51 PHỤ LỤC 1. Thành phần môi trƣờng 1.1. Môi trƣờng GYE agar (Glucose Yeast Extract) Cao nấm men 5.0g Peptone 5.0g D-glucose 5.0g K 2 HPO 4 0.5g KH 2 PO 4 0.5g MgSO 4 0.3g Bromocresol purple 1ml Khoáng vi lƣợng 1.0ml Nƣớc vô trùng 1000ml Agar 15g pH 6.3 0,2 Thành phần khoáng vi lƣợng NaCl 500mg FeSO 4 .7H 2 O 900mg MnSO 4 .5H 2 O 800mg ZnSO 4 .7H 2 O 80mg CuSO 4 .5H 2 O 80mg CoSO 4 .7H 2 O 80mg Nƣớc vô trùng 50ml Đun sôi môi trƣờng cho hòa tan Hấp khử trùng ở 115 0 C/30 phút 1.2. Môi trƣờng MRSA Cao thịt 8g Peptone 10g Cao nấm men 4g Glucose 10g Acetate Na 5g 52 K 2 HPO 4 2g Triamonium citrate 2g MgSO 4 0,2g MnSO 4 0,2g Tween 80 1ml Bromocresol purple 1ml CaCO 3 2g Agar 16g Nƣớc cất 1000ml Đun sôi môi trƣờng cho hòa tan Hấp khử trùng ở 115 0 C/30 phút 1.3. Môi trƣờng Nutrient broth (NB) Cao thịt 5g Peptone 10g NaCl 5g Nƣớc cất 1000ml pH 7,0 0,2 Hấp khử trùng ở 121 0 C/20 phút 1.4. Môi trƣờng lên men đƣờng Cao thịt 5g Peptone 10g NaCl 5g Đƣờng 10g Phenol red 0,01g Nƣớc cất 1000ml 1.5. Môi trƣờng thạch bán lỏng Nutrient broth 13g Agar 5g Nƣớc cất 1000ml pH 7,2 0,2 53 Đun sôi môi trƣờng cho hòa tan Hấp khử trùng ở 121 0 C/20 phút 2. Hóa chất 2.1. Nƣớc muối sinh lý NaCl 9% 0 NaCl 9g Nƣớc cất 1000ml 2.2. NaOH 0,1N NaOH 40g Nƣớc cất 1000ml Cân 40g NaOH tinh thể hòa vào 50ml nƣớc cất lắc đều, để yên 24h, gạn lấy nƣớc trong ở trên rồi bổ sung thêm nƣớc cất cho đủ 1000ml. 3. Thuốc nhuộm 3.1. Crystal violet (a) Crystal violet 0.4g cồn 96 0 10ml (b) phenol 1g nƣớc cất 100ml Trộn 2 dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đều rồi đem lọc. Thuốc nhuộm đƣợc bảo quản trong chai màu tối. 3.2. Fuchsine kiềm (a) Fuchsine kiềm 0,3g Ethanol 96 0 10ml (b) Phenol 5g Nƣớc cất 35ml Trộn 2 dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đều rồi đem lọc. Thuốc nhuộm phải đƣợc bảo quản trong chai màu tối. Trƣớc khi dùng, pha loãng 5 lần (dịch pha loãng không giữ đƣợc lâu còn dịch đậm đặc có thể giữ trong nhiều tháng). 3.3. Lugol KI 2g 54 Iod tinh thể 1g Nƣớc cất 300ml Hòa tan 2g KI vào 5ml nƣớc cất. Sau đó thêm 1g iod và chờ cho iod tan hết mới thêm nƣớc cho đủ 300ml. 3.4. Methylene blue (a) Methylene blue 1,5g Ethanol 96 0 10ml (b) Acid phenic 1g Nƣớc cất 100ml Trộn 2 dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho hòa tan. Bảo quản trong chai màu tối. 4. Thuốc thử và chỉ thị màu 4.1. Thuốc thử Ufellman Phenol 1% 10ml FeCl 3 1N 2 giọt 4.2. Thuốc chỉ thị Bromocresol purple (BCP) (a) Bromocresol purple 16g Ethanol 96 0 500ml (b) Nƣớc cất 500ml Pha dung dịch a trƣớc, sau đó trộn với b. Giữ hỗn hợp trong chai màu tối. 5. Phƣơng pháp nhuộm 5.1. Phƣơng pháp nhuộm Gram Cố định tiêu bản Đặt giấy lọc lên vết bôi Nhuộm crystal violet 1-2 phút Rửa nƣớc Cố định lugol 1 phút Rửa nƣớc Tẩy ethanol 90 0 15 giây Rửa nƣớc 55 Nhuộm fuchsine kiềm loãng 1phút rửa nƣớc Để khô Xem kính hiển vi ở vật kính 100X 5.2. Phƣơng pháp nhuộm bào tử Cố định tiêu bản Nhuộm HCl 1% Rửa nƣớc Đặt giấy lọc lên vết bôi Nhuộm fuchsine đậm đặc, hơ nhẹ trên đèn cồn trong 2-4 phút Rửa nƣớc Rửa cồn 90 0 15 giây Rửa nƣớc Nhuộm Methylene blue 1 phút Rửa nƣớc Để khô Xem kính hiển vi ở vật kính 100X 6. Phƣơng pháp thực hiện các phản ứng sinh hóa 6.1. Khả năng lên men đƣờng  Nguyên tắc Một số vi sinh vật sử dụng và lên men một số lọai đƣờng làm pH môi trƣờng giảm. Khi đó, chỉ thị màu phenol red từ màu đỏ chuyển sang màu vàng, có sinh hơi hay không sinh hơi tùy vào từng lọai vi khuẩn.  Chuẩn bị Môi trƣờng đƣờng: glucose, sucrose, fructose, maltose, mannitol, lactose, sorbitol, dextrin. Giống vi khuẩn: L. sporogenes Ống nghiệm, ống durham  Tiến hành 56 Phân môi trƣờng vào các ống nghiệm có ống durham, đem hấp vô trùng 115 0 C/20 phút để nguội, cấy vi khuẩn từ môi trƣờng tăng sinh vào, ủ ở 37 0 C/24h, đọc kết quả.  Kết quả Phản ứng (-): môi trƣờng đục và có màu đỏ cam Phản ứng (+): môi trƣờng đục và có màu vàng 6.2. Khả năng di động  Nguyên tắc Một số vi khuẩn có tiêm mao nên có khả năng di động trong môi trƣờng bán lỏng.  Chuẩn bị Môi trƣờng bán lỏng Que cấy thẳng Giống vi khuẩn L. sporogenes  Tiến hành Cấy vi khuẩn từ môi trƣờng tăng sinh sang môi trƣờng bán lỏng (cấy chích thẳng từ trên xuống dƣới), ủ 37 0 C/24h. Đọc kết quả.  Kết quả Phản ứng (-): vi khuẩn mọc theo đƣờng cấy Phản ứng (+): vi khuẩn mọc lan ra xung quanh 6.3. Phản ứng catalase  Nguyên tắc Một số vi khuẩn có khả năng sản xuất enzyme catalase phân giải H 2 O 2 thành H 2 O 2 và O 2  Chuẩn bị Môi trƣờng GYE thạch nghiêng Giống vi khuẩn L. sporogenes  Tiến hành Cấy ria vi khuẩn từ môi trƣờng tăng sinh lên môi trƣờng GYE thạch nghiêng, ủ 37 0 C/24h, nhỏ H 2 O 2 lên sinh khối. 57  Kết quả Phản ứng (-): không có hiện tƣợng nào xảy ra Phản ứng (+): có hiện tƣợng sủi bọt khi H 2 O 2 tiếp xúc sinh khối . màu vàng, có sinh hơi hay không sinh hơi tùy vào từng lọai vi khuẩn.  Chuẩn bị Môi trƣờng đƣờng: glucose, sucrose, fructose, maltose, mannitol, lactose, sorbitol, dextrin. Giống vi khuẩn: . thành H 2 O 2 và O 2  Chuẩn bị Môi trƣờng GYE thạch nghiêng Giống vi khuẩn L. sporogenes  Tiến hành Cấy ria vi khuẩn từ môi trƣờng tăng sinh lên môi trƣờng GYE thạch nghiêng, ủ 37 0 C/24h,. kết quả.  Kết quả Phản ứng (- ): vi khuẩn mọc theo đƣờng cấy Phản ứng (+ ): vi khuẩn mọc lan ra xung quanh 6. 3. Phản ứng catalase  Nguyên tắc Một số vi khuẩn có khả năng sản xuất enzyme