation of bile acids by intestinal lactobacilli. Appl. Environ. Microbiol. 33 :15. 15. Gould, G.W. and Hurst, A., 1969. The bacterial spore. Academic Press. 16. Gorbach, S.L., l990. Lactic acid bacteria and human health. Annals of Medicine 22:37-41. 17. Hepner et al., 1979. Hypercholesterolemic effect of yogurt and milk. Am.J. Clin. Nutr. 32:19-24. 18. Hosono et al., 1987. Antimutagenic activity of cellular component of Streptococcus faecalis IFO 12965. Netherlands Milk and Dairy Journal, 41: 239-45. 19. Johansson et al., 1993. Administration of different Lactobacillus strains in fermented oatmeal soup: in vivo colonisation of human intestinal mucosa and effect on the indigenous flora. Applied and Environmental Microbiology, 59: 15 – 20. 20. Kim Tae Han et al, 1989. development of L. sporogenes resistent to Rifampicin, an antituberculosis agent. Kor. Jour. Microbiol, p. 155 – 161. 21. Kim Y.M. et al., 1985. Studies on the production of beta - galactosidase by Lactobacillus sporogenes. Properties and applications of beta - galactosidase. Korean J. Applied Microbiol. Bioeng. 13(4) 355-360. 22. Kishida, T. Interferon and immune function. New Editions Health World. 23. Klaenhammer, T.R., 1988. Bacteriocins of lactic acid bacteria. Biochimie 70 : 337-349. 24. Macbeth,W.A.A.G. et al., 1965. Treatment of hepatic encephalopathy by alteration of intestinal flora with L. acidophilus, Lancet, i : 399-403. 25. Mohan, J.C et al., 1990. Preliminary observations on effect of L. sporogenes on serum lipid levels in hypercholesterolemic patients. Indian J. Med. Res. [B] 92, 431-432. 50 26. Mohan, J.C. et al., 1990. Short term hypolipedemic effects of oral L. sporogenes therapy in patients with primary dyslipidemias. Indian Heart J. 42(5) : 361-4. 27. Rani and Khetarpaul, 1998. Probiotic fermented food mixture: possible applications in clinial anti – diarrhoea usage. Nutrition Health, 12: 97 – 105. 28. Saarela et al, 2000. Probiotic bacteria: safety, functional and technology properties. Journal of Biotechnology, 84: 197 – 215. 29. Saxelim, 1997. Lactobacillus GG – a human probiotic strain with thorough clinical documentation. Food Review International 13 (2): 293 – 313. 30. Scott et al., 1990. Lactobacillus . The Pharmaceutical Journal Nov. 24 608-610. 31. Shahani, K.M. and Ayebo, A.D., 1980. Role of dietary lactobacilli in gastrointestinal microecology. Am. J. Clin. Nutr. 33,2448-2457. 32. Tannock, 1997. Probiotic properties of lactic acid bacteria: plenty of scope for fundamental R&D. Trends in Biotechnology 15 (7): 270 – 274. 33. Wood, B.J.B, 1992. The Lactic Acid Bacteria in Health and Disease, Vol. 1, p 394., Elsevier Applied Science. 34. Zamfir et al, 1999. Purification and charaterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophillus IBB. Journal of Applied Microbiology, 87 (6): 923 – 931. 35. www.lactospore.com/back2.htm 36. www.microbax.com/lactobacillus.htm 37. www.natura.org.uk/naturaflora.htm 38. www.pharmedmedicare.com/lactopure.html 39. static.highbeam.com/a/alternativemedicinereview/august012002/lactobacillussporo genesmonograph/index.html 40. Analysis of Lactospore® : Report from Sami Chemicals and Extracts, Bangalore, India, (1995). . 4. 4: Thí nghiệm tạo acid lactic của vi khuẩn L. sporogenes Ghi ch : ĐC (- ): 2,5ml nƣớc cất + 2 ,5 ml thuốc thử Uffelman ĐC (+ ): 2,5ml acid lactic 96% + 2 ,5 ml thuốc thử Uffelman Mẫu: 2,5ml. 20 chủng với những đặc điểm hình thái vi/ đại thể và sinh hóa đặc trƣng của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes. Khả năng sinh acid lactic của 20 chủng đều thấp hơn những loài Lactobacillus khác chất sinh hóa của vi khuẩn L. sporogenes. 4 .5. Khả năng sinh acid lactic 4 .5. 1. Định tính Từ 20 chủng L. sporogenes đã thử sinh hóa, chúng tôi tiếp tục tiến hành xác định khả năng sinh