BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VÂN ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN VÂN ANH PGS. TSKH. NGUYỄN LÊ TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các Thầy Cô đã luôn tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi. - TS. Nguyễn Ngọc Hải và PGS. TSKH. Nguyễn Lê Trang đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - Các chị Nguyễn Thị Nguyệt Thu, Đỗ Thị Châm, Dƣơng Ngọc Diễm, Võ Thị Mỹ Duyên, Lạc Thị Thêm, Doãn Thị Sim thuộc phòng Miễn dịch viện Pasteur Tp. HCM đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực hiện khoá luận. - Thầy Lê Anh Phụng, cô Nguyễn Thị Kim Loan phụ trách phòng thí nghiệm Vi Sinh và các thầy cô thuộc Bệnh xá Thú y đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. - Toàn thể lớp CNSH27 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Chân thành cảm ơn. Tháng 08 năm 2005 Nguyễn Vân Anh iv TÓM TẮT NGUYỄN VÂN ANH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli” Hội đồng hƣớng dẫn: 1. TS. Nguyễn Ngọc Hải 2. PGS. TSKH. Nguyễn Lê Trang Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2/2005 đến tháng 8/2005 Địa điểm nghiên cứu:  Viện Pasteur Tp. HCM  Bệnh xá Thú y Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM  Phòng thí nghiệm Vi Sinh. Đánh giá chất lƣợng kháng huyết thanh thu đƣợc ở hai qui trình gây đáp ứng miễn dịch ngắn ngày và dài ngày. Đề tài thực hiện trên 2 lô thỏ thí nghiệm đƣợc gây miễn dịch theo hai qui trình khác nhau: qui trình ngắn ngày (35 ngày) và qui trình dài ngày (154 ngày). Kháng huyết thanh thu đƣợc từ hai qui trình tủa trong amonium sulfate bão hòa và có thể phục hồi bằng phƣơng pháp thẩm tích. Hiệu quả đáp ứng miễn dịch của hai qui trình đƣợc đánh giá qua phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính (định tính) và phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm (định lƣợng). Ngoài ra để tăng cƣờng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ngƣng kết kháng huyết thanh đƣợc xử lí gắn với Staphylococcus aureus và hấp phụ với kháng nguyên vi khuẩn K88 + . Kết quả đạt đƣợc: 1. Cả hai qui trình ngắn ngày và dài ngày đều gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ. 2. Phát hiện đƣợc kháng thể trong kháng huyết thanh sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. 3. Xác định đƣợc nồng độ S. aureus thích hợp để gắn với KHT nhằm tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. KHT đƣợc xử lí gắn với S. aureus (nồng độ 10 14 tế bào/ ml) và tỉ lệ thể tích KHT : S. aureus là 1:4. 4. Hiệu giá kháng thể ngƣng kết ở qui trình dài ngày cao hơn qui trình ngắn ngày. 5. Tách kháng thể ra khỏi kháng huyết thanh bằng cách tủa trong muối amonium sulfate bão hòa. 6. Hấp phụ các kháng thể không đặc hiệu trong kháng huyết thanh. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách các chữ viết tắt ix Danh sách các hình x Danh sách các bảng xi Danh sách các biểu đồ xii Danh sách các sơ đồ xiii 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1.2. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU 2 1.2.1. Mục đích 2 1.2.2. Yêu cầu 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH 3 2.1.1. Khái niệm miễn dịch 3 2.1.2. Kháng nguyên 3 2.1.2.1. Định nghĩa 3 2.1.2.2. Khái niệm về epitop 3 2.1.3. Kháng thể dịch thể 4 2.1.3.1. Định nghĩa 4 2.1.3.2. Cấu trúc của một phân tử immunoglobulin 4 2.1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của động vật 5 2.1.4.1. Loài động vật 5 2.1.4.2. Yếu tố di truyền 5 vi 2.1.4.3. Kháng nguyên 6 2.1.4.4. Qui trình gây miễn dịch 7 2.1.4.5. Chất bổ trợ 8 2.1.5. Cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể 9 2.1.5.1. Các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch dịch thể 9 2.1.5.2. Cơ chế hình thành đáp ứng miễn dịch dịch thể 11 2.2. VI KHUẨN E. coli 14 2.2.1. Định nghĩa 14 2.2.2. Đặc tính sinh hóa 14 2.2.3. Yếu tố kháng nguyên 14 2.2.3.1. Kháng nguyên thân O 14 2.2.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên vỏ K 15 2.2.3.3. Kháng nguyên lông roi H 15 2.3. TÁCH KHÁNG THỂ BẰNG AMMONIUM SULFATE 15 2.4. HỒI CHẾ KHÁNG THỂ BẰNG PHƢƠNG PHÁP THẨM TÍCH 16 2.5. PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ 17 2.5.1. Các lực liên kết kháng nguyên – kháng thể (KN-KT) 17 2.5.2. Các đặc tính chung của sự liên kết KN-KT 17 2.5.3. Phản ứng ngƣng kết KN-KT 18 2.5.3.1. Phản ứng ngƣng kết KN-KT xảy ra theo 2 pha 18 2.5.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng ngƣng kết KN-KT 19 2.6. PROTEIN A 19 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 21 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 21 3.1.1. Thời gian thực nghiệm 21 3.1.2. Địa điểm 21 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 21 3.3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 21 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.4.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ 22 3.4.1.1. Chuẩn bị dịch tiêm 22 3.4.1.2. Tiêm thú thí nghiệm 22 vii 3.4.1.3. Bố trí thí nghiệm 23 3.4.2. Thu nhận kháng huyết thanh 25 3.4.2.1. Tách kháng thể bằng amonium sulfate bão hoà 26 3.4.2.2. Phục hồi kháng thể 26 3.4.3. Xử lí kháng huyết thanh 27 3.4.3.1. Hấp phụ kháng thể không đặc hiệu 28 3.4.3.2. Gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus 29 3.4.4. Đánh giá 30 3.4.4.1. Định tính (bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính) 30 3.4.4.2. Định lƣợng (định hiệu giá bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm) 31 3.5. CHỈ TIÊU THEO DÕI 32 3.6. XỬ LÍ KẾT QUẢ 32 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1. KẾT QUẢ 33 4.1.1. Định tính 33 4.1.1.1. Qui trình ngắn ngày 33 4.1.1.2. Qui trình dài ngày 34 4.1.2. Định lƣợng 34 4.1.2.1. Qui trình ngắn ngày 35 4.1.2.2. Qui trình dài ngày 36 4.1.2.3. Hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch ở 2 qui trình 37 4.1.3. Xử lí tăng độ nhạy của kháng huyết thanh 38 4.1.3.1. Xác định nồng độ S. aureus thích hợp gắn với kháng huyết thanh . 38 4.1.3.2. Kiểm tra phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh xử lí gắn S. aureus 38 4.1.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh 40 4.2. THẢO LUẬN 42 4.2.1. Định tính 42 4.2.2. Định lƣợng 43 4.2.2.1. Qui trình ngắn ngày 43 4.2.2.2. Qui trình dài ngày 43 viii 4.2.3. Xử lí để tăng độ nhạy kháng huyết thanh 44 4.2.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh 44 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1. KẾT LUẬN 46 5.2. ĐỀ NGHỊ 46 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 7. PHỤ LỤC 49 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT APC Antigen-presenting cell (Tế bào trình diện kháng nguyên) E. coli Escherichia coli Ig Immunoglobulin (Globulin miễn) IL Interleukine KHT Kháng huyết thanh KN Kháng nguyên KT Kháng thể KN-KT Kháng nguyên – Kháng thể MHC II Major histocompatibility complex class II antigens (các kháng nguyên phù hợp tổ chức chính lớp II) S. aureus Staphylococcus aureus. SIg Surface immunoglobulin (Globulin miễn màng tế bào) TCR T cell receptor (Thụ quan bề mặt tế bào T) T H lympho T helper cell (tế bào lympho T hỗ trợ) . KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 20 01- 2005 Sinh vi n thực hiện: NGUYỄN VÂN. CHỮ VI T TẮT APC Antigen-presenting cell (Tế bào trình diện kháng nguyên) E. coli Escherichia coli Ig Immunoglobulin (Globulin miễn) IL Interleukine KHT Kháng huyết thanh KN Kháng. NGHỆ SINH HỌC  THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli Giáo vi n hƣớng dẫn: Sinh vi n thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN VÂN ANH