42 0 500 1000 1500 2000 mũi nhắc lại 3 mũi nhắc lại 4 thời điểm lấy máu hiệu giá KT Huyết thanh HT hấp phụ E68 Biểu đồ 4.6 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh đƣợc hoặc không đƣợc hấp phụ ở qui trình dài ngày 4.2. THẢO LUẬN 4.2.1. Định tính Khi tiêm kháng nguyên lần đầu thì khoảng 7 ngày sau kháng thể xuất hiện trong huyết thanh nhƣng ở hàm lƣợng thấp nên khó phát hiện đƣợc bằng phƣơng pháp thông thƣờng đặc biệt là phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính có độ nhạy rất thấp. Kháng thể chỉ đƣợc phát hiện bằng phƣơng pháp này khi nồng độ kháng thể lên đến đỉnh điểm (khoảng 12-15 ngày sau khi tiêm kháng nguyên). Ở qui trình ngắn ngày, kháng thể chỉ phát hiện đƣợc trong huyết thanh sau mũi nhắc lại lần 2 (sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày). 14 ngày là thời gian đủ để hàm lƣợng kháng thể trong máu lên cao nên có thể phát hiện bằng phản ứng ngƣng kết. Kháng thể vẫn tiếp tục tồn tại trong máu ở các mũi nhắc lại tiếp theo (khoảng cách giữa 2 mũi nhắc lại cách nhau 5 ngày). Trong KHT của lần lấy máu cuối cùng (15 ngày sau khi tiêm mũi nhắc lại cuối cùng) vẫn còn sự hiện diện của kháng thể. Ở qui trình dài ngày, kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với KHT sau khi tiêm mũi gây mẫn cảm và các mũi nhắc lại 1,2 không rõ ràng. Có thể kháng thể xuất hiện trong KHT sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày nhƣng do hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh còn thấp nên khó phát hiện đƣợc. Ở các mũi nhắc lại thứ 3 và thứ 4 thì phản ứng ngƣng kết cho kết quả rõ hơn. Có thể do tiêm nhắc lại cùng một loại kháng nguyên vào cơ thể giúp tăng cƣờng việc chọn lọc các dòng kháng thể có ái lực cao với kháng nguyên phát triển tạo ra các kháng thể có ái lực mạnh hơn và nhiều hơn. 43 Để tăng cƣờng khả năng đáp ứng miễn dịch, mũi gây mẫn cảm nên tiêm thêm vi khuẩn lao và vaccine ho gà vì hai loại kháng nguyên này kích thích sự tổng hợp một số cytokin cần thiết giúp kích thích miễn dịch mạnh hơn. Ngoài ra, sử dụng tá chất cũng làm tăng cƣờng khả năng đáp ứng miễn dịch. 4.2.2. Định lƣợng 4.2.2.1. Qui trình ngắn ngày Kháng thể phát hiện trong kháng huyết thanh sau mũi nhắc lần 2 (14 ngày sau khi tiêm mũi mẫn cảm). Do số lƣợng KHT thu đƣợc sau mũi nhắc lại lần 2, lần 3 quá ít không đủ để định lƣợng nên không thể xác định đƣợc hiệu giá kháng thể ngƣng kết sau mũi nhắc lại lần 2, lần 3 mà chỉ định lƣợng đƣợc KHT sau mũi nhắc lại lần 4 (tiêm lần cuối) ở các thời điểm khác nhau (5, 10, 15 ngày sau khi tiêm mũi nhắc lại cuối cùng). Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh giảm dần qua các lần lấy máu. Hiệu giá kháng thể ngƣng kết cao nhất ở đợt lấy máu lần 1 (5 ngày sau khi tiêm mũi nhắc lại cuối cùng) và thấp nhất ở đợt lấy máu lần 3 (15 ngày sau khi tiêm mũi nhắc lại cuối cùng). Đáp ứng miễn dịch giảm dần có thể do việc ngừng cung cấp kháng nguyên. Qui trình ngắn ngày không tạo đáp ứng miễn dịch đủ mạnh và kéo dài. Với cùng một liều tiêm, ở lần lấy máu thứ nhất, hiệu giá kháng thể ngƣng kết của thỏ 1 và thỏ 2 bằng nhau. Nhƣng ở lần lấy máu thứ 2, thứ 3 hiệu giá kháng thể ngƣng kết của thỏ 2 cao hơn thỏ 1 có lẽ do ở mỗi cá thể có sức đề kháng, trạng thái thể chất và thần kinh của cơ thể khác nhau nên khả năng đáp ứng miễn dịch cũng khác nhau. 4.2.2.2. Qui trình dài ngày Thông thƣờng hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh ở các mũi nhắc lại sau phải cao hơn mũi nhắc lại trƣớc nhƣng ta thấy hiệu giá kháng thể ngƣng kết của thỏ 3 ở các mũi nhắc lại lần 3 và lần 4 bằng nhau có thể do đáp ứng miễn dịch của thỏ 3 đã đạt đến ngƣỡng cao nhất nên không tăng lên nữa hoặc do thỏ bị bệnh nên sức để kháng giảm làm giảm đáp ứng miễn dịch, ngoài ra việc tiêm thuốc trị bệnh thỏ cũng ảnh hƣởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch. Ở mũi nhắc lại lần 3, hiệu giá kháng thể ngƣng kết thỏ 3 (liều tiêm mẫn cảm 1ml) cao hơn thỏ 4 (liều tiêm mẫn cảm 1,5 ml). Điều đó chứng tỏ liều tiêm 1 và 1,5 ml không ảnh hƣởng lớn đến đáp ứng miễn dịch mà phụ thuộc chủ yếu vào khả năng đáp ứng miễn dịch của từng cá thể . 44 Ở thỏ 4, hiệu giá kháng thể ngƣng kết ở mũi nhắc lại lần 4 cao hơn mũi nhắc lại lần 3 rất nhiều so với thỏ 3. Điều này cho thấy đặc điểm cá thể giữ vai trò nhất định trong đáp ứng miễn dịch với các yếu tố kháng nguyên xâm nhập. Ở cả hai qui trình ngắn ngày và dài ngày, hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh nguyên cao hơn hiệu giá kháng huyết thanh đã tủa với ammonium sulfate và thẩm tích. Điều này có thể do trong quá trình tủa và rửa tủa thì một số protein kháng thể bị biến tính hoặc bị trôi mất. So với qui trình ngắn ngày, qui trình dài ngày cho lƣợng kháng thể cao (tăng dần ở các lần lặp lại). Do đó nếu gây miễn dịch để thu kháng huyết thanh nên chọn qui trình dài ngày vì thu đƣợc lƣợng KHT nhiều hơn (có thể lặp lại đến mũi nhắc lại thứ 7) và kháng thể tạo ra có ái lực cao với kháng nguyên hơn. Tuy nhiên số thú thí nghiệm chƣa nhiều vì vậy việc lặp lại là cần thiết để có những kết luận chắc chắn hơn. 4.2.3. Xử lí để tăng độ nhạy kháng huyết thanh Phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính là phản ứng có độ nhạy rất thấp, chỉ phát hiện đƣợc kháng thể trong KHT ở nồng độ cao. Do đó để tăng độ nhạy nhằm xác định chính xác hơn sự hiện diện của kháng thể trong huyết thanh ta có thể cho kháng thể gắn với protein A của S. aureus. Protein A trên thành vi khuẩn S. aureus có khả năng gắn với IgG của thỏ rất tốt. Khi cho kháng thể đã gắn với protein A phản ứng với kháng nguyên thích hợp thì kháng thể cùng với S. aureus ngƣng kết với kháng nguyên do đó hạt ngƣng kết sẽ lớn hơn nhiều lần so với kháng thể không gắn protein A. Do đó việc gắn kháng thể với protein A của S. aureus sẽ làm tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết. Tuy vậy tỉ lệ kết hợp giữa kháng huyết thanh và S. aureus cũng tác động đến kết quả của phản ứng ngƣng kết. Thử nghiệm cho thấy tỉ lệ thích hợp giữa KHT và dịch vi khuẩn S. aureus trong nghiên cứu là 1:4 với nồng độ S. aureus là 10 14 tế bào/ ml. 4.2.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh Khi đƣa kháng nguyên vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể tạo ra kháng thể chống lại các quyết định kháng nguyên (các epitop). Nếu kháng nguyên có một quyết định KN thì cơ thể chỉ tạo ra một loại kháng thể đặc hiệu với quyết định KN đó. Nếu KN có nhiều quyết định KN khác nhau thì ứng với một quyết định KN thì cơ thể sẽ tạo ra một KT phù hợp. 45 Vi khuẩn E. coli là kháng nguyên gồm nhiều quyết định KN khác nhau, trong đó có một số quyết định KN giống nhau cho tất cả các chủng E. coli . Kháng thể tạo ra sẽ có một số kháng thể đặc hiệu cho tất cả các chủng E. coli do đó việc định tính kháng thể kháng một chủng E. coli nào đó sẽ không chính xác. Chủng O139:K82 (H28) và chủng K88 + (E68) đều thuộc nhóm E. coli gây bệnh trên heo nên chúng có một số yếu tố kháng nguyên giống nhau. Do đó khi dùng chủng E68 để hấp phụ huyết thanh sẽ loại đi kháng thể chung cho E68 và H28 nên trong huyết thanh chỉ còn lại các kháng thể đặc hiệu cho H28. Vì vậy việc thực hiện phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh đã hấp phụ E68 sẽ cho hiệu giá thấp hơn. 46 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN 1. Kháng thể ngƣng kết phát hiện đƣợc trong kháng huyết thanh sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày. 2. Hiệu lực gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên biến đổi tùy theo qui trình gây miễn dịch. 3. Khoảng cách giữa 2 lần tiêm nhắc kháng nguyên E. coli trên thỏ là 28 ngày tạo hiệu giá kháng thể ngƣng kết cao hơn so với khoảng cách giữa 2 lần tiêm nhắc là 5 ngày. 4. Để tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết trên phiến kính KHT có thể đƣợc xử lí gắn với S. aureus (nồng độ 10 14 tế bào/ ml) và tỉ lệ thể tích KHT : S. aureus là 1:4. 5. Xử lí kháng huyết thanh bằng cách kết tủa và thẩm tích làm giảm đáng kể hiệu giá kháng thể ngƣng kết của kháng huyết thanh. 5.2. ĐỀ NGHỊ 1. Với qui trình ngắn ngày cần định lƣợng KHT sau mũi nhắc lại thứ 2, thứ 3 để xác định thời điểm kháng thể trong KHT nhiều nhất. 2. Nên thử nghiệm sử dụng chất bổ trợ để tăng cƣờng khả năng đáp ứng miễn dịch của thỏ. 3. Lặp lại thí nghiệm với số lƣợng thú thí nghiệm lớn hơn để đánh giá chính xác hơn hiệu quả đáp ứng miễn dịch ở hai qui trình trên. 47 PHẦN 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần tiếng việt 1. Nguyễn Ngọc Hải, 1999. Phân lập vi khuẩn E. coli gây bệnh phù trên heo sau cai sữa và khảo sát khả năng nhạy cảm của chúng đối với một số kháng sinh. Luận án Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Lê Văn Hùng, 2002. Giáo trình miễn dịch học thú y. NXB Nông Nghiệp, TP.HCM. 191 trang. 3. Đỗ Ngọc Liên, 2004. Miễn dịch học cơ sở. NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội. tr 3-119. 4. Đỗ Ngọc Liên, Thực hành hóa sinh miễn dịch. NXB Đại học Quốc gia Hà Nội. 5. Nguyễn Nhƣ Thanh, 1996. Miễn dịch học. NXB Nông Nghiệp Hà Nội. 6. Bộ môn miễn dịch - sinh lí bệnh trƣờng đại học Y Hà Nội, 1997. Miễn dịch học. NXB Y học Hà Nội. Phần tiếng Anh 7. Cooper G. Terrance, 1977. The Tools of Biochemistry. John Wiley & Sons, New York, USA. p 257-277, 355-405. 8. Dress W. D. Immunization of experimental animals. Applications of Immunological Methods in Biomedical Sciences, Volume 1 (Edited by D. M. Weir, Co-editors L. A. Herzenberg, Caroline black well, Leonone A. Herzenberg). Black well Scientific Publications. p 8.1-8.18. 9. Gross J. R. and Rowe B., 1985. Serotyping of Escherichia coli. The Virulence of Escherichia coli (M. Sussman). Academic Press, London, England. p 345- 356. 10. Harlow Ed and Lane David, 1988. Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. p 92-137, 286-299. 11. Mahler R. Henry and Cordes H. Eugene, 1967. Biological chemistry. Harper & Row, New YorK, USA. p 63-69 12. Sojka J. W., M.R.C.V.S, 1965. Escherichia coli in domestic animals and poultry. Commonwealth Agricultural Bureaux Farham Royal, Bucks, England. p 205-212. 48 13. Tizar Ian R., 1992. Immunology: an introduction, Third Edition. Sauders College Publishing, New York, USA. p 13-25, 112-128, 167-189, 219-236. Internet http://www.bio.mtu.edu/campbell/bl482/lectures/lec5/482w52.htm http://www.uccs.edu/~rmelamed/MicroFall2002/Chapter%2017/Antibody%20Ti me%20Course.jpg http://www.accessexcellence.org/ RC/VL/GG/antiBD_mol.html http://www.cvm.uiuc.edu/courses/vp331/Staphylococci/proteinA.gif 49 PHẦN 7 PHỤ LỤC Thành phần môi trƣờng TSB (Tryptone Soya Broth) tổng hợp: Casein enzymic hydrolysate 17 g/l Popaic digest of soyabean meal 3 g/l Sodium chloride 2,5 g/l Dipotassium phosphate 2,5 g/l Dextrose 2,5 g/l pH = 7,3 ± 0,2 (ở 25 o C) Pha chế: cân 30g bột TSB hòa trong 1l nƣớc cất, đun sôi cho tan sau đó đem hấp khử trùng 121 o C trong 15 phút. Nếu pha môi trƣờng TSA thì bổ sung thêm 17,5g agar. Thành phần đệm PBS 10X NaCl 84,74g NaH 2 PO 4 .2H 2 O 10,14g Na 2 HPO 4 .12H 2 O 51,93g NaN 3 5g Pha đệm: cân tất cả thành phần trên hòa tan trong nƣớc cất để đƣợc 1l dung dịch đệm PBS 10X Pha PBS 1X: 100 ml đệm PBS 10X + 900 ml nƣớc cất  1000 ml PBS 1X Pha amonium sulfate bão hòa 100%S: cân 767g (NH 4 ) 2 SO 4 hòa trong 1l nƣớc cất. Hỗn hợp đƣợc khuấy từ có đun nóng cho tan hết muối, bảo quản ở nhiệt độ phòng. Pha amonium sulfate bão hòa 45%S: 450 ml (NH 4 ) 2 SO 4 100%S + 550 ml PBS 1X  1000 ml (NH 4 ) 2 SO 4 45%S 50 Hình 7.1 Thỏ nuôi thí nghiệm Hình 7.2 Lấy máu tĩnh mạch tai Hình 7.3 Tiêm dƣới da . Immunological Methods in Biomedical Sciences, Volume 1 (Edited by D. M. Weir, Co-editors L. A. Herzenberg, Caroline black well, Leonone A. Herzenberg). Black well Scientific Publications. p 8.1-8.18 Rowe B., 1985. Serotyping of Escherichia coli. The Virulence of Escherichia coli (M. Sussman). Academic Press, London, England. p 345- 356. 10. Harlow Ed and Lane David, 1988. Antibodies:. 1 67- 189, 219-236. Internet http://www.bio.mtu.edu/campbell/bl482/lectures/lec5/482w52.htm http://www.uccs.edu/~rmelamed/MicroFall2002/Chapter%20 17/ Antibody%20Ti me%20Course.jpg http://www.accessexcellence.org/